RESPOSTA IMUNE E PROTEÇÃO DO PACU (Piaractus. IMMUNE RESPONSE AND PROTECTION of PACU (Piaractus

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1 RESPOSTA IMUNE E PROTEÇÃO DO PACU (Piaractus mesopotamicus) APÓS VACINAÇÃO INTRAPERITONEAL E POR IMERSÃO CONTRA AEROMONIOSE IMMUNE RESPONSE AND PROTECTION of PACU (Piaractus mesopotamicus) AFTER INJECTABLE AND IMMERSION VACCINATION AGAINST AEROMONIOSE Resumo Thais Heloisa Vaz Farias (1) Gabriela Pala (2) Suzana Kotzent (3) Jaqueline Custódio da Costa (4) Fabiana Pilarski (5) Este estudo avaliou a resposta imune adaptativa e a proteção de pacu, Piaractus mesopotamicus, após vacinação contra Aeromonas hydrophila por injeção intraperitoneal e por imersão. Os peixes foram distribuídos em quatro grupos: 1) vacinado intraperitonealmente (i.p); 2) vacinado por imersão; 3) vacinado por imersão duas vezes; 4) inoculado com 0,1mL de PBS estéril (controle). As diferentes vias de imunização promoveram o aumento dos níveis de anticorpos anti-a.hydrophila no soro dos pacus, no entanto, somente injeção i.p prolongou o incremento da resposta imune até o final do período experimental. Não houve diferença no percentual de sobrevivência entre os tratamentos, apesar disso, os animais vacinados via i.p apresentaram menor intensidade do processo infeccioso. Em conclusão, as diferentes vias de administração da vacina induziu uma forte resposta imune nos pacus, mas somente a vacina i.p prolongou o incremento da resposta imune, que apesar de não 1 Doutora em Aquicultura pelo Centro de Aquicultura da Unesp.. Endereço eletrônico: thais.vfarias@yahoo.com.br 2 Mestre em Aquicultura pelo Centro de Aquicultura da Unesp Endereço eletrônico: gabi.caunesp@gmail.com 3 Mestranda em Microbiologia Agropecuária pela FCAV Unesp, Jaboticabal. Endereço eletrônico: su_kotzent@hotmail.com 4 Mestranda em Aquicultura pelo Centro de Aquicultura da Unesp. Endereço eletrônico: jaque.custodio@gmail.com 5 Doutora em Aquicultura pelo Centro de Aquicultura da Unesp. Pesquisadora do Centro de Aquicultura do Caunesp. Endereço eletrônico: fabianap@caunesp.unesp.br

2 aumentar a resistência desse grupo ao desafio bacteriano, proporcionou maior capacidade do sistema imunitário para combater o agente infeccioso. Palavras-chave: Aeromonas hydrophila. Piaractus mesopotamicus. Vacina Abstract This study assessed the modulation of systemic immune response as well as P. mesopotamicus protection after immunization by two different routes of administration of a vaccine against A. hydrophila. Fish were divided in four groups: 1) vaccinated intraperitoneally (i.p); 2) vaccinated by immersion; 3) vaccinated by immersion twice; 4) inoculated with 0.1 ml of sterile PBS (control). Different routes of administration of the vaccine against the bacteria were able to increase of the level antibodies anti- A hydrophila in serum, however, only i.p. injection prolonged increase the immune response to the end of the experimental period. There was no difference in the percentage of survival between the treatments, however, the vaccinated animals showed lower intensity of infection. In conclusion, the different administration route of vaccines induced a strong response immune from pacu, and intraperitoneal vaccine prolonged immune response, although it did not increase the survival rate of this group, provided greater competence of the immune system to fight infectious agent. Keywords: Aeromonas hydrophila. Piaractus mesopotamicus. Vaccine 1 Introdução Aeromonas hydrophila é responsável por surtos de mortalidade de pacus (Piaractus mesopotamicus), um dos principais peixes cultivados no Brasil e emergente na aquicultura mundial (BILLER et al., 2015). No entanto, nenhuma vacina contra aeromoniose foi desenvolvida até o momento. Em geral, o nível e duração da eficácia da vacina são maiores na imunização injetável, no entanto, causa maior estresse aos peixes, custos com mão de obra qualificada e limitação para a vacinação de alevinos. Já, a vacina por imersão é um método mais simples de imunização, que é menos estressante, apresenta maior praticidade e possibilita a imunização de alevinos (GUDDING & VAN MUISWINKEL, 2013). O objetivo deste estudo foi determinar se a vacinação por imersão contra A. hydrophila comparada com imunização intraperitoneal pode estimular a resposta imune sistêmica e local de mucosa do P. mesopotamicus e melhorar taxa de sobrevivência dos peixes após desafio bacteriano.

3 2 Material e Métodos Juvenis de pacus (15± 5 g) foram divididos em quatro tratamentos com três repetições cada (n=45), sendo o primeiro grupo foi vacinado com injeção intraperitoneal contendo 0,1 ml de A. hydrophila inativada emulsionada com adjuvante incompleto de Freund. O segundo grupo foi vacinado em banho de imersão por 40 minutos em solução de A. hydrophila inativada. No terceiro grupo foi realizado o mesmo procedimento sendo repetido após 30 dias o reforço vacinal por imersão (booster). O quarto grupo foi inoculado com 0,1mL de PBS estéril (controle). As vacinas foram produzidas com a linhagem de A. hydrophila, isolada de um surto de aeromoniose em pacus, na concentração de 1.7 x 10 8 UFC ml -1 nos dois métodos de vacinação. Nos dias 14, 28, 42 e 84 pós-vacinação foram coletadas amostras de sangue para determinação dos níveis de anticorpos anti-a. hydrophila no soro por ELISA indireto (ROBERTSON & AUSTIN, 1998). Aos 84 dias pós-vacinação, os pacus foram desafiados com linhagem viva homóloga de A. hydrophila na concentração de 1 x 10 6 UFC ml -1 determinado a partir do ensaio de DL50. Os dados foram analisados usando ANOVA e a análise de variância para comparar os diferentes grupos experimentais foram estimados por Teste de Tukey (p< 0,05), e testados com efeito quadrático e linear. 3 Resultados e Discussão Os animais vacinados por injeção intraperitoneal apresentaram maiores níveis de anticorpos no soro durante todo o período avaliado em relação aos animais não vacinados (p<0,05). Após a vacinação por imersão sem dose de reforço, os níveis de anticorpos no soro foram superiores ao grupo controle aos 28 dias pós-imunização. Após esse período, o título de anticorpos foi similar aos peixes do grupo controle (p>0,05). Nos peixes imunizados por imersão, somente a imersão com booster foi capaz de manter maiores níveis de anticorpos até 42 dias pós-imunização (p<0,05), semelhante ao relatado por Arijo et al. (2005) que demonstrou a necessidade de reforço vacinal para aumentar e prolongar a resposta imune de linguados (Solea senegalensis) vacinados por imersão contra Photobacterium (Figura 1). Assim como observado no pacu, tilápia (Oreochromis niloticus) vacinadas via i.p apresentaram respostas imune adaptativas de maior intensidade e mais duradoura que a vacina por imersão, no entanto,

4 o uso de adjuvantes é necessário para a estimulação da resposta imune humoral adaptativa (GRABOWSKI et al., 2004). O sucesso da vacina por imersão em aumentar o nível de anticorpos anti-a.hydrophila no soro dos pacus imunizados está associado à exposição prolongada dos animas à alta concentração de antígeno vacinal, assim como observado por Du et al. (2015). Após desafio bacteriano, não foram observadas diferenças significativas no percentual de sobrevivência entre os diferentes tratamentos (p >0,05) (Tabela 1), apesar da variação na resposta de anticorpos induzida pela vacinação via i.p ao final do período experimental, assim como os resultados observados por Leal et al. (2010). No entanto, os animais vacinados via i.p apresentaram um processo infeccioso de evolução mais lenta, já que no terceiro dia pós- desafio os demais tratamentos apresentaram o mesmo percentual de sobrevivência observado nos peixes vacinados por injeção i.p ao final do desafio experimental, sugerindo que o processo infeccioso nestes animais foi menos intenso, e possivelmente com maior potencial de recuperação, por exemplo, durante uma infecção natural. Figura 1: Níveis de anticorpos anti-aeromonas hydrophila no soro de Piaractus mesopotamicus após imunização por injeção intraperitoneal, imersão; imersão com booster e não imunizados (controle) determinado pelo ensaio de ELISA indireto. Valores seguidos pela mesma letra não diferem pelo teste de Tukey (p>0,05). Barras indicam ±SEM.

5 Tabela 1: Percentual relativo de sobrevivência de Piaractus mesopotamicus submetidos ao desafio com Aeromonas. hydrophila após 84 dias de vacinação por diferentes vias de administração (injeção intraperitoneal, imersão; imersão c/ booster e controle). Tratamentos Dias de observação Imersão 90 ± 10,0 Aa 83 ± 11,6 Aab 63 ± 11,6 Abc 60 ± 10,0 Ac 53,3 ± 15,3 Ac 53,3 ± 15,3 Ac Imersão c/booster 93,3 ± 11,6Aa 86,7 ± 5,8 Aab 66,7 ± 5,8Abc 60 ± 10,0 Ac 60 ± 10,0 Ac 60 ± 10,0 Ac Intraperitoneal 90 ± 10,0Aa 76,6 ± 11,6Aab 73,3 ± 5,8Aab 70 ± 10,0Aab 63,3 ± 5,8 Ab 63,3 ± 5,8 Ab Controle 96,7 ± 5,8 Aa 83,3 ± 5,8 Aab 63,3 ± 5,8Abc 53,3 ± 5,8 Ac 53,3 ± 5,8 Ac 50 ± 10,0 Ac Média dos valores ± desvio padrão (n =30). Letras maiúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os tratamentos (p< 0,005). Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os dias de observação (p< 0,005). Tratamento: F=1,79 e p < F= 0,1613; Tempo: F= 29,42 e p < F=0,001; Trat x Tempo: F= 0,72 e p < F=0, Conclusões Diante da eficácia da vacina administrada por imersão c/ booster e via i.p em promover o aumento da resposta imune adaptativa associada à resposta dos animais imunizados via i.p frente ao desafio experimental, pode-se inferir que um protocolo de imunização pela via i.p combinado com reforço vacinal por imersão deve conferir uma resposta imune intensa e prolongada associada a uma maior proteção contra o patógeno. Referências ARIJO, S.; RICO, R.; CHABRILLON, M.; DIAZROSALES, P.; MARTÍNEZMANZANARES, E.; BALEBONA, M., MORIÑIGO, M. A. TORANZO, A.E.; MORIÑIGO,M.A. Effectiveness of a divalent vaccine for sole, Solea senegalensis (Kaup), against Vibrio harveyi and Photobacterium damselae subsp. piscicida. Journal of Fish Disease., v. 28., p , BILLER-TAKAHASHI, J. D.; TAKAHASHI, L. S.; MINGATTO, F. E.; URBINATI, E. C The immune system is limited by oxidative stress: Dietary selenium promotes optimal antioxidative status and greatest immune defense in pacu Piaractus mesopotamicus. Fish Shellfish Immunology, v.47., p , DU, Y.; TANG, X.; SHENG, X.; XING, J.; ZHAN, W. Immune response of flounder (Paralichthys olivaceus) was associated with the concentration of inactivated Edwardsiella tarda and immersion time. Veterinary Immunology and Immunopathology., v.167., p ,2015.

6 GRABOWSKI, L.D.; LAPATRA, S.E.; CAIN, K.D. Systemic and mucosal antibody response in tilapia, Oreochromis niloticus (L.), following immunization with Flavobacterium columnare. Journal of Fish Disease., v. 27., p , 2004 GUDDING, R. & VAN MUISWINKEL, W. B. A history of fish vaccination: sciencebased disease prevention in aquaculture. Fish Shellfish Immunology, v.35., p , LEAL, C. A. G.; CARVALHO-CASTRO, G. A.; SACCHETIN, P. S. C.; LOPES, C. O.; MORAES, A. M.; FIGUEIREDO, H. C. P. Oral and parenteral vaccines against Flavobacterium columnare: evaluation of humoral immune response by ELISA and in vivo efficiency in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture International, v.18., , ROBERTSON, P. A. W. & AUSTIN, B. Experimental Vibrio harveyi infections in Penaeus vannanrei larvae. Diseases of Aquatic Organisms, v.32., p , 1998.