Estratégias de análises proteômicas

Transcrição

1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz Estratégias de análises proteômicas Setembro de 2012 Minos E. Carvalho

2 Proteoma Genômica Transcriptômica Proteômica Metabolômica Proteoma é o equivalente protéico do genoma. WILKINS et al, 1996

3 Definições Expressão protéica; Proteômica comparativa; (Paralelo quantitativo com uma proteína padrão ou de um estado fisiológico) snapshots ; Spot de proteínas.

4 Código genético Seqüência de 3 nucleotídeos do DNA : códon A seqüência destes códons no DNA é copiada em RNAm Codifica um aminoácido, unidade básica da estrutura das proteínas A seqüência dos aminoácidos dá origem a diferentes proteínas

5 Códons

6 A importância das Proteínas Por serem: Fenômenos biológicos: Enzimas; Anticorpos; Hormônios; Componentes estruturais; Receptores celulares; Etc... Produção de energia; Defesa imunológica; Contração muscular; Atividade neuroquímica; Reprodução; Etc... Sousa et al.,1999.

7 As proteínas e biomarcadores...

8 Aplicações Avaliar proteínas expressas ou reprimidas: Efeito de fármacos; Condições patológicas; Diferenciação celular; Comparação de variedades da mesma espécie; Respostas celulares a estímulos externos diversos; etc...

9 Introdução Estudos Proteômicos Possibilita: Caracterizar panoramas protéicos; Identificar modificações de perfis protéicos; Buscar isoformas de proteínas; Modificações pós-traducionais. Bendixen, 2005; Pan et al., 2005.

10 Modificações Pós-Traducionais Fosforilação; Acetilação; Glicolisação; Sulfonação; Etc... Resíduos de aminoácidos fosforilados. (A)fosfoserina, (B) fosfotirosina e (C) fosfotreonina

11 Proteínas Moonlighting Apresentam mais de uma função dentro de uma mesma célula ou do mesmo organismo... Não podem ser produtos: diferentes processamentos de RNAs; de fusões de genes; da existência de isoformas.

12 Fosfoglucose isomerase, uma proteína moonlighting Catalisa o segundo passo da glicólise [a interconversão da glucose-6-fosfato (G6P) em frutose-6-fosfato (F6P)]. Em células tumorais podem causar o aumento na mobilidade de células tumorais.

13 Mapas protéicos 1 o proteoma completo foi reportado por Ghaemmaghami et al., 2003; Caracterizações em espécies de produção: Suínos: Lamestch et al., 2002; Bovinos: Bouley et al., 2004; Aves: Doherty et al., 2004.

14 Análise do mapa In silico Exemplo: Mapa protéico em suínos Estudo no pós abate (L. dorsi) LAMETSCH et al., 2003.

15 Procedimentos: Avaliação da expressão protéica Eletroforese Bi-Dimensional: 1ª Dimensão - Focalização isoelétrica Separação das proteínas por ponto isoelétrico; Ettan IPGphor (GE Healthcare) 2ª Dimensão - Corrida eletroforética Separação por massa molecular; Cuba de eletroforese

16 Avaliação da expressão protéica Análise do mapa In silico : Os géis 2-DE são analisados com o auxílio de softwares Exemplo: ImageMaster Platinum (Amersham Biosciences); Os spots : detectados e quantificados;

17 Procedimentos: Avaliação da expressão protéica Análise do mapa In silico : Os géis 2-DE são analisados; Os spots são: detectados e quantificados; intensidade dos spots estado protéico coloração identificação de proteínas BOULEY et al, 2004.

18 Procedimentos: Avaliação da expressão protéica Digestão in-gel das proteínas: Enzimas: Tripsina, Endoproteinase (Lys-C e Arg-C), Elastase, Quimotripsina, Pepsina e Pronase. Sequenciamento de peptídeos por LC-MS/MS

19 Espectros de Sequenciamentos Inten.(x100,000) m/z Inten.(x100,000) m/z

20

21 Espectro de Sequenciamento interpretado I/LMGAVGGAI/LQI/LW...

22 Bioinformática: Banco de dados e ferramentas

23 Bancos de Dados de proteínas mais utilizados em bioinformática Genbank: Banco de dados americano de seqüências de DNA e proteínas. PDB: Armazena estruturas tridimensionais resolvidas de proteínas. PIR: www-nbrf.georgetown.edu Banco de proteínas anotadas. SWISS-PROT: Armazena seqüências de proteínas e suas respectivas características moleculares, anotado manualmente por uma equipe de especialistas. INTERPRO: Banco de dados de famílias e domínios.

24 Objetivos dos dados gerados dos estudos proteômicos Esclarecer as proteínas envolvidas nas rotas metabólicas; Identificar novos alvos farmacológicos e marcadores biológicos relacionados ao estabelecimento do fenômeno ou progressão; Identificação de moléculas bioativas a extratos naturais; Caracterização de respostas celulares a novas drogas, doenças e ambientes.

25 Representação da distribuição funcional das proteínas no músculo Semitendinosus de bovinos Metabólicas (25,5%) Estruturais (17%) Sistema de Defesa (16%) Contráteis (14,5%) Outras (25,5%) Não identificadas (1,5%) % de proteínas identificadas BOULEY et al, 2004.

26 Dinâmica protéica Chaze, et al

27 Um potencial marcador Amostras L. dorsi: biopsia e 1h postmortem Força de cisalhamento: 7 dias 178 animais Extremos 13 animais A peroxiredoxina 6 pode ser um potencial marcador para maciez da carne bovina na análise protéica antes e logo após o abate. Jia et al, 2009.

28 Trabalho do Grupo de Biotecnologia Animal Dep. Zootecnia - ESALQ Estratégia Experimental: Expressão protéica dos valores extremos para maciez da carne 4% menor maciez (6 animais) 4% maior maciez (6 animais)

29 Informações descritivas dos extremos de força de cisalhamento Extremos Característica N MÉDIA DP 6 CV% 7 MIN MAX Menor FC Maior FC FC ,50 4 1,07 16,6 4,52 7,75 FC ,08 4 0,76 24,9 1,97 4,34 FC ,01 4 0,51 25,8 1,65 3,02 Espessura de Gordura 6 8,17 5 1,33 16,2 7,00 10,00 ph(24h) 6 5,57 0,16 2,8 5,38 5,85 FC ,34 4 1,43 15,4 7,22 11,60 FC ,58 4 0,77 10,2 6,30 8,43 FC ,58 4 1,55 27,7 3,54 7,49 Espessura de Gordura 6 6,17 5 2,40 38,8 4,00 10,00 ph(24h) 6 5,67 0,24 4,2 5,36 5,97 1 FC0 = força cisalhamento 24 horas pos abate, 2 FC7 = força cisalhamento com 7 dias de maturação, 3 FC14 = força cisalhamento com 14 dias de maturação, 4 valores em kgf/cm 2, 5 valor em milímitros, 6 DP=desvio padrão e 7 CV=coeficiente de variação

30 pi pi pi P M P M P M SDS-PAGE 2 º Dimensão Focalização Isoelétrica 1 º Dimensão Coomassie G- 250 Eletroforese - 2D I 6 I 2 Análise de Imagem Extração Proteínas Maceração Tecido

31 Análise do mapa In silico Software: ImageMaster Platinum (Amersham Biosciences) Análise da expressão diferencial Grupos comparativos da intensidades dos volumes (carne com maior maciez versus menor maciez)

32 Spots diferencialmente expressos ph : Complex III subunit 1 236: HSP : Alpha-actin-1 327: Beta-LG 122: Alpha-actin : Acyl-CoA binding domain cantaining protein : uncharacterized : Tropomyosin matchs 15 54: MLC1/MLC3 59: HSPB1 297: MLC2F 50: HSPB1 106: HSPB1

33 Identificação das proteínas Digestão in-gel das proteínas: Enzimas: Tripsina Sequenciamento de peptídeos MS/MS Laboratório Max Feffer Genética de Plantas Departamento de Genética - ESALQ-USP, Piracicaba, SP. SYNAPT G2 HDMS - Waters

34 Resultados Proteínas em maior expressão no grupo de maior maciez da carne Spot Identificação Score Massa (KDa) teórica/aparente Acesso Uniprot Expressão no menor força de cisalhamento 50 Heat shock protein beta ,39/21 Q3T Heat shock protein beta ,39/34 Q3T Actin, alpha skeletical muscle ,05/36 P Uncharacterized protein ,35/37 F1MBK8 327 Beta-lactoglobulin ,88/36 P02754

35 Resultados Proteínas em menor expressão no grupo de maior maciez da carne Spot Identificação Score 1 Acyl-CoA-binding domain-cantaining protein 6 Massa (KDa) teórica/aparente Acesso Uniprot Expressão na menor força de cisalhamento ,27/54 A2VDR2 54 Myosin light chain 1/3, muscle isoform ,93/21 A0JNJ5 59 Heat shock protein beta ,39/22 Q3T Tropomyosin alpha -1 chain ,69/35 Q5KR Actin, alpha skeletical muscle ,05/38 P Cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial ,7/44 P Heat shock 70 kda protein 1A ,25/65 Q Myosin regulatory light chain 2, skeletal muscle isoform ,01/15 Q0P571

36 Proteínas HSP heat shock proteins Características das HSP - É a forma mais efetiva de proteção ao calor - Induzidas quando temperatura aumenta 10 C acima da ótima - Protegem as proteínas, membranas e organelas durante o estresse por calor - HSP são rapidamente transcritas pelo núcleo - Atuam como chaperonas moleculares (proteínas que previnem associações impróprias entre proteínas)

37 Proteínas HSP heat shock proteins Funções das HSP - previnem a agregação das proteínas - ajudam as proteínas desnaturadas a refazerem-se - auxiliam no dobramento das novas proteínas Localização Núcleo-Citoplasma-Cloroplastos-Mitocôndrias-Retículo endoplasmático

38 Conclusões Primeiro estudo de proteômico do tecido muscular com bovinos de origem Bos taurus indicus (Nelore); Estratégia de comparar extremos para os valores de força de cisalhamento foi eficiente; Os resultados confirmam algumas proteínas já associadas com a maciez da carne em outras raças; Novas proteínas foram identificadas com associação com a maciez da carne na raça Nelore; O processo de amaciamento da carne está envolvido com a expressão de várias proteínas.

39 Exercício Bioinformática Exemplo: Identifique e caracterize essas amostras através das seqüências peptídicas obtidas pelos espectros analisados. Ferramentas de Bioinformática BLASTP ( - Protein Blast) e UNIPROT ( Amostra A: VAHTVCQTGESTKPSSK Amostra B: AAVEEGIVPGGGTALAR Amostra C: IKPYDEYYVWR Amostra D: GKCYGEDVLQANNLPSSR Amostra E: RDKRNGIILKKEILK Amostra F: ASGRTTGIVMDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAI Amostra G: KKEGIE WTFIDFGMDL AACIELIEKP Amostra H: FEARK KEEEELIALK ERIEKR

40

41

42

43

44

45

46

47 Exercício Bioinformática Exemplo: Identifique e caracterize essas amostras através das seqüências peptídicas obtidas pelos espectros analisados. Ferramentas de Bioinformática BLASTP ( - Protein Blast) e UNIPROT ( Amostra A: VAHTVCQTGESTKPSSK Amostra B: AAVEEGIVPGGGTALAR Amostra C: IKPYDEYYVWR Amostra D: GKCYGEDVLQANNLPSSR Amostra E: RDKRNGIILKKEILK Amostra F: ASGRTTGIVMDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAI Amostra G: KKEGIE WTFIDFGMDL AACIELIEKP Amostra H: FEARK KEEEELIALK ERIEKR

48 Obrigado...