SEBASTIÃO VIEIRA DE MORAIS

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1 SOCIEDADE EVANGÉLICA BENEFICENTE DE CURITIBA FACULDADE EVANGÉLICA DO PARANÁ HOSPITAL UNIVERSITÁRIO EVANGÉLICO DE CURITIBA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRINCÍPIOS DA CIRURGIA SEBASTIÃO VIEIRA DE MORAIS MODELO DE OSTEOARTRITE INDUZIDA POR MONOIODOACETATO DE SÓDIO INTRA-ARTICULAR EM JOELHO DE RATOS CURITIBA 2014

2 SEBASTIÃO VIEIRA DE MORAIS MODELO DE OSTEOARTRITE INDUZIDA POR MONOIODOACETATO DE SÓDIO INTRA-ARTICULAR EM JOELHO DE RATOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Princípios da Cirurgia da Faculdade Evangélica (FEPAR) / Hospital Universitário Evangélico de Curitiba (HUEC) Instituto de Pesquisas Médicas (IPEM), como requisito parcial para obtenção do grau acadêmico de Mestre em princípios da cirurgia. Orientador: Prof. Dr. Nicolau Gregori Czeczko Co-orientador: Prof. Dr. João Batista Santos Garcia CURITIBA 2014

3 Morais, Sebastião Vieira de Modelo de osteoartrite induzida por monoiodoacetato de sódio intra-articular em joelho de ratos / Sebastião Vieira de Morais. Curitiba, f.: il. (algumas color); 29 cm Orientador: Nicolau Gregori Czeczko Dissertação (Mestrado em Princípios da Cirurgia) Instituto de Pesquisas Médicas. Faculdade Evangélica do Paraná. 1. Osteoartrite. 2. Modelo experimental. 3. Monoiodoacetato de sódio. 4. Avaliação clínica, radiológica, microscópica. CDU

4 A Deus, por tudo que tem feito em minha vida, pelas recompensas que tenho recebido em dobro. Aos meus pais, Mariano de Morais e Maria Lígia Vieira de Sousa Morais, pelo amor e dedicação permitindo que eu realizasse este sonho. A minha amada esposa Regina de Fátima Cruz de Morais, pela compreensão, incentivo, exemplo e pelo seu amor e apoio nas horas de maior dificuldade. Aos meus filhos Angélica Cruz de Morais e Pedro Lucas Cruz de Morais, fontes de inspiração e ensinamentos de vida. A cada dia tento ensinar e aprender, ao mesmo tempo, com eles.

5 AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Orlando Jorge Martins Torres pela amizade, ensinamentos, dedicação à medicina e permitir compartilhar deste projeto. Ao meu orientador Prof. Dr. Nicolau Gregori Czeczko por todo apoio e dedicação, serenidade inconfundível e pelo enorme comprometimento que teve desde o início deste trabalho. Ao Prof. Dr. João Batista Santos Garcia pela co-orientação e oportunidade de participarmos dessa linha de pesquisa, onde podemos compartilhar novas conquistas na luta contra a pior sensação que acomete o ser humano que é a dor. À Faculdade Evangélica do Paraná e aos professores Osvaldo Malafaia, Jurandir Marcondes Ribas Filho, pela dedicação em dividir conosco seus conhecimentos e amizade. A toda a equipe do trabalho experimental, em especial aos colegas Lyvia Maria Rodrigues Gomes, Elizabeth Nogueira Teixeira Servin, Eugênio dos Santos Neto, Pedro Paulo de Alcântara Pedro, Elton Anderson Araújo de Cavalcanti, Rayane Luiza Mualem Tajra, Gustavo Pereira Calado, Renan Abud Santos Pinheiro Santos, Jose Antonio Fortes Braga Filho, Maria do Socorro de Sousa Cartágenes, André Luís Guimarães de Queiroz e Camila de Melo e Silva Moraes, cuja participação foi a essência dessa pesquisa. À professora Sirley Bittencourt, pela grandiosidade dos seus ensinamentos sobre nosso bem maior que é a vida. À diretoria do Hospital São Domingos, pelo apoio incondicional para realização deste projeto. Agradecimentos especiais ao Dr. Pablo Gustavo Ribeiro Furtado, pela análise microscópica das lâminas e Dra Márcia Beatriz Oliveira de Sousa, pelo laudo radiológico.

6 A vida é combate que aos fracos abate; que aos fortes, os bravos tende a exaltar. Antônio Gonçalves Dias

7 RESUMO MODELO DE OSTEOARTRITE INDUZIDA POR MONOIODOACETATO DE SÓDIO INTRA-ARTICULAR EM JOELHO DE RATOS Introdução: a osteoartrite é a doença crônica mais comum em pacientes idosos. Ocorre um desequilíbrio entre a formação e a reabsorção dos componentes da articulação, o sintoma mais comum é a dor. Atualmente o tratamento desta doença é limitado ao uso de analgésicos. No campo experimental do estudo da dor na osteoartrite usando animais como modelo tem levado a grandes frustrações, pois enormes ganhos de conhecimentos da ciência obtidos com experimentos em animais não levam ao desenvolvimento de novos compostos clínicos eficazes. O monoiodoacetato de sódio quando injetado intra-articular inibe a glicólise e destrói os condrócitos, por isto já vem sendo usado como modelo experimental, reproduzindo as características da osteoartrite humana. Objetivos: estudar um modelo experimental de osteoartrite em joelhos de ratos através da indução intra-articular do monoiodoacetato de sódio, avaliando-se: a incapacidade articular e dolorosa através de testes clínicos, as alterações radiológicas da articulação do joelho que ocorrem durante o desenvolvimento da osteoartrite e alterações microscópicas da membrana sinovial. Material e método: foram avaliados 48 ratos divididos em dois grupos aleatoriamente, após anestesia geral, o primeiro grupo de animais recebeu soro fisiológico 0,9% na articulação e serviu como controle. O outro foi submetido à osteoartrite experimental no joelho direito com indução intra-articular de monoiodoacetato de sódio. Todos os animais foram submetidos a testes comparativos de deambulação forçada, incapacidade articular e alodínea táctil no dia 1 do experimento. Após indução da osteoartrite foram subdivididos em subgrupos de 6. Os testes foram repetidos nos dias: 7, 14, 21 e 28 e nestes mesmos dias sofreram eutanásia sendo ainda submetidos a estudo radiográfico das articulações do joelho, artrotomia e coleta da membrana sinovial para estudo microscópico. Resultados: os animais que receberam monoiodoacetato de sódio intra-articular, quando submetidos a testes clínicos, apresentaram diferenças significantes quando comparados ao grupo controle nos dia 7 e 14 no Rotarod, nas últimas duas semanas apresentaram marchas semelhantes. Nos testes Weight Bearing e Von Frey tiveram alterações comportamentais dolorosas significantes em todos os dias que foram avaliados. Na avaliação radiológica, após o 14º dia apresentaram alterações osteoartríticas importantes com diferença significante. O exame microscópico da membrana sinovial mostrou alterações de caráter inflamatório em todas as fases. Conclusões: O monoiodoacetato de sódio injetado intra-articularmente no joelho de ratos provoca osteoartrite, evoluindo com: alterações de movimentos da articulação (testes Rotarod e Weight Bering) e da alodínea táctil (teste de Von Frey) nas etapas avaliadas; degeneração radiologicamente significante e progressiva a partir da segunda semana e reação inflamatória microscópica da membrana sinovial em todo o período avaliado. Palavras-chave: Osteoartrite. Modelo experimental. Monoiodoacetato de sódio. Avaliação clínica, radiológica e microscópica.

8 ABSTRACT OSTEOARTHRITIS MODEL INDUCED BY INTRA-ARTICULAR MONOSODIUM IODOACETATE IN THE KNEE OF RATS Introduction: Osteoarthritis is the most common chronic disease in elderly patients. There is an imbalance between the formation and resorption of the components of the joint, the most common symptom is pain. Nowadays, the treatment of this disease is limited to the use of analgesics. In the experimental field, the study of pain in osteoarthritis using animals as models has led to great frustration because huge gains in science knowledge obtained from animal experiments do not lead to development of effective new clinical compounds. monosodium iodoacetate when injected intra-articular inhibits glycolysis and destroys the chondrocytes, for it is already being used as an experimental model reproducing the characteristics of human osteoarthritis. Objectives: Studying an experimental model of osteoarthritis in the knees of rats by inducing intra articular monosodium iodoacetate, evaluating disability and joint pain through clinical trials, radiological changes of the knee joint that occur during the development of osteoarthritis and microscopic changes of the synovial membrane. Material and Method: During the study, we evaluated 48 rats divided into two groups randomly. After general anesthesia, the first group of animals received 0.9% saline in the joint and served as control. The other was subjected to experimental osteoarthritis of the right knee joint to induce intra monosodium iodoacetate. All animals were subjected to comparative tests of forced ambulation, inability to articulate and tactile allodynia on day 1 of the experiment. Following induction of osteoarthritis were divided into subgroups of 6 tests were repeated on days: 7, 14, 21 and 28 and these same days were euthanized still being subjected to radiographic examination of the knee joints, arthrotomy and collection of synovial membrane to study microscopic. Results: Animals receiving monosodium iodoacetate intra-articular showed significant differences when compared to the control group in the day 7:14 in rotarod. In the past two weeks showed similar marches. In weight bearing and Von Frey tests there were significant pain behavioral changes in all the days that were evaluated. In radiological evaluation, after the 14th day, important osteoarthritic changes with significant differences were presented. Microscopic examination of the synovial membrane showed abnormalities of inflammatory character at all stages. Conclusion: Monosodium iodoacetate injected intra-articular in mice causes knee osteoarthritis, evolving with changes in motion of the joint (Rotarod test and Weight Bering) and tactile allodynia (von Frey test) evaluated in steps, with radiologically significant degeneration and progressive from the second week and microscopic inflammation of the synovial membrane in the study period. Keywords: Osteoarthritis. Experimental model. Monosodium iodoacetate. Clinical, radiological and microscopic evaluation.

9 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - FLUXOGRAMA ILUSTRATIVO DO PROTOCOLO EXPERIMENTAL DE OSTEOARTRITE EXPERIMENTAL FIGURA 2 - PUNÇÃO INTRA-ARTICULAR DO JOELHO ATRAVÉS DO TENDÃO PATELAR FIGURA 3 - ANIMAIS EM DEAMBULAÇÃO FORÇADA NO ROTAROD FIGURA 4 FIGURA 5 FIGURA 6 FIGURA 7 FIGURA 8 FIGURA 9 - DISTRIBUIÇÃO DO PESO EM PLATAFORMAS SEPARADAS NO WEIGHT BEARING (A e B) PONTA DO APARELHO DE VON FREY ESTIMULANDO O MEMBRO PÉLVICO ENTRE AS MALHAS DA REDE (A e B) INCISÃO E RESSECÇÃO DE FLAP DA PELE E VISUALIZAÇÃO DO TENDÃO PATELAR (A) DESINSERÇÃO PROXIMAL DO MESMO (B) INDICADOS PELAS SETAS ARTROTOMIA DO JOELHO (A) E RESSECÇÃO DA MEMBRANA SINOVIAL (B) INDICADOS PELAS SETAS COMPARAÇÃO ENTRE JOELHOS, GRUPO CONTROLE ASPECTO NORMAL (A) E COM OSTEOARTRITE GRUPO OSTEOARTRITE ONDE APÓS RESSECÇÃO DA CÁPSULA PODE-SE VER LESÃO CONDRAL (B) INDICADA PELA SETA ASPECTO RADIOGRÁFICO 7º DIA NORMAL. A DIREITA GRUPO CONTROLE (A) E A ESQUERDA GRUPO OSTEOARTRITE (B) FIGURA 10 - ASPECTO RADIOGRÁFICO 14º DIA DE EVOLUÇÃO ONDE SE PODE VER GRUPO CONTROLE À DIREITA JOELHO NORMAL (A) E À ESQUERDA GRUPO OA COM SINAIS DE OSTEOARTRITE (B) INDICADA PELA SETA FIGURA 11 - ASPECTO RADIOGRÁFICO DA 21º DIA DE EVOLUÇÃO DO GRUPO CONTROLE: A DIREITA NORMAL (A) E ALTERAÇÕES COM SINAIS DE OSTEOARTRITE NO GRUPO OA A ESQUERDA (B) INDICADAS PELA SETA FIGURA 12 - ASPECTO RADIOGRÁFICO DO 28º DIA JOELHO LADO DIREITO GRUPO CONTROLE COM INÍCIO DE OSTEOARTRITE (A) E NO LADO ESQUERDO GRUPO OA LESÃO GRAVE DESTRUIÇÃO DOS CÔNDILOS FEMORAIS (B) INDICADOS PELA SETA FIGURA 13 - FOTOMICROGRAFIA DA MEMBRANA SINOVIAL DO JOELHO DE RATOS WISTAR GC7. TECIDO NORMAL (A) E GOA7 INFILTRADO INFLAMATÓRIO (B) COLORAÇÃO HEMATOXILINA-EOSINA INDICADOS PELA SETA FIGURA 14 - FOTOMICROGRAFIA DA MEMBRANA SINOVIAL DO JOELHO DE RATOS WISTAR GC14 TECIDO NORMAL (A) E GOA14 PROCESSO INFLAMATÓRIO AGUDO (B) COLORAÇÃO HEMATOXILINA-EOSINA INDICADOS PELA SETA FIGURA 15 - FOTOMICROGRAFIA DA MEMBRANA SINOVIAL DO JOELHO DE RATOS WISTAR GC21 TECIDO NORMAL E GOA21 ALTERAÇÕES INFLAMATÓRIAS (B) COLORAÇÃO HEMATOXILINA-EOSINA INDICADA PELA SETA FIGURA 16 - FOTOMICROGRAFIA DA MEMBRANA SINOVIAL DO JOELHO DE RATOS WISTAR GC28 TECIDO NORMAL (A) E GOA28 COM PROCESSO INFLAMATÓRIO (B) COLORAÇÃO HEMATOXILINA-EOSINA INDICADO PELA SETA... 54

10 LISTA DE GRÁFICOS GRÁFICO 1 - GRÁFICO 2 - GRÁFICO 3 - MOSTRANDO AS MÉDIAS E ERROS-PADRÃO DO GRUPO CONTROLE E GRUPO OSTEOARTRITE LONGO DO EXPERIMENTO PELO TESTE ROTAROD MOSTRANDO AS MÉDIAS E ERROS-PADRÃO DO GRUPO CONTROLE E GRUPO OSTEOARTRITE AO LONGO DO EXPERIMENTO PELO TESTE DE WEIGHT BEARING MOSTRANDO AS MÉDIAS E ERROS-PADRÃO DO GRUPO CONTROLE E GRUPO OSTEOARTRITE AO LONGO DO EXPERIMENTO PELO TESTE VON FREY GRÁFICO 4 - MOSTRANDO AS MÉDIAS E ERROS-PADRÃO DA AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA ENTRE OS GRUPOS CONTROLE E OSTEOARTRITE GRÁFICO 5 - MOSTRANDO AS MÉDIAS E ERROS-PADRÃO DA AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA ENTRE OS GRUPOS CONTROLE E OSTEOARTRITE... 52

11 LISTA DE TABELAS TABELA 1 - TABELA 2 - TABELA 3 - TABELA 4 - TABELA 5 - TABELA 6 - AVALIAÇÃO DO GRUPO CONTROLE PELA DEAMBULAÇÃO FORÇADA TESTE ROTAROD AVALIAÇÃO DO GRUPO OA PELA DEAMBULAÇÃO FORÇADA TESTE ROTAROD RESULTADO DA INCAPACIDADE ARTICULAR DOS MEMBROS PÉLVICOS NOS ANIMAIS DO GRUPO CONTROLE PELO TESTE DE WEIGHT BEARING RESULTADO DA INCAPACIDADE ARTICULAR DOS MEMBROS PÉLVICOS NOS ANIMAIS DO GRUPO OA USANDO O TESTE WEIGHT BEARING RESULTADOS DO GRUPO CONTROLE QUANDO ESTIMULADO PELO TESTE DE VON FREY RESULTADOS DO GRUPO OA QUANDO ESTIMULADO PELO TESTE DE VON FREY TABELA 7 - RESULTADOS DA AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA NO GRUPO CONTROLE TABELA 8 - RESULTADOS DA AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA DO GRUPO OA TABELA 9 - TABELA 10 - RESULTADO DA ANÁLISE MICROSCÓPICAS DAS MEMBRANAS SINOVIAIS DO GRUPO CONTROLE RESULTADO DA ANÁLISE MICROSCÓPICAS DAS MEMBRANAS SINOVIAIS DO GRUPO OA... 51

12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO OBJETIVOS REVISÃO DE LITERATURA MATERIAL E MÉTODO AMOSTRA ALBERGAMENTO DOS ANIMAIS DIVISÃO DA AMOSTRA EM GRUPOS E SUBGRUPOS INDUÇÃO DA OSTEOARTRITE Avaliação da deambulação forçada (teste Rotarod) Avaliação da incapacidade articular (teste Weight Bearing) Avaliação da alodínea táctil (teste de Von Frey) AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA COLETA DA MEMBRANA SINOVIAL E ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS PROCEDIMENTO CIRÚRGICO AVALIAÇÃO NA DEAMBULAÇÃO FORÇADA (TESTE ROTAROD) AVALIAÇÃO DA INCAPACIDADE ARTICULAR (TESTE WEIGHT BEARING) AVALIAÇÃO DA ALODÍNEA TÁCTIL (TESTE VON FREY) AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA ANÁLISE MICROSCÓPICA DISCUSSÃO MODELO ANIMAL MONOIODOACETATO DE SÓDIO REVALIDAÇÃO DO MODELO MONOIODOACETATO DE SÓDIO AVALIAÇÃO DA DEAMBULAÇÃO FORÇADA (TESTE ROTAROD) AVALIAÇÃO DA INCAPACIDADE ARTICULAR TESTE (WEITGHT BEARING) AVALIAÇÃO DA ALODÍNEA TÁCTIL (TESTE VON FREY) AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA... 61

13 5.8 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA PERSPECTIVAS FUTURAS CONCLUSÕES REFERÊNCIAS APÊNDICES ANEXO... 82

14 1 INTRODUÇÃO

15 INTRODUÇÃO 13 A osteoartrite é a doença crônica mais comum em indivíduos idosos. Estima-se que aproximadamente 50 por cento dos indivíduos de ambos os sexos, ao completarem 65 anos de idade, terão algum sintoma de osteoartrite (BOVE et al., 2009; HARVEY e DICKENSON, 2009). A osteoartrite é definida pelo Colégio Americano de Reumatologia como um conjunto de alterações heterogêneas que induzem sinais e sintomas articulares dolorosos associados a defeitos na integridade da cartilagem articular e membrana sinovial em associação às alterações relacionadas ao tecido ósseo situado na margem articular (XIMENES, MELO e CUSTODIO, 2009). A osteoartrite se caracteriza clinicamente por dor e o que parece ocorrer é um desequilíbrio entre formação e destruição dos principais constituintes da cartilagem articular, associada a várias condições: sobrecarga mecânica (atividade laboral, exercícios físicos demasiados, obesidade), alteração da bioquímica da cartilagem e da membrana sinovial associado a fatores genéticos (COIMBRA et al., 2002). Pode ser idiopática, quando não há uma causa aparente, secundária, quando aparece após traumatismos, neste caso afetando também indivíduos jovens ou associada a doenças reumáticas (FELSON, 2000). A cartilagem articular, principal alvo das alterações degenerativas da osteoartrite, possui duas funções: permitir o movimento da articulação com o mínimo de atrito, graças à lubricin, uma glicoproteína secretada pelos fibroblastos sinoviais e absorver impactos evitando danos ósseos, graças ao colágeno tipo II e aos proteoglicanos sintetizados pelos condrócitos (HUNTER e FELSON, 2006; GLEGHORN et al., 2009; WALLER et al., 2013). Um processo inflamatório ativado por forças mecânicas anormais ativaria condrócitos, levando à produção de citocinas pelos macrófagos: interleucinas 1, 6, 8, 17, 18 e proteína-1 quimiotática de monócitos, fator inibidor de leucemia, oncostatina M e espécies reativas de oxigênio. Todos esses fatores associados às ações de prostaglandinas e leucotrienos aumentam a atividade catabólica dos condrócitos, resultando na liberação de enzimas proteolíticas e degradação da superfície articular (GARCIA, ISSY e SAKATA, 2002; DUMOND et al., 2004; LOESER et al., 2012). Historicamente o diagnóstico era feito por radiografias destacando como principais características a formação de osteófitos, esclerose subcondral, cistos ósseos e diminuição do espaço articular levando ao desalinhamento ósseo. Com o surgimento da ressonância magnética, os tecidos moles da articulação podem também ser estudados, incluindo grau de inflamação da membrana sinovial e

16 INTRODUÇÃO 14 cartilagem articular, frouxidão ligamentar, lesões meniscais e edema da medula óssea (FERNIHOUGH et al., 2004). No momento, muitas drogas paliativas como anti-inflamatórios não esteroides, corticoides e mesmo opioides têm sido usadas no tratamento da doença, porém nenhuma delas conseguiu interromper o processo evolutivo da lesão, que é o principal objetivo do tratamento (CIALDAI et al., 2009). Atualmente, existem diversos modelos experimentais para o estudo de osteoartrite em animais (BENDELE, 2001). A necessidade destes métodos surgiu à medida que as dificuldades para a avaliação objetiva da osteoartrite em humanos se apresentavam, dentre elas a inexistência de marcadores bioquímicos confiáveis, dificuldade para obtenção de tecidos para análise histopatológica e padronização deficiente da classificação radiológica da doença. Por este motivo, tais modelos ainda são amplamente utilizados para aperfeiçoamento de técnicas diagnósticas, bem como para a avaliação pré-clínica de novos fármacos para o tratamento de osteoartrite (SILVA JUNIOR, 2007). O modelo ideal deve reproduzir a doença de forma rápida, de preferência em mamíferos de baixo custo e de fácil manuseio, e permitir o estudo articular por meio de avaliações como as análises radiológica, biomecânica e microscópica dos tecidos envolvidos. A patogênese também deve ser semelhante às lesões dos tecidos que afetam a articulação da espécie humana, bem como a resposta terapêutica (LITTLE e SMITH, 2008). De forma geral, os modelos experimentais para estudo de osteoartrite podem ser classificados em: espontâneos, cirúrgicos, genéticos e químicos, cada qual englobando aspectos únicos da osteoartrite de forma simples ou combinada, mas nunca em toda a complexidade da osteoartrite humana (AMEYE e YOUNG, 2006). Os modelos experimentais espontâneos de osteoartrite ocorrem naturalmente em porquinhos da índia, hamsters-sírio e outras espécies de animais, mas podem ser feitos também através da criação de modelos transgênicos, introduzindo mutações no colágeno tipo II (SAAMANEN et al., 2000). Por terem evolução progressiva e não envolverem nenhum tipo de interferência na articulação, eles expressam as modificações mais semelhantes à osteoartrite humana. No entanto, as alterações articulares têm evolução bastante lenta, o que acaba

17 INTRODUÇÃO 15 prolongando o tempo de estudo da patogênese da doença e dos efeitos de drogas testadas (BENDELE, WHITE e HULMAN, 1989; BENDELE et al., 1991). Os modelos cirúrgicos também são bastante utilizados por terem resultados previsíveis e de rápida instalação. Estes podem se dar por meio de lesões cirúrgicas que produzem instabilidade na própria articulação como meniscectomia (VELOSA et al., 2007; UCHII et al., 2010), lesões através da ressecção do ligamento cruzado anterior (TEEPLE et al., 2011), combinação de ambas as lesões na mesma articulação (KAMEKURA et al., 2005; FERLAND et al., 2011) ou lesões diretas na própria cartilagem (THOMPSON et al., 1991). Também podem ser feitos por técnica cirúrgica de maneira indireta através da ressecção dos ovários de fêmeas (CAKE et al., 2005). Como uma das articulações mais usadas nestes modelos é do joelho, um dos obstáculos para análise dos resultados é a distribuição da carga articular. Como demonstrado por BENDELE e HULMAN (1988) animais que distribuem seu peso, predominantemente, sobre a porção medial da cartilagem articular do joelho, terão lesões mais severas nessa localização, após uma meniscectomia medial e vice-versa. Assim como os modelos cirúrgicos, os modelos experimentais químicos de osteoartrite também apresentam resultados de rápida instalação. A osteoartrite durante muito tempo, foi induzida por substâncias químicas de maneira sistêmica como no uso do adjuvante de Freund aplicado por via intradérmica na cauda do rato (AWOUTERS et al., 1976) ou na planta do membro pélvico (STEIN, MILLAN e HERT, 1988). Entretanto, esse modelo evolui com um quadro sistêmico, além de levar à poliartrite generalizada, e associado à piora do estado geral do animal dificultando seu manuseio por muito tempo. Por causarem alterações por vezes bastante agressivas, são modelos ideais para o estudo de osteoartrite secundária, que possui uma evolução bem mais acelerada que a osteoartrite primária de evolução progressiva e lenta. Há também outras substâncias utilizadas com este propósito como a colagenase (AL-SAFFAR et al., 2009; LEE et al., 2009), quinolona (BENDELE, 2001) e papaína (NEUGEBAUER et al., 2007). Atualmente, um dos modelos químicos de osteoartrite mais utilizados é o monoiodoacetato de sódio, um inibidor de atividade da gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase e da glicólise que induz à morte dos condrócitos. A injeção intraarticular de monoiodoacetato de sódio leva à destruição de condrócitos em roedores e não roedores. Quando usado em roedores, o modelo apresenta lesões da

18 INTRODUÇÃO 16 cartilagem com perda matriz proteoglicana e alterações da função, com rigidez articular similares àquelas observadas na osteoartrite humana (SCHUELERT e MCDOUGALL, 2009). Na cartilagem articular, a necrose dos condrócitos leva à destruição desta com erosão e exposição do osso subcondral que, em uma fase mais avançada da doença, irá responder com remodelação óssea, esclerose e formação osteofitária (GUZMAN et al., 2003). Este modelo de lesão de artrite por monoiodoacetato de sódio foi descrito por Kalbhen há 30 anos (COMBE, BRAMWELL e FIELD, 2004). Apenas recentemente, no entanto, surgiram estudos avaliando o comportamento doloroso dos animais neste modelo experimental (GUIMGAMP et al., 1997; BOVE et al., 2003; KOBAYASHI et al., 2003). Desta forma, tendo em vista a importância da membrana sinovial e do osso subcondral na gênese da dor articular na osteoartrite, muitos trabalhos experimentais têm sido publicados com monoiodoacetato de sódio, mas a maioria destes avaliam aspectos anatomopatológicos em estudos separados. No presente trabalho propõe-se ampliar a investigação da dor no modelo experimental de osteoartrite por monoiodoacetato de sódio, avaliando-se o comportamento dos animais clinicamente através da incapacidade articular joelho estática e dinamicamente, bem como da alodínea táctil, correlacionando-o às alterações radiológicas e histopatológicas observadas ao longo dos vários dias. 1.1 OBJETIVOS Estudar um modelo experimental de osteoartrite em joelhos de ratos induzida por monoiodoacetato de sódio intra-articular, avaliando-se: a) a incapacidade articular e dolorosa através de testes clínicos; b) as alterações radiológicas da articulação do joelho que ocorrem durante o desenvolvimento da osteoartrite; e c) as alterações microscópicas na membrana sinovial.

19 2 REVISÃO DE LITERATURA

20 REVISÃO DE LITERATURA 18 KALBHEN (1984) para observar resultados de testes farmacológicos de medicamentos com potência condroprotetora desenvolveu um modelo animal de osteoartrite induzida bioquimicamente, bloqueando o metabolismo de energia e processos de síntese glicolítica em condrócitos articulares. Após a injeção local de monoiodoacetato de sódio observou a presença de reações osteoartríticas que avançaram entre 2-4 meses. A injeção de monoiodoacetato de sódio foi introduzida inicialmente como um método para a produção de um modelo animal de osteoartrite em galinhas e ratos. Injeção intra-articular de uma solução de monoiodoacetato de sódio de sódio induziu a desorganização da cartilagem articular, por inibição do metabolismo dos condrócitos, e as consequentes alterações degenerativas na cartilagem articular semelhantes aos descritos em osteoartrite humana. A injeção do inibidor metabólico monoiodoacetato de sódio na articulação inibe a atividade do gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase em condrócitos, o que resulta na interrupção da glicólise e morte da célula. O modelo de monoiodoacetato de sódio foi usado para estudo histológico, e posteriormente, foi adotado para estudar a dor da osteoartrite. Observando a degeneração da cartilagem WILLIAMS e BRANDT (1985), afirmam que a osteoartrite poderia ser induzida em praticamente qualquer espécie animal pela injeção intra-articular de monoiodoacetato de sódio, através de lesão direta dos condrócitos. Dependendo da concentração utilizada e a frequência, esta lesão pode ocorrer em diferentes graus de indução, assim, pode ser alcançado a degeneração articular. Em cobaias, após injeção de duas doses diferentes de monoiodoacetato de sódio intra-articular (0,1 mg/ml e 3 mg/ml), com intervalos de 24 horas terá como resultado a morte de todos os condrócitos sobre os planaltos tibiais e côndilos femorais. Na década de 90, GUINGAMP, GEGOUT-POTTIE, PHILIPPE, TERLAIN, NETTER e GILLET (1997) em um experimento usando monoiodoacetato de sódio intra-articular em ratos, verificaram as respostas morfológicas e bioquímicas, além de mudanças relativas à mobilidade dos animais. As lesões articulares encontradas foram caracterizadas por macroscopia e exames histológicos, observaram que apenas doses elevadas monoiodoacetato de sódio (0,3 mg e 3 mg) conduziram a uma perda de mobilidade progressiva e a longo prazo (após 15 dias da indução), estas duas doses resultaram em mudanças significativas na concentração de proteoglicanos na cartilagem por volta do décimo quinto dia e uma forte inibição do

21 REVISÃO DE LITERATURA 19 anabolismo na patela periférica por volta do dia 2, quando comparados com os efeitos de doses mais baixas. Em última análise, ocorrem formações de grandes osteófitos neste modelo de indução. Potenciais utilizações para este modelo incluem a avaliação de agentes para inibir a degeneração aguda quando a morte de condrócitos é incompleta e a inibição da degeneração da matriz. Uma vez que a formação de osteófitos é uma característica proeminente, este modelo pode ser usado para estudar a indução ou a inibição de formação. Concluíram assim que, em uma dosagem suficiente, o monoiodoacetato de sódio pode facilmente e rapidamente reproduzir lesões semelhantes à osteoartrite comprometendo funcionalmente os animais, algo muito semelhante ao observado na doença humana, ou seja, estes parâmetros assim como o metabolismo de proteoglicanos podem servir como indicadores para o estudo de drogas condroprotetoras. JANUSZ, HOOKFIN, HEITMEYER, WOESSNER, FREEMONT, HOYLAND, BROWN, HSIEH, ALMSTEAD, NATCHUS, PIKUL e TAIWO (2001) analisaram a moderação da osteoartrite experimental induzida por monoiodoacetato de sódio em ratos por inibidores de metaloproteinase de matriz, onde ratos receberam injeção de monoiodoacetato de sódio intra-articular no joelho e os danos causados na tíbia foram avaliados a partir de imagens digitalizadas capturadas por um analisador de imagem e pela histologia. Utilizando uma solução de monoiodoacetato de sódio (3mg) injetada no animal após anestesia com a perna flexionada a 90º na altura do joelho, o ligamento patelar foi palpado abaixo da patela e a injeção foi feita nesta região. Os pesquisadores afirmaram que a severidade das lesões da cartilagem, a supressão da mobilidade e a inibição da síntese de proteoglicanos estavam diretamente relacionadas à dose de monoiodoacetato de sódio, além de que o rápido desenvolvimento da patologia no joelho pode ser controlado por esta dose injetada, o que proporciona um modelo com sistema útil para avaliar potenciais modeladores da osteoartrite. BOVE, CALCATERRA, BROOKER, HUBER, GUZMAN, JUNEAU, SCHRIER, e KILGORE (2003) realizaram um experimento, onde analisaram as alterações histológicas induzidas pelo monoiodoacetato de sódio no osso subcondral e na cartilagem articular de ratos Wistar. Os joelhos dos animais receberam injeção de uma única concentração de monoiodoacetato de sódio intra-articular (1mg) através do ligamento patelar do joelho direito e foram sacrificados nos dias 1, 3, 5, 7, 14, 28 e 56 após a injeção. Os pesquisadores observaram que nos primeiros dias

22 REVISÃO DE LITERATURA 20 após injeção (dias 1-7), pontos temporais precoces, que foram caracterizados por áreas de condrócitos degenerados e necrose, que envolveu toda a espessura da cartilagem articular nos planaltos tibiais e côndilos femorais. Ainda por volta do dia 7, observaram mudança no osso subcondral, evidenciado pelo aumento no número de osteoblastos e osteoclastos. Por volta do dia 28, foi observado fragmentação focal e colapso do trabeculado ósseo com fibrose e aumento da atividade osteoclástica. Próximo do 56º dia, houve grandes áreas de remodelação óssea evidenciadas pela reabsorção óssea osteoclástica e trabéculas recém-formadas, com perda de células hematopoieticas na medula. Foi também observada a presença de cistos e esclerose subcondrais em alguns ratos. Concluíram que a injeção intra-articular de monoiodoacetato de sódio induz a perda de cartilagem articular com lesões ósseas que imitam as da osteoartrite em humanos, além de se tratar de um método rápido e minimamente invasivo para induzir lesões de osteoartrite, por isso é um modelo que demonstra uma clara relação entre os danos da cartilagem e alterações ósseas, podendo ser usado para estudar o papel do osso subcondral na progressão da osteoartrite, além de poder ser utilizado para correlacionar o aparecimento e progressão da dor com lesões articulares específicas. COMBE, BRAMWELL e FIELD (2004), com objetivos de estudar modelos para dor crônica, testaram o modelo de monoidoacetato de sódio para osteoartrite, e relataram que este poderia ser considerado um modelo de dor nociceptiva crônica em ratos, determinando desfechos de dor em ratos induzidos com a droga e investigando a eficácia de agentes analgésicos para dor crônica (tramadol e morfina). Utilizaram Ratos Sprague-Dawley, que receberam injeção intra-articular de monoiodoacetato de sódio na concentração de 3mg e passaram por testes de alodínea táctil de Von Frey e incapacitância articular pelo teste weight bearing por 10 semanas. Foram observadas alterações tanto a alodínea táctil quanto a análise do suporte de peso em ratos induzidos com monoiodoacetato de sódio após 10 semanas. Foi observada também uma melhora nestes testes nos grupos que receberam tramadol e morfina. A conclusão revelou que o modelo é reprodutível e imita características associadas com dor crônica da osteoartrite em humanos, e que estudos com medicamentos analgésicos indicam que este método também pode ser útil para investigar dor crônica. POMONIS, BOULET, GOTTSHALL, PHILLIPS, SELLERS, BUNTON e WALKER (2005), analisaram o desenvolvimento e caracterização deste modelo de

23 REVISÃO DE LITERATURA 21 indução de dor na osteoartrite, onde investigaram se a doença era induzida por injeção de monoiodoacetato de sódio na articulação do joelho de ratos, além de avaliarem a degeneração articular com análise radiográfica e medir o comportamento de dor utilizando suporte de peso nos membros posteriores. No experimento, os animais receberam uma única injeção de monoiodoacetato de sódio (0.3, 1 ou 3mg). Observaram que a injeção de monoiodoacetato de sódio resultou em uma degeneração articular crônica, conforme medido pela diminuição de conteúdo mineral ósseo e a densidade mineral óssea, além de necrose na cartilagem articular e formação de osteófitos. Concluíram que o modelo de osteoartrite induzido por monoiodoacetato de sódio é um relevante modelo animal para o estudo da dor associada à osteoartrite e pode ser usado para testar potenciais agentes terapêuticos. Em estudo realizado por BEYREUTHER, CALLIZOT e STOHR (2007) mostraram a eficácia antinociceptiva da Lacosamida em modelo de osteoartrite induzida com monoiodoacetato de sódio, afirmaram que a perda progressiva de condrócitos nos resultados histológicos e morfológicos resulta de alterações da cartilagem articular e estas se assemelham àqueles que são vistas em pacientes com osteoartrite. Ainda afirmam que a análise do comportamento da dor só foi recentemente estabelecida com utilização do monoiodoacetato de sódio. No estudo em questão, a osteoartrite foi induzida por injeção intra-articular de 50 L de monoiodoacetato de sódio (3mg) através do ligamento patelar do joelho direito. Cinco dias após a injeção de monoiodoacetato de sódio já podia ser observada uma inflamação substancial de articulações sinoviais. Os autores concluíram que a sensação de dor nas articulações pode ser causada em alguns estados da osteoartrite, a partir de terminações nervosas livres na membrana sinovial, neste modelo, o período inicial implica uma inflamação sinovial transitória. Uma semana após a indução com monoiodoacetato de sódio, a inflamação é resolvida e a sensação de dor nas articulações provavelmente deve ter sido causada por forças biomecânicas que afetam a cartilagem articular e o osso subcondral, portanto, o monoiodoacetato de sódio reflete muito bem os diferentes estados de dor em pacientes com osteoartrite. URYU, OKADA e KAWAKITA (2007), induziram osteoartrite de joelho em ratos Wistar num experimento com 36 animais para observar os efeitos da moxibustão, um tipo de terapia oriental que trata por aquecimento de certas partes

24 REVISÃO DE LITERATURA 22 do corpo, na qual todos os animais foram manipulados por várias sessões de 10 minutos por dia durante duas semanas. Os pesquisadores afirmaram que a injeção intra-articular de uma solução de monoiodoacetato de sódio provocou uma inflamação característica que foi reduzida significativamente com o uso da terapia, quando trataram do limiar de dor nesses animais observados em técnicas de sustentação de peso por testes de incapacitância, verificaram que eles foram beneficiados por opioides endógenos liberados com a terapia oriental. No mesmo ano que, BARVE, MINNERLY, WEISS, MEYER, AGUIAR, SULLIVAN, WEINRICH e CABEÇA (2007), caracterizam o modelo de indução de osteoartrite por monoiodoacetato de sódio para determinar a utilidade deste modelo para doenças humanas, através de comparações de níveis sistemáticos de perfis transcricionais gerados a partir de cartilagem de animais e doenças humanas. A osteoartrite foi induzida na articulação do joelho dos animais com uma única injeção de monoiodoacetato de sódio com concentração de 2mg, a formação da lesão foi confirmada por análise histológica. Os pesquisadores colheram cartilagem de joelhos humanos e as mudanças de expressões gênicas foram medidas usando matrizes humanas. O estudo mostrou que existe semelhança transcricional, apesar de pouca, entre o modelo de osteoartrite induzida por monoiodoacetato de sódio e cartilagem humana coletada de pacientes com osteoartrite, e como a atividade moduladora muitas vezes não se traduzem de modelos animais para modelos humanos o estudo pôde fornecer uma base para a compreensão das discrepâncias. SILVA, ANDERSEN e TUFIK (2008) analisaram um padrão de sono em um modelo experimental de osteoartrite para obter informações a respeito dos efeitos da dor articular crônica sobre esses padrões. Fizeram implantação de eletrodos para eletromiografia e eletrocorticografia em ratos, e tiveram osteoartrite induzida por monoiodoacetato de sódio na articulação do joelho esquerdo, houve monitoramento do sono e avaliação no início do estudo e posteriormente nos dias: 1, 10, 15, 20 e 28, o limiar de dor foi avaliado em testes de placa quente. O dano articular foi induzido por uma única injeção de 2mg de monoiodoacetato de sódio intra-articular no joelho esquerdo de animais anestesiados com halotano, uma dose de 2mg produziu hiperalgesia reprodutível forte e alodínea sem efeitos sobre a saúde geral dos animais, essa hiperalgesia elevada foi observada até o 28º após indução. Os resultados demonstraram que a osteoartrite tem o limiar de dor térmica reduzida a partir do 10º dia até o final do experimento, os animais também exibiram

25 REVISÃO DE LITERATURA 23 redução na eficiência do sono, com sonos de ondas lentas e paradoxal, e um aumento no número de microdespertares durante o período de luz, quando comparados com a linha basal, essas mudanças no padrão do sono ocorreram principalmente entre os dias 10 a 28. Concluíram que a dor associada com o modelo de osteoartrite provoca alterações nos padrões de sono, interrompendo-o, garantindo assim um modelo reprodutível com monoiodoacetato de sódio para este tipo de experimento. HARVEY e DICKENSON (2009), analisando o comportamento e caracterização eletrofisiológica da osteoartrite induzida experimentalmente, afirmam ter observado em camundongos C57Bl/6 uma hipersensibilidade mecânica significativa na pata posterior ipsilateral após injeção intra-articular de monoiodoacetato de sódio. Em todos os momentos observados, a hipersensibilidade mecânica exibiu um padrão temporal bifásico parcial, mas a hipersensibilidade térmica estava ausente. Os camundongos também apresentaram alterações neuronais no corno dorsal, responsável pela transmissão da dor em nível de medula, que foram significativamente elevadas quando comparadas com o grupo controle, concluindo que o modelo de dor em osteoartrite induzida por monoiodoacetato de sódio apresenta características comportamentais muito semelhantes, e que as mudanças em ambas medidas de comportamento e atividade neuronal dos membros pélvicos, sugere que mudanças centrais estão envolvidas nesse estado de dor, apesar de que unidades periféricas também podem possuir um papel importante. Finalizam afirmando que este modelo permite uma melhor exploração nos animais para entender os mecanismos subjacentes e identificar alvos moleculares. OKAMOTO e ATSUTA (2010) analisaram a degeneração da cartilagem articular após a utilização de um modelo de dor quimicamente induzida por monoiodoacetato de sódio em joelho de ratos, testaram 4 mediadores inflamatórios (Bradicinina, Acetilcolina, Serotonina e ATP). Foram utilizados 48 animais dentre os quais 24 tiveram indução de osteoartrite por vinte e cinco microlitros de uma solução de monoiodoacetato de sódio numa concentração de 6/mg. Afirmaram que a artrite induzida por monoiodoacetato de sódio teve efeitos importantes sobre os mediadores e na sensibilidade dos receptores polimodais, e que tais alterações podem participar no surgimento da dor nas articulações. Concluíram que a cartilagem de todos os animais que tiveram osteoartrite induzida por

26 REVISÃO DE LITERATURA 24 monoiodoacetato de sódio mostraram degeneração histológica grave e que houve uma maior magnitude e duração da artrite induzida por esta substância, quando comparado com os outros grupos, além disso, sugeriram que os nociceptores encontrados nas junções com osteoartrite são mais sensíveis do que os mediadores inflamatórios de articulações normais, essa sensibilização nociceptiva para mediadores inflamatórios pode participar na dor articular em osteoartrite. IM, KIM, LI, KOTWAL, SUMNER, VAN WIJNEN, DAVIS, YAN, LEVINE, HENRY, DESEVRÉ e KROIN (2010) em um experimento feito com ratos, utilizaram um modelo animal de dor no joelho gerado por injeção intra-articular de monoiodoacetato de sódio em ratos Sprague - Dawley, e foram realizados testes sintomáticos de dor e testes comportamentais. Os pesquisadores analisaram as relações entre o desenvolvimento da osteoartrite com acompanhamento de respostas de dor e alterações graduais nos componentes celulares e estruturais comuns no joelho (ou seja, cartilagem, sinóvia, menisco e osso subcondral), examinaram por análise histológica e imunohistológica, além de exame macroscópico e tomografia computadorizada microfocal, observaram que houve mudanças progressivas nas inter-relações dinâmicas entre tecido dos joelhos periféricos e componentes centrais das vias nociceptivas causados pela indução da osteoartrite. Puderam concluir que as vias da dor em joelhos induzido por monoiodoacetato de sódio podem sobrepor-se, pelo menos em parte, com os mecanismos de dor neuropática. HADIPOUR-JAHROMY e MOZAFFARI-KERMANI (2010) estudaram o efeito condroprotetor do suco de romã em osteoartrite induzida por monoiodoacetato de sódio na articulação do joelho de ratos, onde injetaram uma única dose da substância na concentração de 0,1 mg na cartilagem da articulação do joelho e sacrificaram os animais nos dias 1, 14 e 28 após a injeção. Afirmaram que a osteoartrite precoce foi caracterizada por áreas de degeneração de condrócitos que, por vezes, envolveu toda a espessura da cartilagem articular nos planaltos tibiais e côndilos femorais, além de mudanças no osso subcondral e no conteúdo dos proteoglicanos, assim como fragmentação focal, proliferação de células sinoviais e necrose. As alterações no joelho eram dependentes do tempo, achados histológicos como desorganização de condrócitos, erosão e fibrilação da superfície da cartilagem, além de exposição do osso subcondral e perda de proteoglicanos na cartilagem foram observados 14 dias após a injeção no joelho que recebeu a

27 REVISÃO DE LITERATURA 25 indução. A cartilagem dos joelhos de ambos os ossos femorais e tibiais mostraram uma superfície irregular que foi ocasionalmente acompanhada por ulceração e fibrilação, especialmente depois de 28 dias. FERLAND, LAVERTY, BEAUDRY e VACHON (2011) realizaram um estudo comparativo de análise de marcha e resposta de dor em dois modelos de osteoartrite, um por corte cirúrgico do ligamento cruzado anterior e meniscectomia medial para criar uma instabilidade parcial, outra através de uma injeção intraarticular de monoiodoacetato de sódio, como um modelo de dor articular inflamatório. Os animais foram avaliados durante quatro semanas consecutivas e as articulações dos joelhos foram avaliadas histologicamente. Com o modelo de monoiodoacetato de sódio foram observadas mudanças significativas e persistentes no parâmetro de marcha dinâmica ao longo do estudo, o outro modelo não apresentou nenhuma resposta clara entre os dois membros posteriores, tanto para marchas como para parâmetros comportamentais relacionados com dor. Através de uma avaliação histológica, os autores confirmaram a presença de lesões de cartilagem articular em ambos os modelos, mas eram muito mais graves no modelo de monoiodoacetato de sódio. Concluíram que o modelo de monoiodoacetato de sódio produz uma resposta à dor nos dias após a indução de uma forma dependente da dose, além disso, o padrão de comportamento temporal deste modelo está conhecido por ser bifásico, o que implica de uma fase de inflamação sinovial seguido por um aumento da resposta comportamental relacionada à dor dentro dos primeiros dias e uma segunda fase que ocorre após o 7º dia de indução resultante de mudanças estruturais na articulação associada à resposta relacionada com a dor, ou seja, o modelo pode ser mais apropriado para avaliação de estudos da dor, em curto prazo. FERREIRA-GOMES, ADÃES, SOUSA, MENDONÇA e CASTRO-LOPES (2012) avaliaram a expressão dose-dependente em marcadores de lesão neuronal com osteoartrite induzida por monoiodoacetato de sódio, onde afirmam que foi recentemente relatado que o modelo de monoiodoacetato de sódio está relacionado com mudanças nas inervações neuronais das articulações afetadas que são comumente interpretadas como uma resposta neuronal à lesão axonal. Avaliaram a expressão de marcadores neuronais e o crescimento de proteína associada GAP-43 em animais injetados com três doses diferentes de monoiodoacetato de sódio (0.3, 1 e 2mg) em medições feitas nos dias: 3, 7, 14, 21 e 31 pós injeção de

28 REVISÃO DE LITERATURA 26 monoiodoacetato de sódio. Os autores afirmam que os animais apresentaram alterações histopatológicas características das articulações e comportamento nociceptivo, além disso, foi detectado aumento da expressão de um marcador neuronal (ATF-3) nos três primeiros dias após a injeção de 1 ou 2mg de monoiodoacetato de sódio, após o dia 7 não houve grande aumento na expressão deste marcador nem de GAP-43. Concluíram que a expressão dos marcadores de lesões neuronais (ATF-3 e NPY), bem como um aumento da regulação da expressão de GAP-43 é indicativo de regeneração de fibra periférica, sugerindo que a lesão axonal é uma resposta à regeneração que pode estar acontecendo neste modelo de osteoartrite, o que abre novas perspectivas no entendimento da fisiopatologia da doença humana. MAPP, SAGAR, ASHRAF, BURSTON, SURI, CHAPMAN e WALSH (2013) fizeram um experimento comparativo, verificaram as diferenças estruturais e os fenótipos de dor em modelos experimentais de osteoartrite por indução com monoiodoacetato de sódio e transecção do menisco e afirmam que ambos os modelos apresentaram inflamação sinovial, condropatia e osteofitose. Os escores de inflamação e osteófitos apresentaram-se um pouco maior no modelo transecção do menisco, mas também estavam presentes no modelo de monoiodoacetato de sódio; já o modelo de transecção de menisco exibiu um maior número de canais que atravessam a junção osteocondral, enquanto o modelo de monoiodoacetato de sódio apresentou alodínea táctil mais consistente. Os autores afirmam, ainda, que ambos os modelos têm forte evidência de semelhança à osteoartrite humana, mas que as diferenças devem ser levadas em conta quando se estuda os aspectos específicos da doença humana. Contudo, diferem em aspectos importantes da patologia estrutural e comportamento de dor. Concluíram que ambos os modelos de indução, cirúrgico e químico são susceptíveis em contribuir para o comportamento da dor. O uso criterioso de modelos animais deve ajudar a elucidar não apenas mecanismos de doenças humanas, mas também informar sobre o desenvolvimento e utilização de novas drogas terapêuticas, e que os tratamentos que aliviam a dor em todos os modelos podem ter aplicabilidade mais generalizada à dor da artrite humana, enquanto aqueles cujos efeitos são específicos de cada modelo podem trazer importantes contribuições para o cuidado no futuro.

29 3 MATERIAL E MÉTODO

30 MATERIAL E MÉTODO 28 Este estudo foi realizado no Biotério da Universidade Federal do Maranhão e no Instituto de Pesquisas Médicas do Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia da Faculdade Evangélica do Paraná (FEPAR) no período de setembro de 2012 a março de Foram adotadas as Normas para Apresentação de Documentos Científicos da Universidade Federal do Paraná (2007) e utilizada a Nomina Anatomica Veterinaria (INTERNATIONAL COMMITTEE ON VETERINARY GROSS ANATOMICAL NOMENCLATURE, 2012). A execução da pesquisa foi realizada após ser submetida à apreciação ética do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Maranhão pelo protocolo de número 17315/ (ANEXO 1). Os procedimentos com os animais foram realizados de acordo com as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (PINHEIRO, FIORELLI e GOMES, 2009). 3.1 AMOSTRA A amostra foi constituída de 48 ratos Wistar (Rattus Novergicus) machos, adultos, com peso entre 230g e 280g, obtidos no Biotério da Universidade Federal do Maranhão. Os animais foram aclimatados por sete dias e albergados em condições controladas de umidade (45-65%), luz artificial em ciclos de 12 horas claro/escuro, em um ambiente com temperatura controlada (23 ± 2ºC) e com livre consumo de ração e água. 3.2 ALBERGAMENTO DOS ANIMAIS Os animais foram encaminhados para a sala de experimentação sete dias antes do início do experimento. Após o período de adaptação, foram pesados e distribuídos de forma randomizada em dois grupos de 24 ratos, de forma aleatória. Depois de adaptados durante uma semana, os animais foram submetidos a treinamentos diários e manuseados pelos experimentadores nos aparelhos de medição clínica, para adaptação destes, facilitando a avaliação da capacidade

31 MATERIAL E MÉTODO 29 motora e sensitiva após a lesão. Foram mantidos em grupos de seis ratos por gaiola de 40 x 60 cm. O experimento foi realizado no Laboratório de Pesquisa e Pós- Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Maranhão. 3.3 DIVISÃO DA AMOSTRA EM GRUPOS E SUBGRUPOS Os animais foram divididos em dois grupos, grupo controle (n=24) e grupo osteoartrite (n=24). O procedimento no grupo controle foi a injeção intra-articular de solução fisiológica a 0,9% e no grupo OA foi realizada a injeção intra-articular de monoiodoacetato de sódio. Cada grupo de ratos foi subdividido em quatro subgrupos. Os subgrupos do grupo controle foram denominados GC-7, GC-14, GC- 21 e GC-28. Os subgrupos do grupo OA, foram denominados GOA-7, GOA-14, GOA-21 e GOA-28. Essa subdivisão foi feita de acordo com o dia da avaliação clínica e eutanásia dos animais. As avaliações comportamentais foram realizadas no primeiro dia antes da indução da osteoartrite e nos animais do GC-28 e GOA-28 nos dias: 7 o, 14 o, 21 o e 28 o. A eutanásia dos animais dos subgrupos GC-7 e GOA-7 foi realizada no 7 o dia após indução da osteoartrite; dos subgrupos GC-14 e GOA-14 no 14 o dia, dos subgrupos GC-21 e GOA-21 no 21 o dia e dos subgrupos GC-28 e GOA- 28 no 28 o dia. As radiografias dos membros pélvicos e coleta da membrana sinovial foram realizadas no 7 o 14 o, 21 o e 28 o dia após a indução da osteoartrite, após a eutanásia dos animais (Figura 1) (Apêndice 1).

32 MATERIAL E MÉTODO 30 Ratos WISTAR (n=48) Injeção intra-articular de soro fisiológico grupo Controle Injeção intra-articular de monoiodoacetato de sódio grupo OA Avaliação clínica 1º, 7º, 14º, 21º e 28º dias Grupo Controle (n=24) Grupo OA (n=24) GC-7 Eutanásia 7º dia n=6 GC-14 Eutanásia 14º dia n=6 GC-21 Eutanásia 21º dia n=6 GC-28 Eutranásia 28º dia n=6 GOA-7 Eutanásia 7º dia n=6 GOA-14 Eutanásia 14º dia n=6 GOA-21 Eutanásia 21º dia n=6 GOA-28 Eutanásia 28º dia n=6 Radiografias 7 o, 14º, 21º e 28º dias Coleta da membrana sinovial 7 o, 14º, 21º e 28º dias FIGURA 1 - FLUXOGRAMA ILUSTRATIVO DO PROTOCOLO EXPERIMENTAL DE OSTEOARTRITE EXPERIMENTAL 3.4 INDUÇÃO DA OSTEOARTRITE Os ratos foram anestesiados com Tiopental, 40 mg/kg (Cristália, Brasil) intraperitoneal. Após perda do reflexo interdigital, foram submetidos à epilação na região dos joelhos e antissepsia local com iodopovidine a 10%.

33 MATERIAL E MÉTODO 31 Realizou-se a flexão do joelho direito a 90º, em seguida era realizada a punção intra-articular através do ligamento patelar utilizando-se uma agulha 26G, no espaço entre tíbia e fêmur (Figura 2). A técnica para injeção intra-articular foi feita palpando-se a tuberosidade anterior da tíbia, e, pouco acima, uma pequena depressão, local de injeção. A introdução da agulha é realizada até tocar a região intercondilar do fêmur. Neste momento, a agulha é levemente retraída, injetando-se a substância escolhida. Nos animais do grupo controle, houve injeção de 50 microlitros de soro fisiológico a 0,9% nos joelhos direito e esquerdo. Nos animais do grupo OA houve a injeção intra-articular de 2 miligramas de monoiodoacetato de sódio (SIGMA-ALDRICH) EUA, em um volume máximo de 50 microlitros de solução fisiológica 0,9%, no joelho direito (COMBE, BRAMWELL e FIELD, 2004; FERNIHOUGH et al., 2004). O joelho esquerdo recebeu igual volume de soro fisiológico a 0,9% para controle do próprio animal. FIGURA 2 - PUNÇÃO INTRA-ARTICULAR DO JOELHO ATRAVÉS DO TENDÃO PATELAR Avaliação da deambulação forçada (teste Rotarod)

34 MATERIAL E MÉTODO 32 Para a avaliação de atividade motora pela deambulação forçada utilizouse o rotarod (modelo IITC Life Science, Califórnia, Estados Unidos). O rotarod é constituído por uma caixa de acrílico aberta, dividida por espaços para o alocamento de cinco animais. Cada espaço é constituído por uma barra giratória, com velocidade regulável em rotações por minuto, diâmetro de 2,5 cm e 12 cm de comprimento, suspensa a 40 cm de altura em relação à base que é formada por pequenas pranchas que desligam automaticamente o contador digital de tempo com a queda dos animais da barra (Figura 3) (KALFF et al., 2010). FIGURA 3 ANIMAIS EM DEAMBULAÇÃO FORÇADA NO ROTAROD O animal é colocado sobre um cilindro rotatório que possui velocidade de rotação crescente sendo obrigado a andar de maneira contínua para evitar a queda. Eram colocados em grupo de cinco ratos, um em cada espaço, de modo aleatório, para que pudessem ser avaliados pelo mesmo observador. A avaliação do desempenho do animal fornece um índice de aprendizado motor e uso do membro afetado (SHIOTSUKI H et al., 2010; PINTO e KO, 2012). Os animais eram trazidos para a sala de experimentação e manipulados pelo experimentador antes do inicio dos testes. Depois foram mantidos sobre a barra rotatória desligada por 5 minutos, para habituação ao aparelho. Cinco minutos após o período de adaptação, os ratos foram novamente colocados sobre o rotarod e a velocidade de rotação foi aumentada de 5 a 35 rotações por minutos, num intervalo

35 MATERIAL E MÉTODO 33 de cinco minutos. A latência para queda dos animais foi medida automaticamente através de um sensor mecânico localizado na base do aparelho (CASTRO, 2006). Os primeiros resultados da avaliação da atividade motora dos animais ocorreram no dia 1, em todos os animais da amostra. E nos outros animais dos subgrupos sequencialmente nos dias: 7, 14, 21 e 28. A avaliação da deambulação forçada dos membros foi graduada. Utilizouse uma escala numérica que varia de 5 a 1, em que: 5- significa uso normal do membro; 4- claudicação leve; 3- claudicação grave; 2- intermitente desuso da pata afetada e 1- completo desuso da pata afetada (KALFF et al., 2010) Avaliação da incapacidade articular (teste Weight Bearing) Alterações na distribuição do peso entre os membros pélvicos direito (com osteoartrite) e esquerdo (sem osteoartrite), entre os animais do grupo controle e grupo OA, foram utilizadas como indicador de desconforto articular provocado pela indução da osteoartrite. O aparelho teste de incapacitância (modelo IITC Life Science, Califórnia, Estados Unidos), que se constitui em uma câmara de vidro tipo plexiglass cuja parte anterior tem uma inclinação de 45 graus faz com o que os ratos apoiem os membros torácicos na parte de cima desta e somente os membros pélvicos em duas pequenas plataformas inferiores, simulando a posição ortostática (FIGURA 4A e B). Estas plataformas são separadas, e, cada uma, contém um sensor conectado ao aparelho de medição, determinando a distribuição do peso que cada membro pélvico está exercendo sobre estas (BOVE et al., 2003; KALFF et al., 2010).

36 MATERIAL E MÉTODO 34 A B FIGURA 4 - DISTRIBUIÇÃO DO PESO EM PLATAFORMAS SEPARADAS NO WEIGHT BEARING (A e B) Antes de as medidas serem tomadas, aguardou-se um período de 5 minutos para os ratos se adaptarem ao aparelho, dando-se início apenas quando os ratos já se encontravam na posição correta (ambos os membros pélvicos sobre as plataformas e os membros torácicos sobre a rampa de plexiglass). Durante os testes, foram observadas e registradas as mudanças na distribuição de peso entre membros pélvicos direito e esquerdo (controle contralateral), para avaliar índice de desconforto no membro pélvico direito (FERNIHOUGH et al., 2004). O peso exercido sobre cada membro pélvico (mensurado em gramas) foi avaliado em um período de cinco segundos. A aferição final da distribuição do peso foi dada por uma média de três aferições. As alterações na distribuição do peso nos membros pélvicos foram calculadas da seguinte maneira (KALFF et al., 2010; STEVENSON et al., 2011): Peso sobre o membro afetado Distribuição de peso (%) = 100 Peso sobre o membro afetado Peso sobre o membro contralateral Sendo que o membro afetado é sempre o lado direito.

37 MATERIAL E MÉTODO Avaliação da alodínea táctil (teste de Von Frey) A alodínea táctil foi avaliada por meio de um analgesímetro digital (modelo Insight EFF 302, São Paulo, Brasil), que consiste em um transdutor de pressão conectado a um contador digital de força expressa em gramas. O aparelho é calibrado para registrar uma força máxima de 150 g, mantendo a precisão de 0,1 g até a força de 80 g. O contato do transdutor de pressão com o membro pélvico dos animais foi realizado por meio de uma ponteira descartável de polipropileno com 0,5 mm de diâmetro adaptada a este (VIVANCOS et al., 2004). Os animais foram colocados em caixas individuais de acrílico transparente, medindo 12x20x17cm cujo assoalho consiste de uma rede de malha igual a 5 mm² constituída de arame não maleável de 1mm de espessura, durante 15minutos antes do experimento para adaptação ao ambiente. Espelhos foram posicionados 25 cm abaixo das caixas de experimentação para facilitar a visualização da região plantar dos membros pélvicos dos animais. O experimentador aplicou, por entre as malhas da rede, uma pressão linearmente crescente no centro da região plantar do membro pélvico do rato até o animal produzir uma resposta caracterizada como sacudida ( flinch ) do membro pélvico estimulado (FIGURA 5A e B). Os estímulos foram repetidos por até seis vezes, nos membros pélvicos ipsilateral e contralateral, até o animal apresentar três medidas similares com uma clara resposta de flinch, após a retirada do membro pélvico (FERNIHOUGH et al., 2004). A B FIGURA 5 - PONTA DO APARELHO DE VON FREY ESTIMULANDO O MEMBRO PÉLVICO ENTRE AS MALHAS DA REDE (A e B)

38 MATERIAL E MÉTODO 36 O limiar nociceptivo foi definido como o percentual de força para provocar uma suspensão ativa no membro pélvico ipsilateral afetado e determinado da seguinte maneira (KALFF et al., 2010): Limiar nociceptivo do membro afetado Limiar nociceptivo (%) = 100 Limiar nociceptivo do membro afetado+limiar nociceptivo do membro contralateral 3.5 AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA A avaliação radiográfica dos joelhos dos ratos foi realizada após procedimento da eutanásia, que ocorreu com a injeção de 150 mg de tiopental sódico (Cristália, Brasil) por via intraperitoneal, conforme resolução número 714 de 20 de Junho de 2002, do Conselho Federal de Medicina Veterinária. Utilizou-se um aparelho de radiografia de uso odontológico em filme periapical. As imagens radiográficas foram feitas com o aparelho Spectro II, Dabi Atlante com os seguintes parâmetros: distância foco-filme de 20 cm, tempo de exposição de 0,8 segundos, diferença de potencial de 70 kv, amperagem de 10 ma (MORAES et al., 2005). As radiografias foram feitas nos dias 7, 14, 21 e 28, nos subgrupos animais, GC-7, GOA-7, GC-14, GOA-14, GC-21, GOA-21, GC-28 e GOA-28 em posição dorsoplantar após eutanásia dos animais. A revelação foi realizada pela técnica tempo-temperatura sempre utilizando soluções recém-preparadas, de acordo com as normas do fabricante. O posicionamento dos animais foi feito de modo que os joelhos ficassem em extensão completa. Após secagem dos filmes, foi criado um banco de imagens que, em seguida, foi analisado por um radiologista, sem o conhecimento da articulação e subgrupo animal avaliado. Estudou-se a alteração do espaço articular, esclerose subcondral e formação osteofitária. Para classificação da osteoartrite através das alterações radiológicas foi utilizada a escala proposta por (KELLGREN e LAWRENCE, 1957) que varia de 0 a 4, onde: 0 = sem sinais de osteoartrite; 1 = osteófito mínimo de significado duvidoso; 2 = osteófito definido e espaço articular preservado; 3 = osteófito e moderada redução do espaço articular; 4 = importante redução do espaço articular e esclerose subcondral. Todas as radiografias foram avaliadas por um radiologista experiente, mas sem conhecimento dos grupos.

39 MATERIAL E MÉTODO COLETA DA MEMBRANA SINOVIAL E ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA Após eutanásia e avaliação radiográfica, os animais foram colocados em decúbito dorsal. Com uma pinça de dente tipo Adssen, levantou-se a pele e o subcutâneo, sendo retirados em um bloco único com uma tesoura, deixando todo o tendão patelar e a face anterior da articulação expostos (FIGURA 6A). Rebatia-se proximalmente o tendão patelar da porção inferior na sua inserção na tuberosidade anterior da tíbia junto com a patela para cima (FIGURA 6B). Com auxílio de um bisturi lâmina 15, foi feita a artrotomia que permitiu a identificação da membrana sinovial e, em seguida, sua ressecção em bloco (FIGURA 7A e B). Depois de retirada da cápsula avaliava-se o aspecto da lesão macroscópica ao nível da cartilagem articular (FIGURA 8). Após a retirada, as membranas sinoviais foram fixadas em formol tamponado a 10%. Em seguida foram descalcificadas em solução de ácido fórmico a 5% por 72 horas. As amostras foram desidratadas em séries de etanol e embebidas em parafina, sendo realizados cortes de 4μ, montadas em lâmina e, posteriormente, corados com hematoxilina-eosina. A inflamação foi caracterizada como expansão da membrana sinovial por edema líquido de natureza proteica e fibrina com infiltração de macrófagos, neutrófilos, plasmócitos e linfócitos. Para avaliar o grau de inflamação sinovial foi utilizado o seguinte sistema de graduação: grau 0 sem inflamação; grau 1: inflamação mínima; grau 2: inflamação leve; grau 3: inflamação moderada; e grau 4: inflamação acentuada (GERWIN et al., 2010). Todas as amostras foram avaliadas por um mesmo patologista, sem conhecimento do animal e joelho (Apêndice 2).

40 MATERIAL E MÉTODO 38 A B FIGURA 6 INCISÃO E RESSECÇÃO DE FLAP DA PELE E VISUALIZAÇÃO DO TENDÃO PATELAR (A) DESINSERÇÃO PROXIMAL DO MESMO (B) INDICADOS PELAS SETAS A B FIGURA 7 ARTROTOMIA DO JOELHO (A) E RESSECÇÃO DA MEMBRANA SINOVIAL (B) INDICADOS PELAS SETAS

41 MATERIAL E MÉTODO 39 A B FIGURA 8 COMPARAÇÃO ENTRE JOELHOS, GRUPO CONTROLE ASPECTO NORMAL (A) E COM OSTEOARTRITE GRUPO OSTEOARTRITE ONDE APÓS RESSECÇÃO DA CÁPSULA PODE-SE VER LESÃO CONDRAL (B) INDICADA PELA SETA 3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA A comparação das médias de diferentes grupos experimentais foi realizada através do Teste de Mann-Whitney para as variáveis qualitativas ordinais e com teste T de Student para as variáveis numéricas. O valor de p <0,05 foi considerado como indicativo de significância e os dados obtidos foram analisados, utilizando-se do software GraphpadIn Stat (GraphPad software, San Diego).

42 4 RESULTADOS

43 4 RESULTADOS PROCEDIMENTO CIRÚRGICO As cirurgias transcorreram de maneira programada, com anestesia satisfatória para o tempo da realização dos procedimentos. A punção articular para indução da osteoartrite durou, em média, cinco minutos e a coleta da membrana sinovial foi de mais ou menos quinze minutos. Todos os animais apresentaram um bom estado de saúde ao longo do experimento, sem sinais de estresse físico e de comportamento doloroso espontâneo. Não houve óbito durante o seguimento. 4.2 AVALIAÇÃO NA DEAMBULAÇÃO FORÇADA (TESTE ROTAROD) Todos os ratos do grupo controle tiveram uma avaliação semelhante nos 1 o, 7 o, 14 o, 21 o e 28 o dias, sendo a deambulação forçada avaliada pelo grau 5 para a maioria (TABELA 1). Após a injeção de monoiodoacetato de sódio, os animais do grupo OA apresentaram uma redução significante do escore de marcha quando comparados ao grupo controle, com diferença de 1 ponto no escore de marcha que se manteve nas análises subsequentes do 7 o ao 14º dia do experimento. A partir do 21º dia até o 28º, os animais dos dois grupos avaliados clinicamente apresentaram marcha semelhante. Na comparação entre grupos controle e OA, no 1º dia sem alteração, houve diferença estatisticamente significante nos dias 7 o (p=0,0018) e 14 o (p=0,0067) do experimento. Nos dias 21 o (p=0,174) e 28 o (0,275), não houve diferença entre os grupos. A média do grupo controle foi 4,97 e do grupo OA de 4,53. Nas Tabelas 1 e 2 e Gráfico 1 observam-se os dados de cada animal do início ao fim do experimento:

44 4 RESULTADOS 42 TABELA 1 - AVALIAÇÃO DO GRUPO CONTROLE PELA DEAMBULAÇÃO FORÇADA TESTE ROTAROD Grupo Controle Dias Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6 Média , , , , ,0 Média 4,97 TABELA 2 - AVALIAÇÃO DO GRUPO OA PELA DEAMBULAÇÃO FORÇADA TESTE ROTAROD Grupo OA Dias Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6 Média , , , , ,0 Média 4,53 GRÁFICO 1 - MOSTRANDO AS MÉDIAS E ERROS-PADRÃO DO GRUPO CONTROLE E GRUPO OSTEOARTRITE LONGO DO EXPERIMENTO PELO TESTE ROTAROD Legenda: *Indica diferença significante do grupo OA em relação ao grupo controle. Nota: Teste de Mann-Whitney (p <0,05). Os símbolos e linhas verticais indicam ± erro padrão das médias.

45 4 RESULTADOS AVALIAÇÃO DA INCAPACIDADE ARTICULAR (TESTE WEIGHT BEARING) Os animais do grupo controle tiveram apoio simétricos em ambos os membros pélvicos do início ao fim do experimento com média final de 50,96 demonstrando ausência de desconforto articular. Após a injeção de monoiodoacetato de sódio, os animais do grupo OA passaram a apresentar sinais de desconforto articular, distribuindo o peso predominantemente sobre o membro pélvico saudável (lado esquerdo). De forma geral, as alterações provocadas na distribuição de peso sobre os membros pélvicos seguiram uma distribuição bifásica. Na primeira fase, houve uma redução acentuada do peso colocado sobre o membro pélvico afetado, tendo seu efeito máximo no 7º dia pós-indução (p=0,0001). Este período se resolveu até o 14º dia de experimento quando os animais do Grupo OA mostraram uma distribuição de peso sobre a pata afetada de 40%. Na segunda fase, que se inicia a partir do 21º dia, a assimetria na distribuição de peso volta a se acentuar com valores que variam de 33 a 35% e não se resolve até o fim do experimento com uma média final de 37,45. Na comparação entre grupos, no 1º dia sem alteração entre os grupos, houve diferença no 7º dia (p<0,0001), 14º (p=0,0165), 21º (p<0,0001) e 28º (p=0,0001), sendo mais expressiva no 7º dia de experimento. Nas Tabelas 3 e 4 e Gráfico 2 observam-se os dados de cada animal do início ao fim do experimento:

46 4 RESULTADOS 44 TABELA 3 - RESULTADO DA INCAPACIDADE ARTICULAR DOS MEMBROS PÉLVICOS NOS ANIMAIS DO GRUPO CONTROLE PELO TESTE DE WEIGHT BEARING Grupo Controle Dias Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6 Média 1 49,61 50,99 51,34 51,78 48,94 51,45 50, ,64 55,20 47,05 43,50 49,20 50,67 49, ,65 52,38 58,64 50,98 51,92 52,22 53, ,59 53,84 52,09 51,37 50,61 49,81 51, ,99 51,36 50,61 48,59 51,47 50,41 50,57 Média 50,96 TABELA 4 - RESULTADO DA INCAPACIDADE ARTICULAR DOS MEMBROS PÉLVICOS NOS ANIMAIS DO GRUPO OA USANDO O TESTE WEIGHT BEARING Grupo OA Dias Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6 Média 1 51,42 49,53 49,56 55,21 46,77 55,04 51, ,49 25,09 23,32 30,54 23,31 27,62 26, ,90 52,83 27,17 35,77 44,89 50,79 40, ,43 33,12 32,00 38,02 33,33 35,03 33, ,88 30,42 34,43 41,85 33,05 28,67 35,38 Média 37,45 As médias e erros-padrão de cada grupo ao longo do experimento estão representados no Gráfico 2:

47 4 RESULTADOS 45 GRÁFICO 2 - MOSTRANDO AS MÉDIAS E ERROS-PADRÃO DO GRUPO CONTROLE E GRUPO OSTEOARTRITE LONGO DO EXPERIMENTO PELO TESTE WEIGHT BEARING Legenda: *Indica diferença significante do grupo controle em relação ao grupo OA Nota: Teste T de Student (p<0,05). Os símbolos e linhas verticais indicam a média ± erro padrão das médias 4.4 AVALIAÇÃO DA ALODÍNEA TÁCTIL (TESTE VON FREY) Quando estimulados pela ponta de Von Frey, os animais do grupo controle apresentaram respostas parecidas do primeiro até o último teste, demonstrando ausência de alodínea táctil entre os membros pesquisados com uma média final de 49,80. A injeção de monoiodoacetato de sódio induziu alodínea táctil nos animais, conforme demonstrou o limiar nociceptivo de retirada da pata dos animais do grupo AO, em todos os dias do estudo a média final foi de 37,66. A maior alteração provocada pelo monoiodoacetato de sódio foi observada no 7º dia de experimento (p< 0,0001). A partir do 14º dia, o limiar nociceptivo de retirada da pata do grupo OA volta a aumentar, mas se mantém ainda abaixo do grupo Controle, permanecendo assim até o fim do experimento. Na comparação entre grupos, no 1º dia sem alterações e houve diferença no 7º (p<0,0001), 14º (p=0,0046), 21º (p<0,0001) e 28º (p=0,0001) (TABELAS 5 e 6 e GRÁFICO 3).

48 4 RESULTADOS 46 TABELA 5 - RESULTADOS DO GRUPO CONTROLE QUANDO ESTIMULADO PELO TESTE DE VON FREY Grupo Controle Dias Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6 Média 1 50,00 48,84 46,42 50,90 50,00 49,57 49, ,95 53,03 50,42 50,33 47,68 57,56 50, ,27 49,39 50,42 50,00 50,72 50,42 49, ,86 51,14 49,70 49,15 50,00 50,00 49, ,00 50,00 48,57 51,72 50,00 49,00 49,88 MÉDIA 49,80 TABELA 6 - RESULTADOS DO GRUPO OA QUANDO ESTIMULADO PELO TESTE DE VON FREY Grupo OA Dias Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6 Média 1 50,16 48,99 50,72 50,70 50,00 49,57 50, ,26 25,93 20,70 34,21 27,71 16,50 25, ,59 33,33 42,25 36,95 37,19 50,00 39, ,34 36,36 34,29 33,86 33,33 25,00 32, ,79 36,05 40,27 40,79 39,85 42,31 40,01 Média 37,66 GRÁFICO 3 MOSTRANDO AS MÉDIAS E ERROS-PADRÃO DO GRUPO CONTROLE E GRUPO OSTEOARTRITE LONGO DO EXPERIMENTO PELO TESTE VON FREY Legenda: *Indica diferença significante do grupo controle em relação ao grupo OA Nota: Teste T de Student (p<0,05). Os símbolos e linhas verticais indicam a média ± erro padrão das médias

49 4 RESULTADOS AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA Os animais do grupo controle não apresentaram alterações radiográficas na primeira semana do experimento, mas nas últimas semanas alguns animais apresentaram leves modificações radiológicas na articulação estudada, com média final de 0,5 sem significância. Na primeira semana os animais do grupo OA não apresentaram sinais de lesão articular pelas radiografias, já no 14 o dia houve alterações significantes, mantendo-se até o fim do experimento, obtendo média final de 2,75, podendo ser vistas nas Tabelas 7 e 8 e Figuras 9 a 12. Na comparação entre grupos, não houve diferença no 7º dia, e houve diferença significativa no 14º (p=0,0063), 21º (p=0,0049) e 28º (p=0,0063). Nas Tabelas 7 e 8 e Gráfico 4 observam-se os dados de cada animal do início ao fim do experimento: TABELA 7 - RESULTADOS DA AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA NO GRUPO CONTROLE Grupo Controle Dias Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6 Média , , , ,5 Média 0,5 TABELA 8 - RESULTADOS DA AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA DO GRUPO OA Grupo OA Dias Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6 Média , , ,6 S ,8 Média 2,75

50 4 RESULTADOS 48 GRÁFICO 4 MOSTRANDO AS MÉDIAS E ERROS-PADRÃO DA AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA ENTRE OS GRUPOS CONTROLE E OSTEOARTRITE Legenda: *Indica diferença significante do grupo OA em relação ao grupo controle. Nota: Teste de Mann-Whitney (p<0,05). Os símbolos e linhas verticais indicam ± erro padrão das médias A B FIGURA 9 - ASPECTO RADIOGRÁFICO 7º DIA. NORMAL A DIREITA GRUPO CONTROLE (A) E A ESQUERDA GRUPO OSTEOARTRITE (B) A

51 4 RESULTADOS 49 B FIGURA 10 - ASPECTO RADIOGRÁFICO 14º DIA DE EVOLUÇÃO ONDE SE PODE VER GRUPO CONTROLE À DIREITA JOELHO NORMAL (A) E À ESQUERDA GRUPO OA COM SINAIS DE OSTEOARTRITE (B) INDICADA PELA SETA A B FIGURA 11 - ASPECTO RADIOGRÁFICO DA 21º DIA DE EVOLUÇÃO DO GRUPO CONTROLE: A DIREITA NORMAL (A) E ALTERAÇÕES COM SINAIS DE OSTEOARTRITE NO GRUPO OA A ESQUERDA (B) INDICADAS PELA SETA

52 4 RESULTADOS 50 A B FIGURA 12 - ASPECTO RADIOGRÁFICO DO 28º DIA JOELHO LADO DIREITO GRUPO CONTROLE COM INÍCIO DE OSTEOARTRITE (A) E NO LADO ESQUERDO GRUPO OA LESÃO GRAVE DESTRUIÇÃO DOS CÔNDILOS FEMORAIS (B) INDICADOS PELA SETA

53 4 RESULTADOS ANÁLISE MICROSCÓPICA O estudo da membrana sinovial através da microscopia no grupo controle não mostrou alterações em nenhum dos animais do início ao fim da pesquisa com média final de zero. A injeção de monoiodoacetato de sódio induziu alterações histopatológicas na membrana sinovial do grupo OA desde a primeira até a última semana, sendo mais expressiva no 14º dia e uma média final de 1,3. Na comparação entre grupos, houve diferença significativa no 7º dia (p=0,0049), 14º (p=0,0025), 21º (p=0,0025) e 28º (p=0,0035). Nas Tabelas 9 e 10 e gráfico 5 observam-se os dados de cada animal do início ao fim do experimento. As Figuras de 13 a 16 mostram as lâminas que podem ser vistas sequenciadas em semanas. TABELA 9 - RESULTADO DA ANÁLISE MICROSCÓPICAS DAS MEMBRANAS SINOVIAIS DO GRUPO CONTROLE Grupo Controle Dias Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6 Média , , , ,0 Média 0,0 TABELA 10 - RESULTADO DA ANÁLISE MICROSCÓPICAS DAS MEMBRANAS SINOVIAIS DO GRUPO OA Grupo OA Dias Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6 Média , , , ,83 Média 1,3

54 4 RESULTADOS 52 GRÁFICO 5 MOSTRANDO AS MÉDIAS E ERROS-PADÃO DA AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA ENTRE OS GRUPOS CONTROLE E OSTEOARTRITE Legenda: *Indica diferença significante do grupo OA em relação ao grupo controle. Nota: Teste de Mann-Whitney (p<0,05). Os símbolos e linhas verticais indicam ± erro padrão das médias A B FIGURA 13 - FOTOMICROGRAFIA DA MEMBRANA SINOVIAL DO JOELHO DE RATOS WISTAR GC7. TECIDO NORMAL (A) E GOA7 INFILTRADO INFLAMATÓRIO (B) COLORAÇÃO HEMATOXILINA-EOSINA INDICADOS PELA SETA

55 4 RESULTADOS 53 A B FIGURA 14 - FOTOMICROGRAFIA DA MEMBRANA SINOVIAL DO JOELHO DE RATOS WISTAR GC14 TECIDO NORMAL (A) E GOA14 PROCESSO INFLAMATÓRIO AGUDO (B) COLORAÇÃO HEMATOXILINA-EOSINA INDICADOS PELA SETA A B FIGURA 15 - FOTOMICROGRAFIA DA MEMBRANA SINOVIAL DO JOELHO DE RATOS WISTAR GC21 TECIDO NORMAL E GOA21 ALTERAÇÕES INFLAMATÓRIAS (B) COLORAÇÃO HEMATOXILINA-EOSINA INDICADA PELA SETA A B

56 4 RESULTADOS 54 FIGURA 16 - FOTOMICROGRAFIA DA MEMBRANA SINOVIAL DO JOELHO DE RATOS WISTAR GC28 TECIDO NORMAL (A) E GOA28 COM PROCESSO INFLAMATÓRIO (B) COLORAÇÃO HEMATOXILINA-EOSINA INDICADO PELA SETA