UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS CENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO CURSO DE BIOTECNOLOGIA DISCIPLINA DE GENÔMICA II.

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS CENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO CURSO DE BIOTECNOLOGIA DISCIPLINA DE GENÔMICA II SNPs e APLICAÇÕES

2 NÃO É ESTÁTICO constantemente sujeito a mudanças MUTAÇÕES

3 MUTAÇÕES Alterações no DNA germinativas somáticas

4 Mutações espontâneas Mutações induzidas agentes mutagênicos

5 Mutações cromossômicas: mudanças na estrutura ou no número de cromossomos Mutações gênicas: mudanças em um ou poucos nucleotídeos

6 MUTAÇÕES GÊNICAS Inserções e Deleções

7 Substituições de bases envolvem a substituição de, normalmente, uma única base casos raros: várias bases são substituídas

8 SNPs Single Nucleotide Polymorphism Polimorfismos de base única Frequência de mais de 1% na população

9 Sequenciamento do Genoma Humano 2 milhões de SNPs

10 G para C comum variante

11 C T A DNA SNP T para A C A A mrna GAU GUU G A U Códon no RNA GAU para GUU G U U Aspartato Aminoácido Aspartato para Valina Valina Mudança na proteína

12 MUTAÇÃO SINÔNIMA Substituição resulta em um novo códon que codifica o MESMO aminoácido MUTAÇÃO NÃO SINÔNIMA Substituição resulta em um novo códon que codifica um aminoácido DIFERENTE

13 MUTAÇÃO SILENCIOSA Códon que especifica um aminoácido é substituído por um códon de terminação

14 IMPORTÂNCIA Combustível que dirige a evolução Causas de anormalidades Suscetibilidade a doenças

15 MESTRADO

16 Variantes polimórficas 2029C>T e 2258G>A no gene que codifica para o TLR2 humano: avaliação de uma população brasileira e revisão sistematizada PPG EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR Mestranda HELENA STRELOW THUROW Orientadora Profa. Dra. Clarice Alho

17 SEPSE Problema de saúde pública Infecção Generalizada

18 SIRS Sepse sucesso agravamento + Infecção - taquipnéia - taquicardia Recuperação - leucocitose ou leucopenia Buras et al., febre ou hipotermia Danos Irreversíveis/Morte

19 18 milhões de casos de sepse por ano

20 SEPSE Condição frequente Alto índice de mortalidade Elevado custo do tratamento Marcadores Moleculares

21 Receptores PRR Carpenter et al., 2007 Toll-like Receptors Papel chave no início da imunidade inata Reconhecimento de PAMPs bactérias, vírus, fungos Família de pelo menos 12 receptores Receptores com elevada especificidade

22 Texereau et al., 2005

23 cromossomo 4 locus 4q

24 Dois SNPs têm sido relacionados ao aumento do risco de infecção. Modelos animais sugerem que uma sinalização defeituosa do TLR2 é um fator para o aumento na susceptibilidade a doenças bacterianas. Texereau et al., 2005

25 2029C>T (Arg677Trp) Citosina para Timina no nucleotídeo 2029 Arginina para Triptofano no aminoácido 677 Lepra Lepromatosa [Kang et al., 2001; Kang et al., 2004] Tuberculose [Bem-Ali et al., 2004]

26 Dois SNPs têm sido relacionados ao aumento do risco de infecção. Modelos animais sugerem que uma sinalização defeituosa do TLR2 é um fator para o aumento na susceptibilidade a doenças bacterianas. Texereau et al., 2005

27 2258G>A (Arg753Gln) Guanina para Adenina no nucleotídeo 2258 Arginina para Glutamina no aminoácido 753 Risco para sepse após infecção por bactérias Gram-positivas [Lorenz, et al., 2000].

28 Tuberculose [Ogus, et al., 2004]; Restenose [Hamann, et al., 2005]; Doença de Lyme [Schröder, et al., 2005]; Febre Reumática Aguda [Berdeli, et al., 2005]; Transplante de fígado [Eid et al., 2007] Infecções bacterianas [Kutukculer et al., 2007] Infecção do trato urinário [Tabel et al., 2007]

29 OBJETIVOS Realizar um estudo associativo entre os SNPs 2029C>T e 2258G>A do gene do TLR2 e a suscetibilidade à sepse e/ou aos desfechos críticos a partir da sepse Realizar uma análise da possibilidade de aplicação clínica da genotipagem dos polimorfismos 2029C>T e 2258G>A do gene do TLR2 como marcadores da sepse

30 ESTUDOS DOS PACIENTES

31 ESTUDOS DOS PACIENTES Pacientes da UTI do Hospital São Lucas da PUCRS (2004 a 2006) Extração de DNA a partir de sangue 422 pacientes críticos admitidos na UTI Máximo de internação: 242 dias Comitê de Ética da PUCRS

32

33 Qual segmento do DNA será amplificado e sequenciado?

34 Gene TLR2 - cromossomo 4 locus 4q ctgtgccacc gtttccatgg cctgtggtat atgaaaatga tgtgggcctg gctccaggcc 2101 aaaaggaagc ccaggaaagc tcccagcagg aacatctgct atgatgcatt tgtttcttac 2161 agtgagcggg atgcctactg ggtggagaac cttatggtcc aggagctgga gaacttcaat 2221 ccccccttca agttgtgtct tcataagcgg gacttcattc ctggcaagtg gatcattgac 2281 aatatcattg actccattga aaagagccac aaaactgtct ttgtgctttc tgaaaacttt 2341 gtgaagagtg agtggtgcaa gtatgaactg gacttctccc atttccgtct ttttgatgag 2401 aacaatgatg ctgccattct cattcttctg gagcccattg agaaaaaagc cattccccag 2461 cgcttctgca agctgcggaa gataatgaac accaagacct acctggagtg gcccatggac 2521 gaggctcagc gggaaggatt ttgggtaaat ctgagagctg cgataaagtc ctaggttccc 2581 atatttaaga ccagtctttg tctagttggg atctttatgt cactagttat agttaagttc 2641 attcagacat aattatataa aaactacgtg gatgtaccgt catttgagga cttgcttact 2029 C (Arg677): cgg 2258 G (Arg753): cgg 2029 T (Trp677): tgg 2258 A (Gln753): cag vermelho: primer FORWARD azul: primer REVERSE verde: códon da Arg677Trp amarelo: códon da Arg753Gln roxo: fragmento de 340pb

35 Realizar um estudo associativo entre os alelos 2029T e 2258A do gene do TLR2 e a suscetibilidade à sepse e/ou aos desfechos críticos a partir da sepse Realizar uma análise da possibilidade de aplicação clínica da genotipagem dos polimorfismos 2029C>T e 2258G>A do gene do TLR2 como marcadores da sepse

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37 2029C>T (Arg677Trp) 2258G>A (Arg753Gln)

38 Reverse Forward Reverse Forward A ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, Perkin-Elmer, USA B MegaBase 1000 capillary DNA sequencer, Amersham Biosciences, UK Análise do genótipo do SNP 2029C>T por sequenciamento

39 2029C>T (Arg677Trp) 2029CC = (421/422) 2029C = 0.99 (843/844) 2029CT = (1/422) 2029T = 0.01 (1/844) 2029TT = G>A (Arg753Gln) 2258GG = 1 (422/422) 2258G = 1 (844/844) 2258GA = A = AA = 0 Não foi possível realizar análise da possibilidade de aplicação clínica da genotipagem dos polimorfismos como marcadores da sepse

40 Os resultados da genotipagem não suportam uma aplicação clínica dos alelos dos SNPs do TLR2 SNPs 2029C>T e 2258G>A não são bons marcadores genéticos no estudo da sepse na nossa população.

41 DOUTORADO

42 Prevalência dos polimorfismos oncogênicos dos éxons 4 a 8 do gene da p53 no banco de DNA da coorte de 1982, Pelotas RS e fatores de risco Doutoranda HELENA STRELOW THUROW Orientadora FABIANA KÖMMLING SEIXAS

43 COORTE Grupo de indivíduos que têm algo em comum ao serem reunidos e que são observados por um determinado período para que se possa avaliar o que ocorre com eles. Estudos raros Elevado custo Estudo da Coorte dos indivíduos nascidos na cidade de Pelotas no ano de 1982 Maior e mais longo estudo de coorte de nascimentos Acompanhamento desde o nascimento Informações sobre desenvolvimento e exposições

44 CÂNCER Crescimento desordenado de células que invadem os tecidos e órgãos Células agressivas e incontroláveis Tumores ORIGEM Equilíbrio entre a origem e a morte da célula é direcionado para uma proliferação incontrolada

45 BENIGNOS Crescimento localizado e sem invasão a tecidos adjacentes MALIGNOS Crescimento com invasão de tecidos próximos e espalhamento de metástases

46 ESTATÍSTICAS OMS CÂNCER principal causa MORTE milhões de mortes 13% de todos os óbitos 70% em países de média ou baixa renda Estimativa de 12 milhões de mortes no ano de 2030

47 Pulmão Estômago Fígado Colorretal Esôfago Próstata Mama Pulmão Estômago Colorretal Cervical

48 CAUSAS Fatores internos e externos ao organismo Fatores genéticos Fatores ambientais: radiação, dieta, tabaco Mutações na p53

49 GENE TP53 11 éxons e 10 íntrons 20 Kb cromossomo 17p13.1 P aminoácidos 53kD

50 p53 GUARDIÃO DO GENOMA

51 P53 Proliferação incontrolada Marca universal de tumores CÂNCER Desencadeado por mecanismos Mutações no gene TP53 Mutações em mediadores da P53

52 MUTAÇÕES NA P53 IARC International Agency for Research on Cancer mutações somáticas 423 mutações germinativas 2300 proteínas mutantes

53 95% DAS MUTAÇÕES 5% DAS MUTAÇÕES

54 CÓDON 72 Éxon 4 CCC PROLINA CGC ARGININA MUDANÇA NÃO CONSERVATIVA

55 80% das mutações Éxons 5 a 8 30% destas mutações Códons hot spots 70% destas mutações Mais de 200 códons

56 Mutações na p53 Metade de todos os cânceres Frequência de 5 a 50 % Eventos iniciais em tecidos premalinos

57 CÂNCER E P53 Câncer Colorretal Câncer Gástrico Câncer de Ovário Câncer de Mama Câncer de Bexiga Câncer de Pulmão

58 OBJETIVOS GERAL Identificar a freqüência de polimorfismos genéticos da p53, através de técnicas avançadas de Biologia Molecular, na Coorte de 1982 em uma população de adultos jovens que vem sendo estudada desde o nascimento em Pelotas, RS.

59 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Verificar a freqüência e o perfil dos genótipos do polimorfismo do códon 72 do gene da p53 no banco de DNA de indivíduos nascidos em 1982 incluídos na coorte Analisar os polimorfismos presentes nos éxons 4 a 8 do gene da p53 no banco de DNA de indivíduos nascidos em 1982 incluídos na coorte Relacionar os polimorfismos oncogênicos com fatores de riscos ambientais (tabagismo materno, crescimento uterino, amamentação, ganho de peso, tabagismo, álcool, drogas e dieta) durante exposições fetais, infância e aos 23 anos

60 METODOLOGIA

61 ORIGEM DOS INDIVÍDUOS Coorte de 1982 Indivíduos nascidos nas maternidades de Pelotas entre Janeiro e Dezembro de 1982, incluídos no banco de DNA do Centro de Pesquisas Epidemiológicas da UFPel

62 Genotipagem do polimorfismo do códon 72 do gene da p53

63 sangue DNA PCR eletroforese análise em gel de agarose 36 0 C 2h Clivagem ezimática digestão BstU I AciI SfcIou eletroforese análise em gel análise em gel de agarose

64 Tabela 1 Seqüências dos primers para a detecção do polimorfismo do códon 72 no éxon 4 Primer Seqüência* (5-3 ) Tamanho (bp) Referência 72S 72A TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC 199 Anschau et al., 2005 Tabela 2 Fragmentos do polimorfismo do códon 72 obtidos com a RFLP e seus respectivos genótipos Fragmentos Genótipos (pb) Pro/Pro Pro/Arg Arg/Arg 199 Sim Sim Não 113 Não Sim Sim 86 Não Sim Sim

65 Análise dos éxons 4-8 do gene da p53

66 sangue DNA PCR eletroforese análise em gel de agarose sequenciamento análises

67 Tabela 3 Sequências dos primers gerais dos éxons 4 a 8 do gene da p53. Tabela 3 Sequências dos primers gerais dos éxons 4 a 8 do gene da p53. Primer Seqüência* (5-3 ) Referência P53_4leftextPCR_F TGAGGACCTGGTCCTCTGAC Lehman et al., 1991 P53_4rightextPCR_R AGAGGAATCCCAAAGTTCCA Lehman et al., 1991 P53_4leftintSEQ_F TGCTCTTTTCACCCATCTAC Lehman et al., 1991 p53_4rghtintseq_r ATACGGCCAGGCATTGAAGT Lehman et al., 1991 P53_5/6PCR_F GCCGTGTTCCAGTTGCTTTA Verselis et al., 2000 P53_5/6PCR_R TAAGCAGCAGGAGAA AGCCC Verselis et al., 2000 P53_5/6SEQ_F TGTTCACTTGTGCCCTGACT Lehman et al., 1991 P53_5/6SEQ_R TTAACCCCTCCTCCCAGAGA Lehman et al., 1991 P53_7/8PCR_F CTTGCCACAGGTCTCCCCAA Lehman et al., 1991 P53_7/8PCR_R AGGCATAAC TGCACCCTTGGT Lehman et al., 1991 P53_7/8SEQ_F AGGCGCACTGGCCTCATCTT Lehman et al., 1991 P53_7/8SEQ_R TCCACCGCT TCT TGTCCTGC Bumroongkit et al., 2008

68 ANÁLISE DOS DADOS Exposições Fetais tabagismo materno na gestação e crescimento intra-uterino FATORES DE RISCO Infância amamentação e ganho de peso Aos 23 Anos tabagismo, álcool, drogas e dieta

69 RESULTADOS ESPERADOS Obtenção das freqüências do polimorfismo do códon 72 do gene da p53 Análise dos polimorfismos presentes nos éxons 4 a 8 do gene da p53 de DNA de indivíduos da coorte de 1982 Verificação da relação entre os polimorfismos dos éxons 4 a 8 do gene da p53 e fatores de riscos

70 BIOTECNOLOGIA O monitoramento das prevalências de mutações e perfis genéticos das populações promovido através da biotecnologia médica, oferece ferramentas no desenvolvimento de programas avançados de prevenção de riscos e na atenção à saúde baseados nos genomas e estudos de Coortes.

71 RESULTADOS

72 5 PCR PCR 11 Controle Negativo

73 PCR 5 PCR CLIVAGEM 11 ENZIMÁTICA Marc Kb GENÓTIPOS Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg Pro Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Pro Pro Pro Arg

74 PCR 5 PCR SEQUENCIAMENTO 11

75 PCR 5 Amostra PCR 11 1 Arginina/Arginina 1 Arginina Arginina

76 PCR 5 Amostra PCR 11 2 Prolina/Arginina 2 Prolina Arginina

77 PCR 5 Amostra PCR 11 9 Prolina/Prolina 9 Prolina Prolina

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