ISSN 1517-8595 1 PRODUÇÃO E ESTUDO DO POTENCIAL DE HIDRÓLISE DE UMA NOVA FONTE DE ENZIMAS AMILOLÍTCAS A PARTIR DO MALTE DE MILHO (Zea ays) Alex Ferreira Evangelista 1, Joana Paula Menezes Biazus 1, José Carlos Curvelo Santana, Elizabete Jordão 3, Roberto Rodrigues de Souza 4 RESUMO O alte de cevada é u produto bastante utilizado pelas indústrias alientícias, poré seu custo é relativaente elevado quando coparado co o alte de ilho. Coo o alte de ilho possui u potencial enziático relativaente enor que o de cevada, a concentração das enzias deste alte tornaria este produto ais viável que na fora in natura. Assi, este trabalho objetivou a obtenção de u derivado do alte de ilho obtido por extração líquidolíquido e sistea bifásico aquoso PEG/CaCl e coparar seu potencial enziático co o alte de ilho. Os dados de tepo (t) e de atividade enziática (AE) resultara nua curva e fora de pico, onde a áxia atividade das seentes foi observada no quarto dia de gerinação e a atividade enziática apresentou ua dependência exponencial co tepo, análogo ao cresciento de icrorganisos. Estas enzias ao sere recuperadas e PEG 4000, tornara-se ais ativas que no alte de ilho, ostrando que o PEG é u eio que alé de conservar, ativa as enzias. Desta fora conseguiu-se gerar ua nova fora de coercialização das enzias ailolíticas de alte de ilho. Palavras chaves: Zea ays L., fonte de ailases, ailases e PEG, cinética enziática. PRODUCTION AND STUDY OF THE HYDROLYSE POWER OF A NEW AMYLASES SOURCE BY MAIZE (Zea ays) MALT ABSTRACT The barley alt is a product very utilized by food industries, but its cost is relatively elevated when it s coparated to aize (Zea ays) alt. As this alt has a saller enzyatic activity than barley alt, the enzyes concentration of aize alt could becoe this product ore viable than its in nature for. Thus, this wor aied to obtain a aize alt derivate through liquid-liquid extraction in aqueous two-phase syste PEG/ CaCl and to copare its enzyatic potential with aize alt. The data of the tie (t) and enzyatic activity (EA) were shown as a curve in top for and EA presented on dependence with t, it was analogy to icroorganis s growth. These recovering enzyes in PEG 4000 becae ore active that in the aize alt for. It showed that PEG is the best ean for preserving and activing its enzyes. Thus, we obtained a new coercial source of aylases enzyes fro aize alt. Keywords: Zea ays L., aylases source, aylases in PEG, enzyes inetic. Protocolo 70 de 8 de abril de 003 1 Graduandos e Engenharia Quíica, DEQ/ CCET/ UFS. 1 Doutorando e Engenharia Quíica, DESQ/ FEQ/ UNICAMP. curvelo@desq.feq.unicap.br. 1 Prof. Drª do Departaento de Engenharia e Sisteas Quíicos, FEQ/UNICAMP, Cid. Univ. Zeferino Vaz, Av. Albert Eistein, s/n, Barão Geraldo, Capinas SP, Caixa Postal: 6066, CEP: 13081-970, Tel: 0xx13 3788 3900. 1 Prof. Dr do Departaento de Engenharia Quíica, CCET/UFS. Cid. Univ. Prof. José Aloísio de Capos, Av. Marechal Rondon, s/n, Rosa Elze, São Cristóvão SE, CEP: 49480 000, Tel: 0xx79 16687e-ail: rrsouza@ufs.br.
INTRODUÇÃO Sisteas bifásicos aquosos A bioseparação é u rao da bioengenharia que, nos últios tepos, ve sendo uito estudada, co o intuito de apriorar técnicas ais eficientes e ais econôicas, e larga escala ( scale-up ), alcançando u elevado grau de pureza e recuperação da bioolécula, antendo sua atividade. A ais eficiente destas técnicas é a croatografia e fase líquida. Contudo, esta, ebora produza u aterial de alto grau de pureza e co boa atividade, seu rendiento é baixo e o custo do produto é elevado. Ua das técnicas que possue bo rendiento na separação de bioolécula se interferir e sua atividade, co boa viabilidade econôica, é a partição e sisteas bifásicos aquosos (SBA) (Diaond & Hsu, 199). Os sisteas bifásicos aquosos ais utilizados, atualente, são os sisteas poliero/políero, ais couente representados pelo polietileno glicol (PEG)/Dextrana e os sisteas políero/ sal, representados na aioria dos estudos por PEG/fosfato de potássio. Estes sisteas fora descobertos por Per - Åa Albertsson e 1955 e, desde esta data, os sisteas bifásicos são estudados e utilizados na recuperação e/ou purificação de diversas substâncias, principalente, de biooléculas (Albertsson, 1986). Os SBA s políero/políero, ou políero/sal são uito utilizados na recuperação de biooléculas por oferece abientes físico-quíicos apropriados para as biooléculas, apresentando baixas diferenças de potencial, tensão superficial e torno de 10-7 N/c, que conté 80% a 90% e peso de água e suas fases (Diaond & Hsu, 199). Nas últias décadas, te-se pesquisado novos sisteas bifásicos que perita ua elhora na recuperação de biooléculas específicas, coo foi o caso de Santana (003), que epregou u SBA obtido, a partir do polietileno glicol (PEG) e do sal CaCl, na recuperação de ailases de alte de ilho. Os resultados ostrara que no ph 5,0 e na linha de aarração ais concentrada (3ª, neste estudo) este sistea foi seis vezes ais eficiente que os utilizados por alguns autores; quando estes recuperara as esas enzias de A. Niger e sistea PEG/ sais de fosfato e PEG/ Dextrana. Enzias ailolíticas Desde o início do século, o estudo da viabilidade de aplicação das enzias e processos biotecnológicos te tido u grande destaque e nível Mundial. Dentre estas enzias, podeos destacar coo as ais iportantes para a biotecnologia; até o oento, as enzias e ailases. O uso fundaental das ailases está na hidrólise do aido, principalente, na indústria de panificação; no pré-coziento de cereais, nas indústrias de ferentação, para a produção de álcool e bebidas alcoólica; na fabricação de xaropes de glicose, via hidrólise pelas ailases; no preparo de goas de dextrinas, usadas para acabaento de papéis e tecidos, dentre outros. A enzia co código e noe sisteático EC 3..1.1; -1,4 glicano 4-glicanohidroxilase, respectivaente, é couente conhecida coo -ailase. Esta é ua grande enzia extracelular que hidrolisa, aleatóriaente, e várias ligações -1,4 não terinais de olécula de ailose, ailopectina, glicogênio e dextrinas, não atua sobre as ligações -1-6. Os produtos finais da hidrólise são 70 a 90%, de altose, oligossacarídeos e dextrinas, a aioria co quatro a oito unidades de glicose, alé de pequenas quantidades de D-glicose. A -ailase, tabé, é chaada de enzia dextrinizante e de liquefação e encontra-se nos tecidos e diversos eios: saliva, pâncreas, cereais, bactérias, fungos. Sua resistência à desnaturação térica, a qual inativa a enzia, difere confore sua orige ou biossíntese. Alguas ailases bacterianas, de Bacillus subtilis, B. coagulans, B. licheniforis e B. stearotherophilus, tê teperatura ótia entre 70 C a 80 C de teperatura (alguas são ativas até acia de 100 C), isto devido à presença de u íon Ca + e sua estrutura olecular, co ph ótio entre 5,5 a 7,0 e peso olecular variando entre 10 Da a 0 Da (Wisean, 1987; Dixon & Webb, 1967). A enzia co código e noe sisteático EC.3..1.1, -1,4 glicano-altohidrolase, respectivaente, é couente conhecida coo -ailase. Esta é ua enzia extracelular, largaente encontrada e grãos de vegetais, degradando a ailopectina e glicogênio, hidrolisando cada segunda ligação -1,4, as, sepre, a partir dos terinais não redutores das cadeias. A aioria dos seus produtos é quase sepre -altose, são inibidas por reagentes sulfidricos, não atua e ligações -1,6 e desta fora, a hidrólise total da ailopectina não
pode ser realizada por elas. Estas enzias possue teperatura ótia por volta do 55 C, ph ótio entre 6,5 a 7,0 e assa olar de, aproxiadaente, 50 Da (Wisean, 1987; Dixon & Webb, 1967). Cinética enziática É o estudo do cainho ais provável para se definir a equação da taxa da reação de u sistea reacional catalisado por enzias. Para que seja possível a copreensão deste estudo considera-se o caso ais siples onde o substrato (S) é transforado no produto (P) e ua reação catalisada por ua enzia (E). Co as condições experientais do eio reacional e estudo pré definidas (pressão, teperatura, ph, concentrações inicial de substrato e de enzias, etc). Supondo-se que seja possível edir a concentração do substrato (ou do produto) co o decorrer do tepo, a partir do instante e que esta teve início. Estas edidas perite configurar ua curva do tipo que se encontra na Figura 1, a qual traduz a variação da velocidade de reação co o consuo de substrato (foração do produto) co o tepo. Na realidade o único instante e que se conhece co certeza a concentração do substrato é o tepo inicial, por isto as velocidades de reações enziáticas são calculadas nos instantes iniciais. Figura 1 Curva de desenvolviento cinético de u sistea reacional enziático. É cou indicar a velocidade inicial (V 0 ), nuericaente igual à tangente à curva de foração do produto co o tepo (Halpern, 1997; Peter et al.; 1987). Os prieiros estudos coprovara que a velocidade de reação enziática é proporcional à concentração de enzias (V 0 [E]) e que esta velocidade possui ua dependência hiperbólica co a concentração do substrato. Para baixas concentrações de substrato, a velocidade é, aproxiadaente, proporcional à sua concentração (o que indica ua reação de prieira orde e relação ao substrato), poré para altas concentrações do substrato, a velocidade tende para u valor assintótico, designado pela velocidade áxia (V ax ), onde V 0 é tido coo constante e relação à concentração do substrato (reação de orde zero) (Friedan, 1994; Peter, et al., 1987). No início do século XX, trabalhos realizados por Henri e posteriorente por Leonor Michaelis e Maud Menten levara à forulação da Teoria do Mecaniso de Reação Enziática ais conhecida até o presente oento; a qual segue os seguintes passos: E reação rápida, enzia e substrato fora o coplexo denoinado de enzia substrato (ES). E reação lenta, o coplexo enziasubstrato fora o produto e liberta a enzia. E S Esta reação é representada pela Figura. 1 1 ES E P Figura Esquea de ua reação enziática global, siples. Onde: 1, -1 e são constantes cinéticas. Coo notação foi aditida [E], [S] e [ES], coo as respectivas concentrações de E, de S e de ES. Ao aditir-se que o sistea reacional esteja e equilíbrio, pode-se definir Ks, coo sendo a constante de dissociação do coplexo ES, dada por: [ E][ S] K 1 s ES (1) 1 Esta suposição é conhecida coo hipótese de equilíbrio e só é válida quando -1 >>>, ou seja, não foi levada e consideração a coplexação da enzia co o produto para retornar ao coplexo enzia substrato (E + P e ES) para deterinação da velocidade inicial (V 0 ), já que [P] = 0 (Voet & Voet, 1995). E 195, Briggs e Haldane propusera ua hipótese de equilíbrio rápido, onde as constantes -1 e -1 são aproxiadaente iguais. Estes cientistas verificara que se fazendo edidas e pequenos intervalos de tepo, onde a variação da concentração do coplexo 3
4 ES é tão pequena que pode ser considerada constante; desta aneira eles conseguira observar u estado estacionário (ou pseudoestacionário) para ES. No entanto, para que isto ocorra, é necessário que a concentração do substrato seja uito superior à de enzias, o que acontece na aioria dos sisteas in vitro. Desta fora, de acordo co a definição de velocidade de reação, te-se (Friedan, 1994; Halpern, 1997; Voet & Voet, 1995): P d ES () dt V0 Coo é difícil edir [ES], logo esta grandeza deve ser substituída. Para isto, considera-se a hipótese de estado estacionário e iguala-se as duas equações de velocidade (de foração e decoposição do coplexo ES), coo descrito abaixo (Peter et al., 1987; Voet & Voet, 1995): 1[ E][ S] 1[ ES] [ ES] (3) Coo no eio reacional a enzia se encontra na fora livre (E) e na fora coplexada (ES), logo a concentração de enzias total (E 0 ) pode escrita coo: [ E] 0 [ E] [ ES] (4.a) ou E] [ E] [ ] (4.b) [ 0 ES E assi por substituição da equação 4.b na equação 3, obté-se: e [ ES] 1 E S 1 0 [ S] (5) Fazendo-se as seguintes considerações: V áx [E (6) ] 0 1 K (7) 1 Obte-se assi, a equação de Michaelis Menten, dada por: V 0 V K [ S] áx (8) [ S] Na Equação 8, V ax é a velocidade áxia da reação e K é a constante de Michaelis Menten. Quando ocorre u estado de equilíbrio rápido ( -1 >> ), constata-se que a constante de Michaelis-Menten se aproxia da constante de dissociação do coplexo enziasubstrato (Halpern, 1997; Peter et al., 1987; Voet & Voet, 1995): K 1 K s 1 (9) A Equação 8 tabé coprova a variação hiperbólica de V 0 co [S]. U estudo de dois casos é abaixo relatado, os quais apresenta liites de concentração de substrato. i) Para baixas concentrações de substrato ([S] << K ); pode-se adotar ua fora siplificada da Equação 8, dada por: V V K [ S] 0 (10) ii) Para altas concentrações de substrato ([S] >> K ); a Equação 8 toa a fora da Equação 6, já que V 0 V ax, o que esta de acordo co as observações já encionadas para os extreos cinéticos de orde zero e orde u, e relação ao substrato [S] (Halpern, 1997; Peter et al., 1987; Voet & Voet, 1995). Para que seja entendido o significado de V ax e K, são feitas as seguintes igualdades: V0 [ ES] [ E] 0V áx (11) Esta equação indica que a velocidade áxia ocorre quando todas as enzias estão na fora coplexada, ES, ou seja, todas as enzias estão saturadas de substrato. No entanto se [S] = K e for substituído na Equação 8, te-se: V áx V0 (1) Por eio desta expressão pode-se concluir que o K corresponde à concentração do substrato onde se observa que a reação
alcançou u valor édio da velocidade áxia e a concentração de enzias está 50% saturada. Outros ecanisos pode ser obtidos, coo o que considera tabé o coplexo enzia-produto (EP), os que insere as influências do ph, de inibidores, etc; as todos são deduzidos, levando-se e consideração as hipótese de Michaelis-Menten. Método para deterinação da velocidade áxia e a constante de Michaelis-Menten Coo a representação gráfica da Equação 8 é hiperbólica, o valor de V vax não pode ser obtido exataente, pois este se torna assintótico. Contudo, ao se linearizar a expressão de Michaelis-Menten e função de 1/V 0 e 1/[S], chega-se a: 1 V 1 K 1 (13) V V [ ] 0 áx áx S Esta expressão é chaada de equação de Lineweaver-Bur, que é ua relação linear onde 1/V ax é o seu coeficiente linear e K / V ax é o seu coeficiente angular. Ao tocar no eixo das abscissas, esta reta fornece o valor 1/K (recíproco negativo da constante de Michaelis- Menten), coo se observa na Figura 3, que é ua representação esqueática da linearização desta equação (Friedan, 1994; Halpern, 1997; Morris, 1979; Peter, et al., 1987; Voet & Voet, 1995). caada protetora (casca), aleurona, endospera e o ebrião. Este últio é coposto pelo cotilédone, o epicótilo (que origina o broto) e a radícula (que se origina a raiz). Na Figura 4, encontra-se ua representação esqueática da gerinação de ua onocotiledonea que ocorre, quando o cresciento da radícula rope o teguento da seente e aparece coo ua raiz jove. A energia para a gerinação da seente ve da respiração e do açúcar do endospera. Contudo, o ebrião e o aido estão separados u do outro, ou seja, para que a seente gerine deve haver ação de forças externas para ativar suas funções fisiológicas. Naturalente, há ua pequena atividade biológica nas seentes, devido à presença das enzias -ailase que degrada o aido para produzir a altose e fornecer energia para anter a atividade biológica, nas células da seente. A água, entrando na seente e no ebrião, dissolve ua substância produzida no interior do ebrião. Esta substância é conhecida coo ácido giberélico (AG). Este é u horônio vegetal não uito diferente dos esteróides. O AG dissolvido é transportado co a água pelo restante dos tecidos da seente, até chegar à caada de aleurona. O AG entra no citoplasa dessas células, "ativando" certos genes do DNA nuclear. O DNA é, naturalente, a olécula hereditária e conté as instruções para fazer todas as proteínas necessárias para a sobrevivência da planta. O ecaniso preciso sobre coo o AG "ativa" o DNA é ainda desconhecido. É claro, contudo, que o odo de ação é ligar apenas alguns genes específicos do DNA (Borzani et al., 1986; Santana, 003). 5 Figura 3 Linearização dos dados cinéticos ou étodo de Lineweaver-Bur (Morris, 1979). Gerinação das seentes de ilho O ilho (Zea ays) te u ono cotilédone, e sua seente está dividida e Figura 4 Esquea da síntese da enzia - ailase, e ua seente onocotiledonea Os genes que são "ligados" são transcritos. A inforação arquivada e DNA é preciosa, de odo que as células de aleurona
6 faze ua cópia "descartável" e RNA do gene a que está ligado. Está cópia, coo u tipo de projeto, é chaada de RNA ensageiro. O processo de fazer esta cópia é chaado transcrição. O RNA que foi feito no processo de transcrição é transportado até o citoplasa das células de aleurona. No citoplasa, o RNA ensageiro se junta ao ribossoo para coeçar o processo de produção de ua proteína. Este processo é denoinado síntese protéica ou tradução. Neste processo o ribossoo exaina a inforação antida na seqüência de bases do RNA. RNAs transportadores carregados co ainoácidos específicos são colocados nas posições especificadas nas instruções do RNA ensageiro e os ainoácidos são agrupados na seqüência certa pelo ribossoo. A seqüência de ainoácidos deterina as propriedades da proteína que está sendo ontada. Neste caso, a proteína crítica feita co a inforação antida no RNA é a -ailase. Esta proteína resulta e ua enzia de eso noe que te grande iportância para a indústria de alientos (Santana, 003). Maltage A altage é a técnica de preparo do alte, e consta de operações coo a aceração, a gerinação e a secage. O processo altera os grãos e esta alteração afeta a coposição deles, e estes difere confore o tipo de alte a ser obtido, podendo ser utilizado nas cervejarias e ou destilarias. Se for destinado para ser utilizado e cervejarias, que é o caso ais cou para as seentes de cevada, os grãos deve ser densos, co endospera acio e friável, sua aceração será entre 43% a 46% de uidade, após a gerinação são secos a 4% de uidade e teperaturas variando de 70 C a 100 C, o que torna o alte ais escuro, reduz sua atividade enziática, dá a cerveja ua coloração ais escura, sabor e aroa ais encorpado (Borzani et al., 1986). No caso do alte para destilaria, são usados grãos enores, co teor protéico ais elevado, sendo acerados na faixa de 45% a 49% de uidade, seca depois de gerinados, de 5% a 7% de uidade, e teperaturas, variando entre 50 C a 60 C, gerando u alte de aior potencial enziático e ais claro. Suas etapas basicaente são: Lipeza e classificação das seentes, que, geralente, são feitas, usando-se peneiras, ventiladores ou eletroiãs, isolados ou e conjunto. Depois é feita a aceração, que nada ais é que elevar o teor de uidade na seente até níveis próxios de 45% de uidade, condição necessária à gerinação. O tepo de gerinação depende da velocidade co que as enzias hidrolíticas atua. Segundo Borzani et al. (1986), para que as seentes de cevada atinja o áxio de atividade enziática, estas deve apresentar o broto co 1 a vezes o seu taanho. A secage destas seentes (agora alte) é necessária para auentar a conservação do alte por u aior tepo. A teperatura epregada não deve exceder as teperaturas ótias das enzias para evitar a inativação delas. O alte é u produto uito utilizado nas indústrias cervejeiras, e e outras indústrias que trabalha co processos ferentativos a partir do alte, sendo as seentes de cevada as ais utilizadas, pelo seu alto poder enziático. Contudo estas seentes não são uito cultivadas e nosso país, necessitando a sua iportação e, elevando o custo na obtenção do produto. Já as seentes de ilho, para produzir alte, pode ser ua alternativa viável, ua vez que esta cultura é bastante difundida no Brasil, o que torna o custo na obtenção do alte enor se coparado co o da cevada, poré é difícil encontrar relatos de estudos da sua atividade enziática co relação ao tepo de gerinação, que dê suporte a interrupção do processo, pelo altador. A literatura, apenas, faz enção do aior poder enziático das seentes de cevada (potencial tido coo 100) que as de ilho (tido coo 8). Co u estudo das elhores condições de gerinação para que se obtenha a áxia atividade enziática no alte e ua posterior concentração destas enzias e PEG 4000, pode-se obter u produto co aior potencial enziático e, assi, poder oferecer ao ercado u novo de alte de ilho co alto potencial de hidrólise de aido. Portanto, o presente trabalho teve coo objetivo a obtenção de u derivado do alte de ilho obtido por extração líquido-líquido e sistea bifásico aquoso PEG/CaCl e coparar seu potencial enziático co o alte de ilho. MATERIAIS E MÉTODOS Maceração das Seentes Seentes selecionadas provenientes da EMBRAPA-SE fora lipas co água destilada, para eliinar ácidos voláteis e outras substâncias retidas na superfície dos grãos, depois se uedecera as seentes, até que elas
atingisse u teor de água entre 40 a 45%, trocando-se a água a cada ua hora. O tepo de duração deste processo foi e torno de 1 a 14 horas, sendo observada a áxia absorção relativa de uidade pelas seentes, durante a lavage e nas prieiras 4 horas (Borzani, 1986; Reguly, 1996; Santana, 003). Gerinação Foi feita e bancada de laboratório, onde as seentes úidas fora distribuídas sobre ua superfície artificial. As seentes fora, sepre, uedecidas co borrifadores de água destilada, a superfície era coposta de folhas de papel filtro (taanho A4) e estas sobre caadas de algodão, para reter o áxio possível de uidade na superfície, evitando, assi, que as seentes perdesse uidade. A gerinação era interropida entre 8º e o 10º dia, quando se observava o apareciento de folíolos nos brotos (Borzani et. al., 1986; Santana, 003). Aostrage As aostras fora coletadas, diariaente, e u eso horário, sendo depois oídas e oinho de parafuso e ua pequena assa variando entre 1,0 g a,0g dela foi solubilizada a 50 L e solução de NaCl e CaCl a 3 e g/l, respectivaente, (Santana, 003). Deterinação da atividade enziática da - ailase nas seentes Foi feita pelo Método de Wohlgenuth, odificado por Sandstedt, Kneen, Blish, o qual se baseia na dextrinização de certa assa de aido solúvel que, sob influência de u excesso de -ailase, pela -ailase e ua hora, sendo sua unidade usual dada e SKB (Reguly, 1996). Co base neste étodo fora utilizados volues variados das aostras (dependendo da atividade), para dextrinizar 0 L de ua solução de ailodextrina % a 30 C. A análise foi feita por coparação coloriétrica co u padrão de iodo/dextrina. O étodo do DNS, ou do Miles Laboratory, tabé, foi utilizado para edir a variação da concentração de açúcares redutores co o tepo de incubação, no estudo cinético enziático, descrito a seguir (Reguly, 1996). Quantificação da proteína total Foi feita pelo étodo de Bradford (1976), o qual consistiu e coletar aostras, adicionar nestas o reagente Cooasie Biliante Blue e edir sua absorbância a 595 n. A concentração de proteínas é encontrada ao se coparar a absorbância da aostras na curva de calibração obtida co a proteína padrão BSA (soro de albuina bovina). Recuperação das enzias A partir do sistea bifásico aquoso de coposição 5% PEG 4000 e 1,8 % de CaCl, as enzias e alte de ilho fora recuperadas. Ua solução de alte a % e CaCl foi introduzida co o auxílio de ua icro-seringa na fase inferior do sistea. Esperou que o equilíbrio fosse estabelecido (4 a 48 h). Recolhera-se aostras de abas as fases e, nelas, ediu-se a concentração de proteína total para que estas fosse utilizadas nos ensaios de cinética. Cinética de hidrólise do aido Fora feitos estudos coparativos de cinética enziática entre as enzias e - ailases do extrato e alte de ilho e do extrato e PEG 4000. Utilizou-se o ph 5,0 e as teperaturas de 75 C e 55, já que estas variáveis estão próxias das condições ótias das -ailase e -ailase, respectivaente. Para tanto, fora preparadas soluções de aido a 10 g/l e 0, g/l e ph 5,0, e a partir destas fora feitas as devidas diluições para fornecer concentrações dentro das especificações da etodologia que se baseia nas condições liite do substrato (Friedan, 1994; Peter et al., 1987). Possibilitando desta fora, observar se o PEG atua coo inibidor ou ativador destas enzias, enquanto que a teperatura definiu qual das enzias encontra-se ais ativa no extrato e PEG 4000. Para este estudo, usou-se coo base ateática para obtenção dos odelos cinéticos a etodologia de Michaelis-Menten, que se baseia na deterinação das velocidades iniciais de reação nas condições liites do sistea reacional, ou seja: 1- Para baixas concentrações de substrato ([S] << K ); - Para altas concentrações de substrato ([S] >> K ). A linearização do odelo foi feita seguindo a etodologia de Lineweave-Bur. A deterinação da concentração de açúcares redutores gerados no eio foi feita segundo o Método do Milles Laboratory (Reguly, 1996). 7
8 RESULTADOS E DISCUSSÃO Na Tabela 1, encontra-se os dados de atividade enziática das seentes de ilho, durante a gerinação e escala laboratorial. Fora realizados três ensaios nu eso período co as seentes de ua esa safra. Todos os ensaios fora realizados e triplicata e seus valores édios estão na Tabela 1. Tabela 1 Dados experientais de atividade enziática durante a gerinação das seentes de ilho Tepo (dias) Atividade Enziática (SKB) Ensaio 01 Ensaio 0 Ensaio 03 0 0,157 0,117 0,076 1 0,34 0,34 0,5,18,074 1,959 3 5,714 5,648 5,581 4 1,818 4,4 6,667 5 6,667 8,386 10,105 8 5,714 7,48 8,77 Na Figura 5, encontra-se o cresciento da atividade enziática (AE) das ailases, durante o decorrer de u período de 8 dias, para três ensaios co aostras de ua esa variedade de ilho, de esa época de colheita, gerinadas no eso período, co uidade controlada e nas condições abientais de teperatura e pressão. Nesta figura, pode ser observado que a atividade enziática, durante a gerinação, apresenta coportaento seelhante para abos os ensaios. Vê-se que a atividade enziática apresenta cresciento lento até o terceiro dia após as seentes sere postas a gerinar, sendo que no quarto dia alcança seu valor áxio e abos os experientos, gerando u pico nos gráficos, para depois cair a u valor constante. É de se esperar, inicialente, ua taxa de atividade enziática baixa nas seentes (quase que exclusiva devido à presença das -ailases) já que estas ainda estão e estado de dorência. Quando a água penetra na seente, facilita o transporte de glicerídeos (foras pela -ailase) e do ácido giberélico (AG) para as caadas de aleurona onde, os prieiros fornecerão energia para alientar as células, enquanto que o segundo ativa os genes do DNA, responsáveis pela foração das -ailases. Co isto, percebe-se que esta geração de enzias, a princípio, é lenta, acelerando, posteriorente, até alcançar seu valor áxio, no quarto dia, quando a concentração de produtos gerados pelas enzias faz co que parte destas seja inibidas e sua atividade se reduza a u valor constante (Santana, 003). Na Figura 5, é perceptível observar u coportaento da atividade enziática seelhante a ua curva do tipo exponencial, na etapa de cresciento enziático (prieira parte antes dos picos nos gráficos). Logo este coportaento pode ser odelado seelhante ao da taxa de cresciento icrobiano, do tipo y =y 0 e b x. Então, neste estudo, para provar que esta analogia é válida, fizera-se as seguintes denoinações: AE, será a sibologia usada para a atividade enziática (neste caso e SKB); AE 0, é a atividade enziática das seentes 'in natura' ou a atividade inicial das seentes (SKB); t, o tepo de gerinação das seentes (e dias); E é a taxa de cresciento da atividade enziática da seente característica para cada variedade. Desta fora, o odelo para este trabalho é: AE = AE 0 e t (14) A partir de u ajuste exponencial dos dados de atividades enziáticas (valores édios), obtidos, experientalente, e escala laboratorial, Tabela 01, fora encontrados os valores dos parâetros AE 0 e. Esses valores encontra-se nas equações 15, 16 e 17. Coo se pode observar a taxa de cresciento enziático ( ) apresenta u valor próxio de 1,36 s -1 (0,133 de desvio, 9,8% de erro), ostrando que este valor é característico para a variedade estudada. Contudo, eso e aostras de ua esa safra, a atividade destas no estado natural (atividade inicial, AE 0 ) não pode ser considerada coo constante, já que seu valor édio ficou e torno de 0,110 e sua oscilação foi de 44 % (0,048 de desvio padrão), ou seja, este valor é característico das aostras, ebora seus genótipos seja parecidos. Na Figura 6, estão as curvas geradas pelos odelos epíricos (equações 15, 16 e 17) que correlaciona a atividade enziática co o tepo de gerinação das seentes de ilho. Percebe-se que as curvas representa satisfatoriaente os dados experientais, pois os coeficientes de correlação encontra-se próxios ao do valor áxio (1,0), indicando assi, u bo ajuste dos odelos.
AE (SKB) AE (SKB) AE (1) = 0,1643 e 1,197 t (15) R = 0,9986 AE () = 0,0944 e 1,3851 t (16) R = 0,990. AE (3) = 0,077e 1,481 t (17) R = 0,9958 9 30 5 Ensaio 01 Ensaio 0 Ensaio 03 0 15 10 5 0 0 4 6 8 Tepo (dias) Figura 5 Coportaento da atividade enziática (AE) durante o decorrer da gerinação das seentes de ilho. 30 5 0 15 10 5 0 0 0,5 1 1,5,5 3 3,5 4 4,5 Tepo (dias) 1 Ensaio Ensaio 3 Ensaio Expon. (3 Ensaio) Expon. ( Ensaio) Expon. (1 Ensaio) Figura 6 Gráfico da dependência da atividade enziática (AE) co o tepo de gerinação de acordo co o odelo epírico Cinética coparativa entre as ailases de alte de ilho in natura e e PEG Este estudo foi baseado, exclusivaente, na equação de cinética enziática proposta por Michaelis-Menten, que usa as concentrações de substrato no liites inferior e superior da curva gerada pela equação de cinética. A aplicação de ua regressão linear dos recíprocos das concentrações do substrato e das velocidades iniciais na equação linearizada da curva de cinética enziática, segundo a etodologia aplicada por Lineweaver-Bur (Morris, 1979; Voet & Voet, 1995), foi usada para deterinação das constantes de Michaelis- Menten (K ) e de cinética da reação ( cat ), e a velocidade áxia de reação (V ax ). Nas Figuras de 7 a 1, encontra-se os coportaentos das cinéticas enziáticas, proposta por Michaelis Menten, das enzias e -ailases de alte de ilho nos estados in natura e e eio contendo PEG 4000.
1/V V (g/l.in) 10 Todas as curvas fora deterinadas e icrobioreatores de 5,0 L, que conté coo substrato o aido a concentrações variadas e tapão fosfato a ph 5,0 (próxio do ótio das duas enzias) e a teperaturas de 75 ± C e 55 ± C e (ótios da e -ailases, respectivaente). Percebe-se que e abas as figuras as curva geradas pelas enzias e PEG, apresenta valores aiores e suas regiões assintóticas que as curvas geradas pelas enzias e alte de ilho. Sendo assi, as prieiras possue velocidades áxias aiores que as segundas, já que nesta região se encontra os valores quase constantes de V áx. Isto indica que as enzias e extrato de alte possue ua atividade enor que as enzias e extrato de PEG 4000, pois necessita de u tepo aior para hidrolisar totalente ua esa assa de aido. O que tabé pode ser coprovado ao se observar as Figuras 8 e 10, que se refere às curvas anteriores linearizadas pelo étodo de Liweneaver-Bur. Nestas últias figuras, pode-se coparar elhor às atividades das enzias e alte de ilho co as recuperadas e PEG, pois o coeficiente linear destas retas é o recíproco da velocidade áxia, logo aquela que apresentou u enor valor deste coeficiente possui ua aior atividade enziática. Este fato coprova que o PEG é agente ativador destas enzias coo já foi percebido por outros autores (Malinowsi, 001), alé de ser u eio propício para a catalise se containação dos produtos, co uso liberado pelo FDA e alientos (Harris, 199). Ailases e alte Ailases e PEG 4000 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, 0,1 0,0-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5,0,5 3,0 3,5 [S] (g/l) Figura 7 Cinéticas de hidrólise do aido, a ph 5,0 e 75 C. 5,5 Ailases e alte Ailases e PEG 4000 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0,5,0 1,5 1,0-50 0 50 100 150 00 50 300 350 400 1/[S] Figura 8 Linearização pelo étodo de Lineweaver Bur das curvas de hidrólise do aido, a ph 5,0 e 75 C.
1/V V (g/l.in) As Figuras 11 e 1 representa a coparação entre as curvas de cinética noral e linearizada das enzias recuperada e PEG nas teperaturas de 55 ± C e 75 ± C. Observa-se por coparação que e abas há ua superação dos dados das enzias e PEG a 75 C sobre as enzias e PEG a 55 C, de fora que abas as figuras deonstra que na prieira teperatura as enzias possue ua 11 atividade aior, ou seja, há ua aior percentage das -ailases que as -ailases no extrato enziático e PEG, já que as prieiras possue atividade ótia para o ph e a teperatura próxia de 5,0 e 75 C, respectivaente, e as segundas enzias perdere sua atividade à edida que se eleva a teperatura alé do seu ótio, 55 C. 0,65 Ailases e alte Ailases e PEG 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,5 0,0-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5,0,5 3,0 3,5 [S] (g/l) Figura 9 Cinéticas de hidrólise do aido, a ph 5,0 e 55 C. 3,6 Ailases e alte Ailases e PEG 3,4 3, 3,0,8,6,4,,0 1,8 1,6 1,4-100 0 100 00 300 400 500 600 700 800 1/[S] Figura 10 Linearização pelo étodo de Lineweaver Bur das curvas de hidrólise do aido, a ph 5,0 e 55 C. Este fato tabé é coprovado pelos dados obtidos após linearização das equações de cinética, já que a velocidade áxia (V ax ) e a constante catalítica ( cat ) do extrato
1/V V (g/l.in) 1 enziático e PEG a 75 supera os valores destas constantes para o extrato enziático e PEG a 55 C. 75 C 55 C 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, 0,1-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5,0,5 3,0 3,5 [S] Figura 11 Coparação entre as curvas de cinética de hidrólise do aido nas teperaturas de 55 C e 75 C, utilizando as ailases e PEG 4000, a ph 5,0. 5,5 75 C 55 C 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0,5,0 1,5 1,0 0 100 00 300 400 500 600 700 800 1/[S] Figura 1 Coparação entre as curvas de hidrólise do aido linearizadas nas teperaturas de 55 C e 75 C, utilizando as ailases e PEG 4000, a ph 5,0. A seguir são descriinadas as equações 18, 19, 0 e 1 que conte os valores dos parâetros dos odelos de cinética enziática, segundo Michaelis-Menten linearizados por Lineweaver Bur. As equações de núeros pares representa as curvas de cinética linearizadas para as enzias e alte de ilho e as de núeros ípares representa as enzias recuperadas e PEG 4000, a 75 e 55 C, respectivaente. Abaixo destas equações encontra-se os valores das respectivas correlações últiplas (R ), da velocidade áxia (V áx ), da constante de Michaelis Menten (K ) e da constante catalítica ( cat ), co suas devidas unidades. Para os cálculos das constantes cinéticas, considerara-se as concentrações de enzias, [E], coo sendo às edidas das concentrações de proteína total nos
extratos, as quais fora: 0,01014 g/l e 0,004979 g/l, nos extratos enziáticos e alte e e PEG, respectivaente. 1 - Modelo cinético linearizado para as enzias e extrato de PEG a 75 C. 1 1 0,0101 1,533 V [S] R 0,9964 V 0,653 ( g / L.in) (18) K áx 0,006588 ( g / L) cat 131,0 (in - Modelo cinético linearizado para as enzias e extrato do alte de ilho a 75 C. 1 1 0,0097 1,808 V [S] R 0,9970 V 0,559 ( g / L.in) (19) K áx 0,01754 ( g / L) cat 54,51 (in 3 Modelo cinético linearizado para as enzias e extrato de PEG a 55 C. 1 1 0,004 1,616 V [S] R 0,9981 V 0,6189 ( g / L.in) (0) K áx 0,001485 ( g / L) cat 14,3 1 1 (in 4 - Modelo cinético linearizada para as enzias e extrato do alte de ilho a 55 C. 1 1 0,004 1,538 V [S] R 0,9991 V 0,6504 ( g / L.in) (1) K áx 0,003690 ( g / L) cat 64,17 CONCLUSÕES (in A plotage dos dados de tepo e dias e atividade enziática e SKB, resultou nua curva e fora de pico, onde a áxia atividade das seentes, foi observada no quarto dia de gerinação e até a foração do pico a atividade enziática (AE) é ua função exponencial do tepo (t), do tipo: AE = A 0 e t, onde AE 0 é a atividade da seente 'in natura' e é a taxa de cresciento da atividade enziática da seente característica de cada variedade, análogo ao cresciento de icrorganisos. Concluiu-se, tabé, neste ) ) 1 1 ) ) 13 estudo, que no quarto dia de gerinação as seentes de ilho, te a sua áxia atividade enziática, sendo considerado ponto ótio para o processo de altage dessas seentes; O estudo cinético enziático coparativo entre as enzias e -ailases nas foras de alte de ilho e de extrato e PEG 4000, abos a ph 5,0 e teperaturas de 55 ± C e 75 ± C, deonstrou que as enzias recuperadas e PEG 4000 possue ua aior velocidade áxia, para abas as teperaturas, que as enzias e alte de ilho, o que já foi coprovado durante a partição e batelada, onde o valor da atividade específica do extrato enziático e PEG foi superior ao extrato enziático e alte a teperatura abiente (30 ± C); Tabé se pode concluir que há ua aior atividade das enzias -ailases que as -ailases, ao sere coparados as constantes cinéticas e a velocidade de áxia de reação, obtidos nas devidas teperaturas e ph ótios de cada enzia (75 C e 55 C), percebeu-se que os valores da prieira superara os valores da segunda. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Albertsson, P. - Å. Partition of cell particles and acroolecules. 3ª ed., John Willey, New Yor - USA, 1986, 34 p. Borzani, W. Aquarone, E. & Lia, U. A. Biotecnologia: Tecnologia das Ferentações. Vol. 01. 3ª Reipressão. Ed. Edgard Blucher Ltda. São Paulo SP. 1986, 304 p. Bradford, M. M. A rapid and sensitive ethod for the quantitation of icrogra quantities of protein. Utilizing the principle of proteindye binding. Anal. Bioche. 7. 48-54, 1976. Diaond, A.D., Hsu, J.T. Aqueos two phase systes for bioolecule separation. Advences in Biocheistry Engineering, v. 47, p. 89-135, 199. Forgaty, W. M. & Kelly, C. T. Topics in Enzye and Ferentation. Biotechnology; v.3, Chichester, G, Howood- J. Wiley & Sons, 1979, p. Friedan, P. J. Biocheistry: An Illustrated Review with Questions and Explanation.
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