UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS CENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DISCIPLINA DE GENÔMICA FUNCIONAL. Ludmila Entiauspe
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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS CENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DISCIPLINA DE GENÔMICA FUNCIONAL Ludmila Entiauspe
2 O HPV Vírus que apresenta tropismo específico por células epiteliais e da mucosa Explora o maquinário celular do hospedeiro em seu favor Indução de tumores
3 O HPV Classificados por genótipos (10% do gene L1) 120 genótipos descritos 40 infecções anogenitais em homens e mulheres 15 CA Alto risco ou baixo risco (transformação neoplásica)
4 43 genomas completos seqüenciados
5 Infecções benignas Lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau (LSIL) Raramente há associações pré-malignas ou malignas HPV-6, 11, -42, -43 e % dos casos de verrugas genitais Papilomatose laríngea juvenil Papilomatose respiratória recorrente
6 Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau (HSIL) Carcinoma invasor de colo de útero HPV-16, -18, -26, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -58 Outros cânceres anogenitais Cabeça e pescoço Carcinoma epidermóide boca e orofaringe
7 Distribuição do HPV e genótipos no Brasil HPV-18 PA 63% HPV-33 Assintomáticas Citologia alterada NIC II e NIC III NIC III e CA RS 28% GO 76% HPV-58 SP 64% HPV-18 BA 78% MG 40% HPV-58
8 Aspectos sóciocomportamentais Demográficos Co-fatores virais Hormônios endógenos Fatores genéticos Fatores ligados à resposta imune
9 A co-infecção HPV/HIV ocorre em mulheres em todo o mundo. Estudos mostram um aumento na prevalência de infecção genital por HPV, lesão intra-epitelial ou câncer cervical em mulheres infectadas pelo HIV CDC incluiu o CA cervical entre as condições definidoras da AIDS
10 Mulheres HIV positivas tem aumento de 100 vezes na incidência de carcinoma da vulva e ânus Risco para CA cervical aumentado em 14 vezes Maior prevalência de infecção e lesões Mais graves Progressão rápida Difíceis de tratar Alta taxa de recorrência
11 Ciclo biológico do HPV
12 Condiloma acuminado Proliferação induzida pelo HPV Epitélio escamoso estratificado Região genital Perianal Boca Laringe Raramente progride em câncer
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14 Lesão intra-epitelial cervical A infecção ativa pelo HPV pode provocar mudanças nas células infectadas da cérvice uterina Neoplasias intra-epiteliais cervicais (NIC) Lesões precursoras do câncer cervical Maioria das lesões leve e moderada é propensa à regressão Persistência dos genótipos associada a lesões de alto grau
15 Lesão intra-epitelial cervical
16 Câncer cervical (CA cervical) Segunda malignidade mais comum em mulheres no mundo Estimativas mundiais relataram casos novos por ano de câncer de colo de útero 90% em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento
17 Estimativas para o Brasil em 2010: Incidência de casos Risco estimado de 18 casos a cada mulheres Estado do Rio Grande do Sul mulheres desenvolverão a doença Porto Alegre Incidência de 200/ mulheres
18 99,7% dos carcinomas apresentam DNA-HPV alto grau HPV-16, -18, -45, -31, -33, -52, -58 e % dos casos de CA cervical no mundo HPV-16: metade dos casos
19 Métodos de diagnóstico Clínico: Tríade clínica Citologia oncológica Colposcopia Histopatologia Identificação Molecular: Reação em cadeia da polimerase (PCR) Captura Híbrida (HC)
20 Centro de prevenção e controle de doenças (CDC): 5.5 milhões de pessoas são infectadas por HPV/ano 75% da população já foi infectado por HPV genital Prevalência entre 28-46% Idade inferior à 25 anos
21 90% dessas infecções Eliminadas espontaneamente pelo sistema imune dentro de 24 meses Prevalência da infecção clínica e subclínica é baixa 0,7-2,9% Maior entre jovens sexualmente ativos, entre 25 e 35 anos de idade
22 Vacinas contra o HPV Profiláticas Previnem a infecção por HPV e doenças associadas VLP (virus like particles) Terapêuticas Induzem a regressão das lesões ou remissão do CA cervical avançado Antígenos virais (E6 e E7)
23 Vacinas contra o HPV Brasil, agosto de 2006: Aprovação da vacina quadrivalente recombinante HPV-6, -11, -16 e -18 Meninas e mulheres de 9 a 26 anos de idade Proteção contra verrugas genitais e as lesões precursoras do câncer
24 Características Gerais do HPV Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus (ICTV) Família: Papillomaviridae Gênero: Papillomavirus Não envelopado DNA fita dupla circular 55 nm de diâmetro 8 kb
25 Biologia Molecular do HPV Genoma do HPV Regiões que codificam a proteína viral Filamento positivo Transcreve o mrna para 10 ORFs Precoce (E) Tardia (L)
26 Genoma do HPV-16 e arranjo das proteínas precoces (E) e tardias (L) HPV-16
27 Polimorfismo do p53 Códon 72 Arginina (CGC; Arg72) Prolina (CCC; Pro72) Arg/Arg p53 Arg/Pro p53 Pro/Pro p53
28 Polimorfismo do p53 Storey (1998) Genótipo Arg/Arg Genótipo Pro/Pro Risco 7 vezes Não apenas a infecção por HPV Mudança estrutural na p53 Seleção de mulheres com alto risco para CA
29 E6 E7 Forma integrada epissomal Instabilidade celular Mutações Anomalias neoplásicas Ação sobre p53 e prb
30 Propriedades Dano ao DNA G1 (gap) R (checkpoint stop) Checagem do estado do DNA M S (síntese) Replicação do DNA G2
31 Propriedades Dano ao DNA M G2 G1 (gap) R (checkpoint stop) Checagem do estado do DNA S (síntese) Replicação do DNA Ativação do p53 Inibidores de ciclina/cdk Mecanismos independentes de p53 p16 p27 p21 Ponto R (fase G1) Recuperação do DNA
32 Propriedades Dano ao DNA M G2 G1 (gap) R (checkpoint stop) Checagem do estado do DNA S (síntese) Replicação do DNA Ativação do p53 Inibidores de ciclina/cdk Mecanismos independentes de p53 p16 p27 p21 Ponto R (fase G1) Recuperação do DNA DNA recuperado DNA não-recuperado
33 Propriedades Dano ao DNA M G2 G1 (gap) R (checkpoint stop) Checagem do estado do DNA S (síntese) Replicação do DNA Ativação do p53 Inibidores de ciclina/cdk Mecanismos independentes de p53 p16 p27 p21 Ponto R (fase G1) Recuperação do DNA DNA recuperado DNA não-recuperado Apoptose
34 Propriedades Dano ao DNA M G1 (gap) R (checkpoint stop) Checagem do estado do DNA S (síntese) Replicação do DNA Ativação do p53 Inibidores de ciclina/cdk Mecanismos independentes de p53 p16 p27 p21 Ponto R (fase G1) Recuperação do DNA G2 Ciclina/CDK ativado Sinaliza célula a continuar DNA recuperado DNA não-recuperado Apoptose
35 Expressão gênica e câncer cervical p53 Apoptose na fase S do ciclo celular E6 Tumorigênese Regulação da transcrição Ativação da telomerase Retardo na diferenciação dos queratinócitos
36 Expressão gênica e câncer cervical G0 Rb E2F DP1 G1 G2 E7 Rb S E2F DP1 Transcrição
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39 Gharizadeh et al. (2001)
40 Sistema rápido, confiável e robusto Adequado para a triagem clínica de rotina com um grande número de amostras Facilmente adaptado para a automação de laboratório Também permite a detecção de um amplo espectro de HPV, incluindo putativos novos genótipos e mutações
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42 PreTect TM HPV-Proofer: Real time detection and typing of E6/E7 mrna from carcinogenic human papillomaviruses Prevalência de HPV Mulheres com CA Testes de DNA-HPV Baixa especificidade Região L1
43 PreTect TM HPV-Proofer: Real time detection and typing of E6/E7 mrna from carcinogenic human papillomaviruses PreTect TM HPV-Proofer PCR Real-time multiplex Vantagem de detectar mrna E6/E7 HPV oncogênicos HPV-16, -18, -31, -33 e -45 Monitorar persistência da infecção Identificar infecções HPV com potencial transformador
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45 Câncer cervical: genótipos oncogênicos de HPV e polimorfismo da p53 do códon 72
46 Prevalência da infecção pelo HPV Investigar dos genótipos presentes Determinar a prevalência de polimorfismo da p53 no códon 72
47 Polimorfismo da p53 Genótipos oncogênicos do HPV Maior risco para CA Risco agravado quando associado aos fatores sociodemográficos? Tem relação???
48 Dois momentos: Estudo transversal, composto por 1100 mulheres, no qual se buscará Investigar a prevalência de HPV, Genótipos mais freqüentes Presença do polimorfismo na p53 do códon 72 Associação entre polimorfismo da p53 e genótipos oncogênicos
49 Estudo de coorte Acompanhará pelos próximos dois anos, a cada seis meses, 100 pacientes HIV positivas, positivas para HPV sem alterações citopatológicas Investigar se a persistência da infecção por HPV, associada à mutação da p53 apresenta maior risco ao desenvolvimento de câncer cervical.
50 Serviço de Ginecologia Faculdade de Medicina / UFPel
51 Serviço de Ginecologia Faculdade de Medicina / UFPel FAMED / SAE Aplicação questionário padronizado Coleta de amostra secreção cervical Mulheres que buscarem atendimento nos serviços de Ginecologia (N = 1100) Acondicionamento das amostras Laboratório Genômica Funcional
52 Análise laboratorial Extração do DNA genômico Nested-PCR (npcr) Primers MY 09/11 Primers GP5+/6+ Região L1 do HPV Seqüenciamento dos genótipos do HPV PCR da p53 Éxon 4 Análise dos fragmentos de restrição (RFLP) da p53 Enzima Tha I - HELENA
53 Primers utilizados na amplificação do HPV e região amplificada (L1)
54 Alta a prevalência por HPV em mulheres na cidade de Pelotas Desconhecida no âmbito molecular Prevalência dos genótipos Tais determinações poderão contribuir como medidas de prevenção e controle da infecção.
55 DNA HPV 30% HIV negativas 90% HIV positivas Comportamento de risco compartilhado para ambas as infecções Susceptibilidade ao HPV devido ao comprometimento do sistema imune.
56 Alelos Arg/Arg Lesão intra-epitelial escamosa (SIL) Maior risco para o desenvolvimento de CA cervical
57 Espera-se que com os resultados apresentados Úteis no futuro Diagnóstico complementar ao citopatológico e colposcopia
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60 Figura 1
61 Figura 2
62 Figura 3
63 Figura 4
64 Figura 5
65 Figura 6 Figura 7
66 Figura 8
67 Figura 9
Papilomavirus humanos (HPV)
Papilomavirus humanos (HPV) - Capsídio icosaédrico de 55-60 nm, sem envoltório - 72 capsômeros pentaméricos formados por 2 proteínas (cinco cópias de L1 fora, 1 L2 dentro) - Família Papillomaviridae, gênero
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