OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE BHA E BHT EM ÓLEOS E GORDURAS POR CLAE

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1 OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE BHA E BHT EM ÓLEOS E GORDURAS POR CLAE J.C. Bassani 1, L.D. Hauphental 2, A.T. Paulino 3 1- Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial, Instituto SENAI/SC de Tecnologia em Alimentos e Bebidas CEP: Chapecó SC Brasil, Telefone: 55 (49) (josibassani@sc.senai.br) 2- Departamento de Química- DAQUI- PPGTP - Universidade Tecnológica Federal do Paraná CEP Pato Branco PR Brasil, Telefone : 55 (49) (ldh.lilian@hotmail.com) 3 -Departamento de Engenharia de Alimentos - Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC) CEP Pinhalzinho SC Brasil, Telefone: 55 (49) (alexandre.paulino@udesc.br) RESUMO Óleos e gorduras podem sofrer reações químicas. Os antioxidantes sintéticos butilhidroxi-anisol (BHA) e butil-hidroxi-tolueno (BHT) são os mais utilizados na indústria de alimentos para evitar o aparecimento de rancidez hidrolítica e oxidativa. A separação de BHA e BHT por CLAE foi realizada nas seguintes condições: vazão de 1,0 ml min -1 em eluição isocrática, com 90% de acetonitrila/metanol e 10% de ácido acético 5%, tempo total de eluição de 10 min. Observou-se uma separação eficiente dos picos dos dois analitos. O método foi eficiente para determinação de BHT e BHA em amostras de óleo de soja e gordura suína, com coeficiente de determinação (R 2 ) de 0,9995. Faixa linear de concentração foi de 10 a 240 mg Kg -1 e a recuperação ficou dentro da faixa estabelecida. As alterações proposta no método utilizado neste trabalho levaram a uma redução no tempo de análise e no custo da análise. ABSTRACT Oils and fats may undergo chemical reactions. The synthetic antioxidants BHA BHT are the most used in the food industry to avoid the appearance of hydrolytic and oxidative rancidity. The separation of BHA and BHT HPLC was performed under the following conditions: flow rate 1.0 ml min-1 in isocratic elution with 90% acetonitrile / 10% methanol and 5% acetic acid, the total elution time of 10 min. There was an efficient separation of the peaks of the two analytes. The method was effective for determining BHT and BHA in soybean oil and pork fat samples, with a coefficient of determination (R2) of Linear concentration range was 10 to 240 mg kg-1 and the recovery was within the range established. The proposed change in the method used in this work led to a reduction in analysis time and the cost of the analysis. PALAVRAS-CHAVE: Antioxidantes, CLAE, validação, BHA, BHT. KEYWORDS: Antioxidants, HPLC, validation, BHA, BHT. 1. INTRODUÇÃO Óleos e gorduras podem sofrer reações químicas de oxidação ou hidrólise durante o processamento e armazenamento de alimentos (Araújo, 2011). Segundo Bobbio e Bobbio (2011) são formados substâncias indesejáveis que deterioram o produto, formando odor característico e levando a modificações nas suas características físicas. Para a adição de aditivos durante a produção de um determinado alimento é necessário levar em consideração as melhorias e vantagens do ponto de vista tecnológico e questões sobre a segurança

2 alimentar. Os antioxidantes são aditivos adicionados aos alimentos com a intenção de retardar e até mesmo evitar a rancidez oxidativa. (IAL, 2008) Os antioxidantes mais utilizados nesses casos são o butil-hidroxi-anisol (BHA) e butil-hidroxi-tolueno (BHT) (Jorge e Ramalho, 2006). BHA é um antioxidante mais efetivo na supressão da oxidação de gorduras animais quando comparado com óleos vegetais. É efetivo no controle de oxidação de ácidos graxos de cadeia curta como aqueles encontrados em óleo de coco e palma (Jorge e Ramalho, 2006). O BHT possui propriedades similares ao BHA. O BHA e o BHT são sinérgicos entre si. Contudo, o BHA atua como seqüestrante de radicais peróxidos e o BHT age como sinergista ou regenerador de radicais BHA durante um processo de rancidez oxidativa em alimentos (Jorge e Ramalho, 2006). Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) com base nas Resoluções- RDC Nº 23 de 15 de fevereiro de 2005 e Nº 04 de 24 de novembro de 1988, estabelece quais são os aditivos permitidos para os diferentes grupos de alimentos, suas funções e limites máximos permitidos de uso. Para garantir que a quantidade apropriada de antioxidantes está sendo utilizada pelas indústrias de alimentos, são necessários o desenvolvimento e estudos de métodos de quantificação de BHA e BHT de forma segura e correta. Para a determinação simultânea de BHA e BHT podem ser utilizados diversos métodos, incluindo CLAE. Segundo Cecchi, (2003) as vantagens da utilização de CLAE incluem a rapidez do processo devido ao uso de alta pressão na separação de componentes da amostra. Porém, muitos destes métodos cromatográficos propostos na literatura ainda não possuem aplicabilidade em análises de rotina de laboratórios uma vez que são consumidos grandes quantidades de reagentes no processo de separação e extração. Essa alta quantidade de reagente consumido eleva o custo das análises e geram altas quantidades de resíduos químicos. Por fim, a determinação de BHA e BHT por muitos métodos são demoradas aumentando a possibilidade de erros durante sua execução. Então, o objetivo do presente trabalho foi otimizar e validar um método cromatográfico para determinação simultânea de antioxidantes BHA e BHT em óleos e gorduras por CLAE. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Otimização A partir do método da AOAC foi estudado a técnica usada no processo de otimização e validação a fim de obter um método mais rápido (pela eliminação da etapa que utiliza evaporador rotativo), econômico (pela redução de reagentes empregados no processo) e eficiente para análises de rotinas. Os cromatogramas foram obtidos utilizando um cromatógrafo Varian, modelo Pro Star, equipado com coluna C18 Microsorb-MV, detector ultravioleta e bomba terciária. Para a corrida das amostras e padrões foi utilizada uma vazão de 1,0 ml min -1 em eluição isocrática. Os picos de BHA e BHT foram detectados por UV em 280 nm. A fase móvel utilizada foi uma mistura de acetonitrila/metanol na proporção 1:1 (v/v) acidificada com ácido acético 5% previamente preparado utilizando água Mili-Q. 2.3 Preparo das soluções padrões de BHA e BHT e Preparo das amostras Os antioxidantes padrões BHA e BHT utilizados nos experimentos foram da marca Supelco (Phenolic Antioxidants Kit 2). Além disso, foram utilizados reagentes tais como acetonitrila (Baker), hexano (Vetec), propanol (Sigma Aldrich) e ácido acético (Tedia), todos reagentes ultra puros e de grau analítico para análises em CLAE. Foram preparadas soluções com concentrações de 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20 e 24 mg L -1 para construção de uma curva de calibração para o BA e BHT. Essa curva foi utilizada para determinar as concentrações dos antioxidantes nas amostras reais. As amostras de óleo de soja e gordura suína (material produzido pelo tecido adiposo de suínos) foram adquiridas em um comércio local de Chapecó, Santa Catarina Brasil.

3 A extração dos antioxidantes a partir das amostras de óleo de soja e gordura suína foi realizada utilizando o método da AOAC (Association of Official Analytical Chemists) com algumas modificações. Estas modificações foram realizadas a fim de utilizar menores quantidades de reagentes e evitar do uso de rotavaporizador. Os novos parâmetros do processo modificado e a comparação com aqueles descritos pela AOAC estão apresentados na Tabela 1. Tabela 1 Preparo das amostras por AOAC e após a modificação do método. Método da AOAC Método Modificado Amostra de óleo Amostra de gordura 5,5 g 3,0 g 5,0 g 5,0 g Volume de Hexano 20,0 ml 10,0 ml Volume de acetonitrila 50,0 ml 20,0 ml Número de extrações 3 2 Volume total de reagentes utilizados após as extrações* 170,0 ml 50,0 ml *O volume total de solventes utilizados pelo método da AOAC nas 3 extrações foi de aproximadamente 170,0 ml e uso de rotavaporizador para remoção de acetonitrila a partir do extrato final. No método modificado proposto são utilizados apenas 50,0 ml de solventes sem a necessidade de uso de rotavaporizador. A redução na quantidade de solvente utilizado no processo foi de 64,7 %. No método de extração otimizado foi utilizado 5,0 g de óleo de soja ou gordura suína pesado diretamente em tubo de Falcon de 50 ml, liquefeito com a adição de 10,0 ml de hexano saturado com acetonitrila. Foi adicionado 20,0 ml da solução de acetonitrila saturada com hexano, agitado e centrifugada a 2000 rpm por 2 min. O extrato, contendo principalmente acetonitrila, foi coletado em um balão volumétrico de 50,0 ml. O sobrenadante da primeira extração, contendo principalmente hexano, foi separado e o processo de adição de acetonitrila saturada com hexano foi repetido. Novamente, o extrato foi coletado, misturado e homogeneizado no mesmo balão volumétrico de 50,0 ml. Finalmente, o volume do balão foi completado com acetonitrila até 50 ml conforme pode ser observado no organograma da Figura 1. Os extratos em acetonitrila foram filtrados em filtro de 0,45 µm e 20 µl antes de ser injetados no cromatógrafo. Figura 1 Procedimento de preparo de amostra pelo método modificado. ACN = Acetonitrila. 2.5 Validação do método

4 A validação do método para determinação simultânea de BHA e BHT em óleo de soja e gordura suína por CLAE foi realizada comparando os resultados experimentais com o guia: Orientação sobre validação de métodos analíticos Rev-04 Julho de 2011 do INMETRO (Instituto nacional de metrologia, qualidade e tecnologia). Os parâmetros de validação estudados foram: precisão, seletividade, tendência e/ou recuperação, robustez, sensibilidade e/ou linearidade e/ou faixa linear de trabalho, limite de detecção e limite de quantificação (INMETRO, 2010). A análise de robustez foi realizada por meio do teste de Youden conforme Guia RILAC 13 (2000). Para isso, foram analisadas amostras de óleo de soja contaminada com os antioxidantes BHA e BHT. Os ensaios foram realizados variando a quantidade de amostra utilizada no ensaio (5,0 gramas para o método normal e 2,5 gramas como variação), o volume de hexano saturado utilizado para dissolver a amostra (10 ml para o normal e 8 ml para variação) e a vazão do sistema no CLAE (1,0 ml min -1 para o método normal e 1,2 ml min -1 para variação). Todos os cálculos foram realizados no Software Microsoft Office Excel, versão Foi realizado ANOVA determinando testes de igualdade para as médias, onde foi verificado se as variáveis independentes produziram algum efeito sistemático nas variáveis dependentes (Martins, 2010). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Após a realização dos experimentos adotou-se como condições otimizadas para o método de determinação simultânea dos antioxidantes BHA e BHT a vazão de 1,0 ml min -1 sendo que esta vazão resultou em picos com separação eficiente sem que houvesse o comprometimento da bomba do CLAE. O cromatograma apresentado na Figura 2 está relacionado a determinação de BHA e BHT em amostras de óleo de soja, analisados sob as condições cromatográficas do método otimizado, contendo concentração dos padrões com valor de 240 mg Kg -1. É possível verificar uma corrida com separação eficiente dos picos. Através de uma curva de calibração foi observado um coeficiente de determinação (R 2 ) para quantificação de BHA e BHT tanto em óleo de soja quanto em gordura suína maior que 0,9995. A partir de dados descritos pelo INMETRO, o valor do coeficiente de determinação apropriado para a utilização de um método na determinação de BHA e BHT em óleos e gorduras deve ser maior que 0,90. Isso indica que o método estudado na determinação desses antioxidantes é promissor para análises de rotinas. Figura 2 Cromatograma de uma amostra de óleo de soja após a adição de BHA e BHT padrão com concentração de 240 mg Kg -1. Os limites de detecção (LD) para a determinação de BHA e BHT em óleo de soja foram 0,80 e 0,30 mg Kg -1, respectivamente e para gordura suína foram 0,97 e 0,51 mg Kg -1. Já os limites de quantificação (LQ) para óleo de soja foram 12,7 e 13,0 mg K -1, respectivamente e para gordura suína foram 13,6 e 14,2 mg Kg -1. Os valores para o coeficiente de variação (CV) em condições de repetitividade não foram superiores aos 5% admitidos na Resolução nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA, confirmando a

5 precisão do método otimizado. Para os métodos nos quais o interesse é na análise de traços ou impurezas são admitidos valores de CV de no máximo 20%. O limite de repetitividade para a determinação de cada antioxidante em diferentes concentrações foi maior do que a maior diferença entre as medidas, o que confirma que o método é válido para este requisito. Os resultados observados após o tratamento estatístico utilizando análise de variância (ANOVA) foram estatisticamente iguais em um nível de confiança de 95%. Observou-se após o teste F que o valor de F calculado foi menor que o F crítico demostrando que os resultados obtidos dos testes de precisão intermediária são estatisticamente iguais. Podendo concluir que o método otimizado pode ser eficiente na determinação de BHA e BHT em óleo de soja e gordura suína por CLAE. Na Tabela 7 são apresentados os valores de recuperação durante a determinação de BHA e BHT em óleo de soja e gordura suína. Para todos os estudos realizados neste trabalho foram observados valores de recuperação entre 93 e 101% para determinação de BHA e de BHT em óleo de soja ou em gordura suína, o teste de recuperação mostrou-se dentro da faixa compreendida entre 60 e 115% confirmando a exatidão do método e corroborando com trabalhos de Brito (2001) e Cecchi (2003). Observaram-se que os valores de recuperação foram estatisticamente iguais quando comparado o método tradicional com o método modificado, sendo que através desse último foi observado ligeira melhora na eficiência dos antioxidantes recuperados. Esses resultados foram semelhantes aqueles observados por Takemoto (2004) para matrizes de óleos vegetais, margarinas e gorduras hidrogenadas, com emprego de coluna de fase reversa e fase móvel composta por metanol:água (acidificada com ácido acético 5%, ph a 3,1), com sistema de eluição gradiente e vazão de 0,8mL/min. Com isso, pode-se destacar que a recuperação para o antioxidante BHT pode ser melhorada alterando os reagentes utilizados, principalmente o reagente acetonitrila, o qual possui baixa taxa de recuperação para este antioxidante também observado por Robards e Dilli (1987). Tabela 7 Recuperação de BHA e BHT adicionados em concentrações de 20, 30, 100 e 240 mg nas amostras de óleo de soja e gordura suína. Takemoto (2004) No presente trabalho Antioxidante Recuperação para óleo Recuperação média para óleo de soja (%)* 20 mg 30 mg 100 mg 240 mg Recuperação média para banha (%)* 20 mg 30 mg 100 mg 240 mg BHA 98 a BHT 84 a * Valor médio de recuperação para 7 resultados Através dos resultados obtidos para a análise de robustez é possível concluir que as pequenas variações testadas no método não influenciaram significativamente nos resultados com 5% de significância. O F calculado (3,01) foi menor que o F critico 0,83 e 0,02 para BHA e BHT respectivamente. Os resultados foram obtidos através da média de sete determinações para cada antioxidante, na concentração de 100 mg Kg -1. Os resultados obtidos para a seletividade do método podem ser observados na Figura 5. Nos tempos de retenção das substâncias de interesse (BHA e BHT) não encontraram-se nenhum interferente que possa comprometer o desempenho do método. Através da comparação dos cromatogramas A, B e C da Figura 5, verifica-se que a matriz óleo de soja não tem efeito importante sobre a precisão do método na faixa de concentração estudada. Figura 5 (A) Cromatograma da mistura dos padrões de antioxidantes BHA e BHT em amostra de óleo de soja, (B) cromatograma da amostra de óleo de soja (sem adição dos padrões de antioxidantes BHA e BHT) e (C) cromatograma para a análise dos reagentes.

6 4. CONCLUSÃO A partir da metodologia descrita pela AOAC foi realizada a otimização do método para determinação simultânea de BHA e BHT por cromatografia líquida de alta eficiência. Através dos dados de validação foi possível concluir que o método modificado de preparo de amostra e determinação simultânea de BHA e BHT foram eficientes. Os coeficientes de determinação (R 2 ) para a análise de BHA e BHT foram maiores que 0,9995. Os resultados de recuperação para BHA e BHT em óleo de soja e gordura suína e a determinação das figuras de méritos analíticos forneceram informações suficientes para concluir que as alterações propostas neste trabalho levaram a uma redução no tempo de análise e no seu custo uma vez que foram utilizadas quantidades menores de reagentes mantendo a precisão e exatidão dos resultados. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AOAC (2005). Phenolic antioxidants in oils, fats and butter oil, liquid chromatografhic method, AOAC Official Method , Arlington, Virginia. Araújo, J. M. A. (2011). Química de Alimentos: Teoria e Prática (5. ed.).viçosa: UFV. Bobbio, F. O.; Bobbio, P. A. (2011). Química do Processamento de Alimentos (3. ed.). São Paulo: Varela. BRASIL. Resolução CNS/MS nº 04, de 24 de novembro de Aprovar a revisão das Tabelas I, III, IV e V referente a Aditivos Intencionais, bem como os Anexos I, II, III, IV e VII, todas do Decreto nº , de 26 de março de Diário Oficial da República Federativa do Brasil. Brito, N. M. (2001). Resíduos de pesticidas organoclorados (OC) e organofosforados (OF) em matriz de coco:metodologia e aplicação (Dissertação de mestrado). Universidade Estadual Paulista, São Paulo. Cecchi, H. M., (2003). Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos. (2. ed.), Campinas: Unicamp. Martins, G. A. (2010). Estatística Geral e Aplicada (3. ed.). São Paulo: Atlas. Ramalho VC, Jorge N. (2006). Antioxidantes utilizados em óleos, gorduras e alimentos gordurosos. Quimica Nova; 29(4): RELACRE (2000). Guia Relacre 13 Validação de Métodos Internos de Ensaio em Análise Química. Portugal.Disponívelemhttp:// ia%20relacre%2013.pdf Robards, K.; Dilli, S.(1987). Analytical chemistry of synthetic food antioxidants - a review. Analyst, 112: Takemoto, E. (2004). Determinação simultânea de antioxidantes sintéticos em óleos vegetais, margarinas e gorduras hidrogenadas por cromatografia líquida de alta eficiência (Dissertação de Mestrado). Universidade Estadual de Campinas, São Paulo.