AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE CARNE DE BOVINOS NELORE POR MEIO DO ESTUDO PROTEÔMICO MEAT QUALITY EVALUATION OF NELLORE CATTLE THROUGH PROTEOMIC STUDY

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1 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE CARNE DE BOVINOS NELORE POR MEIO DO ESTUDO PROTEÔMICO MEAT QUALITY EVALUATION OF NELLORE CATTLE THROUGH PROTEOMIC STUDY Jessica Moraes Malheiros (1) Cruz Elena Enriquez-Valencia (1) José Cavalcante Souza Vieira (2) Pedro de Magalhães Padilha (2) Henrique Nunes de Oliveira (3) Luis Artur Loyola Chardulo (4) Resumo O presente trabalho possui como objetivo retratar o estudo proteômico de tecido muscular, a fim de avaliar a qualidade da carne de bovinos da raça Nelore. Foram abatidos 90 animais e coletado o músculo Longissimus thoracis destinado as análises de força de cisalhamento (FC) e índice de fragmentação miofibrilar (MFI), utilizadas na separação de três grupos experimentais de carne macia, intermediária e dura. Foi realizada extração e quantificação das proteínas submetidas à eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e análise dos géis por meio do software ImageMaster Platinum v Os géis apresentaram boa resolução por meio do matching ( 90%) e o número médio de spots proteicos nas repetições dos grupos macia, intermediária e dura foram de 230 ± 11,67, 186 ± 12,17 e 225 ± 9,12, respectivamente. No estudo das imagens dos géis também foram estimados o volume normalizado - %V durante o processo matching, onde pode-se inferir que o perfil proteômico do grupo de carne macia se aproxima ao grupo dura quando comparado a intermediária. Palavras-chave: 2D-PAGE. Bos indicus. Bovino de corte. Maciez. Abstract Therefore, this study aims to portray the proteomic study of muscle tissue in order to evaluate the meat quality of Nellore cattle. 90 animals were slaughtered and collected the Longissimus thoracis muscle for the shear force (FC) and myofibrillar fragmentation index (MFI), used in the separation of three groups of tender, intermediate and tough. Extraction and quantification of proteins was subjected to the two-dimensional electrophoresis (2D-PAGE) and analysis of gels by the ImageMaster Platinum v The gels presented good resolution through matching ( 90%) and the number of protein spots found in the replicates of groups of tender meat, intermediate and tough were 230 ± 11.67; 186 ± and 225 ± 9.12, respectively. In the gels of images study also estimated the standardized volume -% V during the matching process, where it can be inferred that the proteomic profile of the tender meat group approaches the profile of the tough meat group, when compared to the intermediate. Keywords: 2D-PAGE. Bos indicus. Beef cattle. Tenderness. 1 Doutoranda do programa de Pós Graduação em Genética e Melhoramento Animal na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP - Jaboticabal SP; 2 Instituto de Biociências IB/UNESP Botucatu SP; 3 Departamento de Zootecnia na Faculdade Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP - Jaboticabal SP; 4 Departamento de Melhoramento e Nutrição Animal na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP - Botucatu - SP. contato: jessicamalheiros@yahoo.com.br

2 1. Introdução A variabilidade genética das raças bovinas utilizadas na produção de carne e a variação nos sistemas de produção adotados, explicam as características negativas relacionadas à qualidade da carne. Portanto, é necessário identificar os mecanismos que definem qualidade da carne de animais zebuínos, e assim, intervir no processo de amaciamento (CHARDULO et al., 2013). O estudo das proteínas e enzimas expressas nos tecidos desempenha um papel importante na ciência da carne (D ALESSANDRO & ZOLLA, 2013). De fato, um dos principais objetivos da proteômica no campo da ciência animal é esclarecer a bioquímica do músculo esquelético e aprofundar a compreensão nas mudanças fisiológicas que ocorrem nas proteínas. Além de demonstrar a abundância das proteínas, funções dos genes e suas interações, os trabalhos em proteômica podem auxiliar na explicação de como funcionam os fatores genéticos e ambientais que controlam funções celulares e características fisiológicas (D ALESSANDRO & ZOLLA, 2013). Desta forma, a partir de uma abordagem proteômica, o presente estudo tem como objetivo realizar uma pesquisa de interesse estratégico visando o aprofundamento dos conhecimentos referentes aos mecanismos bioquímicos e fisiológicos envolvidos na transformação do músculo esquelético em carne e suas implicações com a maciez da carne de animais da raça Nelore, submetidos a confinamento. 2. Material e Métodos O estudo zootécnico foi conduzido no Confinamento experimental da FMVZ - UNESP, Botucatu. Foram utilizados 90 animais machos não castrados da raça Nelore, confinados por 95 dias até atingir aproximadamente 550 kg e 27 meses. Após o abate as carcaças foram resfriadas por 24 horas, período seguido da coleta de três amostras do músculo Longissimus thoracis de 2,54 cm de espessura entre a 11ª e 13ª costelas da meia carcaça esquerda de cada animal. A amostra retirada entre a 12ª - 13ª costelas foi utilizada para a realização do ensaio de força de cisalhamento (FC), área de olho de lombo (AOL) e espessura de gordura subcutânea (EGS). Outra amostra de 2,54 cm foi embalada a vácuo e maturada por 7 dias sob refrigeração de 0-2 o C, para realização de um outro ensaio de FC. Análise química de índice de fragmentação miofibrilar (MFI) também foi realizada. As demais amostras foram utilizadas nos ensaios de proteômica obtidas por meio da separação de

3 três grupos através da análise de componentes principais (CP): (1) animais de carne macia (n = 15), (2) carne intermediária (n = 15) e (3) carne dura (n = 15). Após a separação dos grupos foi realizada a extração e quantificação das proteínas, onde a proteína foi aplicada em fitas para focalização isoelétrica de 13 cm, contendo gel préfabricado com anfólitos imobilizados de ph 3 a 10. Após este período, a fita foi levada para corrida em primeira dimensão (IEF) e posteriormente aplicadas em gel de poliacrilamida a 12,5% (m/v) na realização do processo eletroforético bidimensional (2D-PAGE). Os géis foram escaneados e suas imagens analisadas no ImageMaster Platinum, v Na análise estatística os valores médios das características foram ajustados e comparados pelo Teste de Tukey-Kramer utilizando o programa Statistical Analysis System. 3. Resultados e Discussão O modelo empregado permitiu separar os grupos experimentais de acordo com as características de maciez avaliadas na carne bovina (FC e MFI), como observado na Tabela 1. As características fenotípicas referentes ao crescimento muscular (RC e AOL), não apresentaram diferenças significativas (p>0,05) entre os grupos experimentais, assim essas características não foram afetadas pela maciez da carne, possivelmente devido à utilização do mesmo sistema de manejo alimentar. Porém, houve diferença significativa (P<0,01) para EGS, no entanto, as carcaças apresentaram cobertura de gordura adequada. As características fenotípicas de FC e MFI apresentaram correlação significativa (rp = -0,77; p<0,01) quando submetidas a 7 dias de maturação. Valor acima do observado em estudo realizado por Baldassini et al. (2016), em 1652 bovinos Nelore (rp = -0,26; p<0,01). Os experimentos 2D-PAGE com amostras do músculo bovino foram realizados utilizando seis repetições por grupo e estes géis mostraram boa resolução (matching 90%), demonstrando que a separação de proteínas foi eficiente (LIMA et al., 2010). A maioria dos spots de proteína foram encontrados distribuídos entre 30 e 80 kda e com ponto isoelétrico (pis) frequente entre 5 e 9, como observado na Figura 1. Em estudo desenvolvido por Baldassini et al. (2015), com bovinos da mesma raça e grupos experimentais de carne macia (FC abaixo de 4,07 kg) e dura (FC acima de 7,6 kg) foram observados valores distintos ao encontrados no presente estudo para a distribuição das proteínas no peso molecular e pis de 20 a 66 kda e 5 a 7, respectivamente.

4 Tabela 1. Características quantitativas da qualidade da carne de bovinos Nelore terminados em confinamento e distribuídos nas diferentes classes fenotípicas de maciez. Características Macia Intermediária Dura Rendimento de carcaça kg (RC) 56,5 ± 4,62 53,6 ± 4,46 56,65 ± 4,27 Força de cisalhamento kg (FC0) 3,9 ± 0,75 a 5,6 ± 0,7 b 7,8 ± 1,36 c Força de cisalhamento kg (FC7) 3,4 ± 0,46 a 4,4 ± 0,43 b 5,9 ± 0,58 c Índice fragmentação miofibrilar (MFI0) 55,7 ± 9,01 a 50,3 ± 13,9 a 40,1 ± 8,86 b Índice fragmentação miofibrilar (MFI7) 65,9 ± 7,32 a 58,2 ± 13,19 a 44,8 ± 4,85 b Área de olho de lombo cm 2 (AOL) 83,3 ± 12,57 78,2 ± 9,6 75,4 ± 10,6 Espessura de gordura subcutânea mm (EGS) 6,5 ± 3,8 a 4,8 ± 1,77 ab 4,2 ± 1,52 b a,b,c Médias seguidas de letras diferentes, na mesma linha, diferem entre si pelo teste Tukey- Kramer (P<0,001). Figura 1. Gel 12,5% (m/v), padrão molecular kda e pi de 3-10 de amostras do músculo Longissimus thoracis de bovinos Nelore Grupo de carne macia. kda 97,0 66,0 45,0 33,0 pi ,1 14,4 O número médio de spots de proteínas encontrados nos géis de cada grupo experimental demonstrou diferença entre os grupos experimentais (P<0,01) e o desvio padrão abaixo de 12% (Tabela 2). Esta variação pode ser considerada uma boa indicação de separação de proteínas por 2D-PAGE (BRANDÃO et al., 2010). As correlações entre spots de proteínas foram estimados por meio da análise das imagens, considerando um volume normalizado - %V durante o processo de harmonização e a variação relatada entre os spots dos grupos (SUSSULINI et al., 2007), em que as correlações entre spots demonstraram que o perfil proteômico do grupo de carne macia se aproxima da carne dura, além de que a 2D-PAGE pode ser utilizada de forma eficiente na separação das proteínas dos distintos grupos experimentais.

5 Tabela 2. Média do número de spots, porcentagem de matching e volume normalizado avaliado nos géis de ph 3-10 do músculo Longissimus thoracis. Características Macia Intermediária Dura Número de spots 230 ± 11,67 a 186 ± 12,17 b 225 ± 9,12 a Matching (%) Volume normalizado (%V) R > 0.94 R > 0.83 R > 0.90 a,b,c Médias seguidas de letras diferentes, na mesma linha, diferem entre si pelo teste Tukey- Kramer (P<0,001). 4. Conclusão Pode-se inferir que o perfil proteômico do grupo de carne macia se aproxima do perfil do grupo de carne dura, quando em comparação com o grupo intermediário, ou seja, ocorre a mesma expressão da proteína no tecido muscular dos animais da raça Nelore em grupos extremos relacionados com a maciez da carne. Referências BALDASSINI, W. A. et al. Meat quality traits of Nellore bulls according to different grades of backfat thickness: a multivariate approach. Animal Production Science, BALDASSINI, W. A. et al. Bioanalytical methods for the metalloproteomics study of bovine longissimus thoracis muscle tissue with different grades of meat tenderness in the Nellore breed (Bos indicus). Food Chemistry, v. 169, p , BRANDÃO, A. R. et al. Image analysis of twodimensional gel electrophoresis for comparative proteomics of transgenic and nontransgenic soybean seeds. Journal of Proteomics, v.73, p , CHARDULO, L. A. L. et al. Analytical Aspects for Tropical Meat Quality In: Food Quality, Safety and Technology. 01 ed. Viena - Austria: Springer-Verlag Wien, 2013, v. 01, p D ALESSANDRO, A. & ZOLLA, L. Meat science: From proteomics to integrated omics towards system biology. Journal of Proteomics, v.78, p , LIMA, P. M. et al. Analytical approach to the metallomic of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) liver tissue by SRXRF and FAAS after 2D-PAGE separation: Preliminary results. Talanta, 82, , SUSSULINI, A. et al. Comparative metallomics for transgenic and non-transgenic soybeans. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, v.22, p.1 6, 2007.