Segurança alimentar e alimentos seguros

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1 AMOSTRAGEM PARA ANÁLISE E DETERMINAÇÃO DE MICOTOXINAS EM PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL

2 Segurança alimentar e alimentos seguros Eliene Alves dos Santos Fiscal Agropecuário (IMA) - MASP Acordo de Cooperação Técnica / Lacqsa/Lanagro-MG Outubro

3 Segurança a como Fator de Qualidade QUALIDADE cor sabor consistência tamanho aspecto nutrição SEGURANÇA Controle de perigos químicos, físicos e biológicos

4 SEGURANÇA : Controle de perigos químicos, físicos e biológicos Micotoxinas Substâncias químicas produzidas naturalmente por fungos. Ocorrem em alimentos sob certas condições de umidade e temperatura. Podem ocorrer no campo, durante o transporte e armazenamento (Solimanet al., 2002). Causam sérios problemas a saúde humana e de animais (Miccoetal., 1989).

5 Controle de perigos químicos, físicos e biológicos Micotoxinas Aflatoxinas Ocratoxina Zearalenona Fumonisinas Desoxinivalenol Patulina...

6 Controle de perigos químicos, físicos e biológicos Países com e sem regulamentos para micotoxinas F A O

7 Controle de perigos químicos, físicos e biológicos Limites para micotoxinas Exemplos: EU: 2 µg/kg para B 1 e 4 µg/kg de total Brasil: Limite máximo de 30µg/kg para aflatoxinas B 1 + G 1 em produtos para consumo humano, segundo Resolução nº 34/76, MS/CNNPA, publicada no Diário Oficial da União em 19/01/77, Seção 1, Parte V. Limite máximo de 50 µg/kg para aflatoxina total (B 1, B 2, G 1 e G 2 ) em produtos para consumo animal, segundo Portaria MA/SNAD/SFA, nº 07, de 09/11/88, publicada no Diário Oficial da União em 14/11/88. Mercosul (25/02): 20 µg/kg para aflatoxina total (B 1, B 2, G 1 e G 2 ) em amendoim, milho e derivados. 7

8 O estabelecimento de limites pressupõe a disponibilidade de planos de amostragem e de métodos analíticos

9 Distribuição das micotoxinas

10 Distribuição das micotoxinas não homogênea homogênea

11 Distribuição das micotoxinas Evento raro Lote = 10 ppb Proporção = 3/ = 0.03%

12 Distribuição das micotoxinas Alimentos não processados heterogênea (FAO, 1993; Whitaker, 1996) Distribuição binomial (milho, amendoim, nozes de árvores) Binomial Negativa (castanha-do-brasil) Weibel Lognormal (café) Gamma Depende de fatores como composição do produto, tamanho, safra, condições climáticas e outros.

13 Distribuição das micotoxinas Avaliação da contaminação do lote Lote ( kg) (µg/kg) =? Amostra (? kg) (µg/kg) Lote (µg/kg)(ppb) = amostra ppb? Amostra ppb Limite?

14 Distribuição das micotoxinas Avaliação da contaminação do lote Amostra (? kg) Lote ( kg) (µg/kg) =? kg (µg/kg) g (µg/kg) 250 1g (µg/kg) Lote (ng/g)(ppb) = 10-9g de toxina em 1g de amostra

15 Distribuição das micotoxinas Aflatoxinas Amostras (5 kg) Moinho do USDA 275 g sub-amostra análises por TLC Contaminações determinadas (µg/kg) Variabilidade dos resultados Apresentação realizada por Thomas Whitaker USDA/ARS em Belo Horizonte em , workshop de amostragem em café: Sampling Agricultural Commodities for Mycotoxins

16 0,11 0,52 0,55 0,76 1,06 Distribuição das micotoxinas 1,23 Aflatoxinas Amostra: 200kg Média (µg/kg) =18,12 Mediana (µg/kg) = 5,15 CV (%) = 124,4 Valor mínimo (µg/kg) = 0,11 Valor máximo (µg/kg) = 100,93 Variância observada = 612,59 1,25 1,74 17,17 2,06 4,33 5,96 Contaminações determinadas (µg/kg) Variabilidade dos resultados Lote : 4000kg 21,55 19,33 100,93 40,38 30,93 39,26 38,11 35,21 16

17 0,00 0,00 Aflatoxinas distribuição Afla total 0,00 0,00 0,00 Lote 25: 4000kg Amostra: 200kg Média (µg/kg) = 4,48 Mediana (µg/kg) = 0,00 CV (%) = 868,4 Valor mínimo (µg/kg) = 0,00 Valor máximo (µg/kg) = 88,23 0,00 Variância observada = ,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 88,23 0,81 0,00 0,62 0,02 0,00 Contaminações determinadas (µg/kg) 17 Variabilidade dos resultados

18 Micotoxinas - DISTRIBUIÇÃO Variabilidade entre os resultados dos testes Grande Aumenta com a contaminação do lote DON (trigo), afla (milho e amendoim), FB (milho) e OTA (café) Mais resultados abaixo da contaminação esperada para o lote - mediana < media (Risco do comprador) 18

19 AFLATOXINAS - DISTRIBUIÇÃO Amostras (5 kg) Moinho do USDA 275 g sub-amostra análises por TLC Contaminações determinadas (µg/kg) Média = 18,8µg/kg mediana = 8 µk/kg 19

20 Aflatoxinas distribuição Afla total É impossível determinar a verdadeira contaminação do lote devido à variabilidade associada com a amostragem, preparo das amostras e amostragem

21 Conseqüência da variabilidade dos resultados Bons Ruins Lotes aceitos Lotes aceitos x (Risco do comprador) Lotes bons rejeitados x (Risco do vendedor) Lotes ruins rejeitados 0 Limite µg/kg 21

22 Erros na determinação de micotoxinas amostragem - 90% métodos analíticos - 10% Erro total ERRO TOTAL Erro de amostragem Amostragem de amostra Erro Análise Analítico de Sub- Erro Preparo Sub- Lote Amostra amostra Sub amostragem Análise 90% 10% (Whitaker e Park, 1994) 22

23 Fontes da variabilidade Variância Total Variância Amostragem Variância Preparo de amostras Variância analítico Lote Amostra Preparação Análises ppb (µg/kg) 23

24 Plano de amostragem O plano de amostragem projetado deve definir os critérios de aceitação do lote em relação a uma probabilidade determinada (normalmente 95%) característica estatística de desempenho ou de uma curva operação característica 24

25 Plano de amostragem Conjunto de procedimentos planejados Limites de aceitação e rejeição de lotes Procedimento teste para micotoxinas amostragem preparo de amostra método analítico 25

26 Procedimentos planejados Composto de 5 estágios a- seleção do lote b- Retirada da amostra Acceptance Probability C C g = Acceptable C a = C g False Positives C > C g = Unacceptable False Negatives c- Preparo: moagem/ pasta (~20 mesh) d - Análises e quantificação Aflatoxin Concentration (C) - ppb e - Avaliação estatística 26

27 Design de Nested, desbalanceado, para amostragem Lote 1 Lote i Lote n Amostras 1,3,5,,x-1 Moagem Amostras 2,4,6,,x Moagem Subamostra 1 Extrato Subamostra 2 Extrato Subamostra 1 Extrato Aliq 1 Aliq 2 Aliq 1 Aliq 1 27

28 Dados de análises Medida da variância relativa ao processo de amostragem Medida de variância relativo ao preparo Medida da variância relativa a análise Variância total do processo 28

29 Teoria estatística Avaliação do modelo 29

30 Castanha-do-brasil sem casca Probability of Obtaining x or Lot 10 Shelled Brazil Nuts N=20, Mean = 1.01 Obs Variance = Sample: 10 kg (ns = 1,850) Observed Cg025Pred Ln2Pred NbPred Sample Aflatoxin Concentration - x (ppb) 30

31 Castanha-do-brasil sem casca Distribuição de aflatoxina total em castanha-do-brasil sem casca Gama Composta Binomial Negativa Lognormal 31

32 10000 Aflatoxina Total Lots > 0,39 µg/kg Fitted by GLM, log Variância da amostra castanha-do-brasil 1000 Variância da amostra - ss s s 2 = 4,8616C 1,889 R = 0,80 0,1 0, Afla total µg/kg

33 Variância do preparo da amostra castanha-do-brasil 10 Aflatoxina Total Lotes > 0,39 µg/kg Fitted by GLM, log Variância do preparo da amostra ss s 2 1 0,1 0,01 s ss 2 = 0,0306C 0,632 R = 0,24 0,001 0, Aflatoxina total (µg/kg)

34 Variância do preparo da amostra castanha-do-brasil Aflatoxina Total Lotes > 0.39 µg/kg Fitted by GLM, log Variancia Analitica - sa s a2 = 0,0164C 1,117 R = 0, Aflatoxina total (µg/kg) 34 34

35 Probabilidade de aceite 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Plano de amostragem Curva operacional para aflatoxinas em milho Lotes ruins aceitos - Risco do Comprador Risco do vendedor Lotes bons rejeitados Concentração de aflatoxina no lote (µg/kg) 1 kg 5 kg 20 kg Limite 35

36 Plano de amostragem Curva operacional para aflatoxinas em castanha-do-brasil sem casca DFP - Shelled Brazil Nuts BN (0.39) Laboratory Sample Size Noted Slurry Grind 100 g, 50 g Test Portion Analysis, 1 Aliquot, 22% Reproducibility RSD Maximum Level = 20 Total Aflatoxin (ug/kg) Accept/Reject Limit = 20 (ug/kg) Accept Probability (%) x20 kg < 20 ug/kg 2-1x30 kg < 20 ug/kg 3-1x40 kg < 20 ug/kg 4-2x20 kg < 20 ug/kg 5-2x10 kg < 20 ug/kg 6-3x10 kg < 20 ug/kg Maximum Limit Lot Aflatoxin Concentration (Total ug/kg) 36

37 Accept Probability (%) Plano de amostragem Curva operacional para aflatoxinas em castanha-do-brasil sem casca 5 Maximum Limit 4 DFP - Shelled Brazil Nuts BN (0.39) Laboratory Sample Size Noted Slurry Grind 100 g, 50 g Test Portion Analysis, 1 Aliquot, 22% Reproducibility RSD Maximum Level = 15 Total Aflatoxin (ug/kg) Accept/Reject Limit = 15 (ug/kg) x20 kg < 15 ug/kg 2-1x30 kg < 15 ug/kg 3-1x40 kg < 15 ug/kg 4-2x20 kg < 15 ug/kg 5-3x10 kg < 15 ug/kg Lot Aflatoxin Concentration (Total ug/kg) 37

38 Plano de amostragem Curva operacional para aflatoxinas em castanha-do-brasil sem casca Export BN (0.39) Laboratory Sample Size Noted Slurry Grind 100 g, 50 g Test Portion Analysis, 1 Aliquot, 22% Reproducibility RSD Maximum Level = 10 ng/g Total Aflatoxin Accept/Reject Limit = 10 ug/kg Accept Probability (%) Maximum Limit 3x10 kg 4x10 kg 2 x10 kg 1x10 kg Lot Aflatoxin Concentration (Total ug/kg) 38

39 Redução dos riscos Procedimento Variância 5 kg 521,4 Subamostra 250g M1 59,2 TLC 1 alíquota 50,1 Total 630,7 2o kg 130,4 Subamostra 100g M2 25,5 HPLC 1 alíquota 20,1 Total 176,0 39

40 Método de amostragem Conjunto de procedimentos planejados que permitem fazer a tomada de amostras REPRESENTATIVAS de um determinado lote ou sublote; Indica o número, a massa e a frequência dos incrementos a serem retirados em cada amostragem 40

41 Amostragem LOTE (t) Quantidade de produto com características definidas sob condições essencialmente iguais Incrementos (g) Quantidade de produto retirada em um só ponto do lote ou sublote para formar a amostra global Amostra global (kg) Formada pela totalidade dos incrementos colhidos em um lote ou sublote Laboratório Amostra de trabalho (kg) Formada a partir da amostra global, podendo ser igual a esta 41

42 Amostragem Retirada da amostra Representativa Aleatória Chance igual Não tendenciosa 42

43 Amostragem Lote apresentar as condições necessárias; Incrementos devem ser retirados de vários pontos cobrindo completamente o lote; Equipamentos apropriados 43

44 Armazenamento e amostragem de café para análise de ocratoxina A 44

45 45

46 Amostragem em big bag 46

47 Amostragem Os caladores ou coletores de incrementos deverão ser definidos de acordo com o local da coleta, o tipo de grão e deverão ser adequados para coletar incrementos (g). Atingir o máximo de profundidade. 47

48 Amostragem Cálculo da frequência de amostragem Verificar Massa do lote Massa da amostra global Massa do incremento 48

49 Freqüência da amostragem Lotes: sacas, caixas, big bags, etc. Calcular a freqüência da amostragem: (F)=Massa do lote (kg) X massa do incremento(kg) Amostra global(kg) X capacidade da embalagem(kg) Em que: F = freqüência de amostragem: indica a frequência ou intervalos regulares de amostragem ou o número de embalagens individuais das quais será colhido um incremento. As casas decimais serão arredondadas para o número inteiro mais próximo. Calcular o número de incrementos a serem retirados; 49

50 Exemplo: Lote = 25 toneladas de amendoim Massa do incremento = 200g Massa da amostra global = 20kg Capacidade da embalagem = 60kg F=Massa do lote (kg) X massa do incremento(kg) Amostra global(kg)xcapacidade da embalagem(kg) F= kg x 0,200kg = 4,16 ~= 5 20kg x 60 kg a cada 5 sacos será retirado um incremento de 200g No final: kg divididos por 60 kg = 416 sacos Dos quais 100 serão amostrados: 20 kg 50

51 Coleta das amostras de amendoim - IN 03 Mercado Interno e países do MERCOSUL anexo II Mercado Interno (varejo) anexo III Mercado Internacional (exceto MERCOSUL e União Européia) anexo IV União Européia anexo V

52 ANEXO II Critérios para amostragem de Lotes de Amendoim Destinados ao Mercado Interno e países do MERCOSUL Massa do lote Massa ou nº de sub-lotes Nº de incrementos Massa do increment o Massa da amostra global Massa mínima da amostra de trabalho Descascado Em casca 500 t 100 t > 100 e < 500 t 5 sub-lotes 25 e 100 t 25 t g 20 kg > 15 e 25 t 1 sub-lote 5 kg 7 kg > 10 e 15 t kg > 5 e 10 t kg > 1 e 5 t kg 52

53 ANEXO III Critérios para amostragem de Lotes de Amendoim Destinados ao Mercado Interno (varejo) Massa do lote Nº de incremen tos Massa do incremen to Massa da amostra global Massa da amostra de trabalho sem casca com casca sem casca com casca sem casca com casca > 0,5 e < 1 t ,1 5 7 > 0,2 e < 0,5 t > 0,1 e < 0,2 t , g 270 g ,0 3 4 < 0, ,7 2 2,7

54 ANEXO IV Critérios para amostragem de Lotes de Amendoim Destinados ao Mercado Internacional (exceto MERCOSUL e União Européia) Massa do lote Massa ou nº de sub-lotes Nº de incrementos Massa do incremento (descascado) Massa da amostra global Massa da amostra de trabalho 500 t 100 t > 100 e < 500 t 5 sub-lotes 25 e 100 t 25 t kg 20 kg > 15 e 25 t 1 sub-lote 200 g > 10 e 15 t kg 16 kg > 5 e 10 t kg 12 kg > 1 e 5 t kg 8 kg 54 1 t kg 2 kg

55 ANEXO V Critérios para amostragem de Lotes de Amendoim Destinados à União Européia Massa do lote 500 t Massa ou nº de sub-lotes 100 t > 100 e < 500 t 5 sub-lotes 25 e 100 t 25 t > 15 e 25 t 1 sub-lote > 10 e 15 t - Nº de incrementos 100 Massa do incremento Massa da amostra global 2 Massa da amostra de trabalho 30 kg 30 kg > 5 e 10 t kg 24 kg 300 g > 2 e 5 t kg 18 kg > 1 e 2 t kg 12 kg > 0,5 e 1 t kg 9 kg > 0,2 e 0, kg 6 kg > 0,1 e 0,2-15 4,5 kg 4,5 kg 0, kg 3 kg 1 Adaptada do Regulamento CE nº 401/2006 da Comissão Européia de 23/02/ Nos casos de lotes vendidos a varejo, a massa da amostra global pode ser diferente. 55

56 Amostragem Coleta de incrementos Amostra global Mercado interno e MERCOSUL Homogeneização e fracionamento Amostra de trabalho Mercado externo (exceto MERCOSUL) Amostra global = amostra de trabalho Laboratório

57 Amostragem de lotes em movimento Lote em movimento (por exemplo em esteira) pode ser considerado estático se a amostragem for realizada no saco imediatamente após o ensacamento senão calcular mediante a vazão da esteira ou da quantidade que é ensacada ou processada por dia. 57

58 Preparo da amostra Preparo: moagem/pasta (~20 mesh) Pasta amendoim: água (1:1,5 v/v) Moagem 58

59 Preparo da amostra Moinhos Tipo Turrax 59

60 Preparo da amostra Moinhos 60

61 Preparo da amostra Moinhos Modelo Multiprocessadora de Alimentos Cutter Mixer (Linha UM) Capacidade aproximada Motor (rpm) Volt. Dimensões (cm) Larg. x Prof. Altura (cm) UM l 7 kg Trifási 70 x UM l 15 kg ca 80 x UM l 27 kg ou 90 x UM-130E 130 l 80 kg 380V 140 x Peso (kg) 61

62 Análises e quantificação de micotoxinas nas amostras Extrato da amostra Suporte sólido Impureza Ampliação após passagem do extrato da amostra na IAC Anticorpo anti micotoxinas Micotoxinas Extração CLAE CCD Purificação Detecção quantificação Detecção quantificação 62

63 gov.br Rio de Janeiro Outubro de