ROBUSTEZ DO MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM MEL DE MELATO DE BRACATINGA (Mimosa scabrella Bentham) POR HPLC/DAD
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1 ROBUSTEZ DO MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM MEL DE MELATO DE BRACATINGA (Mimosa scabrella Bentham) POR HPLC/DAD B. Silva 1, L.V. Gonzaga 1, R. Fett 1, A.C.O. Costa 1 1-Departamento de Ciências dos Alimentos Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias CEP: Florianópolis SC Brasil, Telefone: (48) (bibianaengenheira@hotmail.com) RESUMO Neste trabalho, foi avaliada a robustez do método cromatográfico para determinar compostos fenólicos em amostras de mel de melato de bracatinga (Mimosa scabrella Bentham), usando o teste de Youden. O teste de Youden se mostrou um método eficiente para avaliar a robustez de métodos cromatográficos, através de delineamento experimental envolvendo sete parâmetros analíticos combinados em oito testes. Os parâmetros volume de injeção e concentração de ácido fórmico na fase móvel apresentaram maior influência na análise. O método foi considerado robusto podendo ser adotado para uso em outros laboratórios. ABSTRACT In this work the robustness of the chromatographic method to determine phenolic compounds in honey samples of bracatinga honeydew honey was evaluated using the Youden s test. The Youden test proved to be an efficient method for evaluating the robustness of chromatographic methods through experimental design involving seven analytical parameters combined in eight tests. The parameters injection volume and concentration of formic acid in the mobile phase presented greater influence in the analysis. The method was considered robust and could be adopted for use in other laboratories. PALAVRAS-CHAVE: teste de Youden; HPLC-DAD; flavonoides; ácidos fenólicos KEYWORDS: Youden s test; HPLC-DAD; flavonoids; phenolic acids 1. INTRODUÇÃO Em análises químicas, é necessária a validação dos métodos, a fim de atender aos requisitos estabelecidos pelos regulamentos elaborados por autoridades reguladoras. Dentro deste contexto, atualmente o teste de robustez tem despertado interesse. A robustez de um método é avaliada através da sua capacidade de manter o desempenho esperado quando pequenas alterações deliberadas são introduzidas no método, que podem ou não ter influência significativa sobre seu desempenho. Para correta avaliação da confiabilidade do método para uso de rotina em um ou mais laboratórios, é necessário que um número considerável de variáveis seja considerado, mas devido ao fato de algumas apresentarem efeito desprezível, é possível avaliar diversas variáveis simultaneamente (ANVISA, 2004). A avaliação robustez de um método cromatográfico é geralmente laboriosa e complexa, levando-se em consideração o número de variáveis que podem ser consideradas na execução do teste. Parâmetros como composição e fluxo de fase móvel, ph, temperatura, entre muitos outros podem ser considerados, o que justifica a importância da avaliação. O teste de Youden é recomendado
2 (EURACHEM, 2014; INMETRO, 2011), pois além de avaliar a robustez do método aponta a influência de cada variável avaliada no resultado final (YOUDEN e STEINER, 1975). O objetivo deste trabalho é avaliar a robustez do método cromatográfico para determinação de 18 compostos fenólicos em mel de melato de bracatinga. Este mel é produzido pelas abelhas a partir das excreções de insetos sugadores no caule da bracatinga, e sua ocorrência se dá principalmente na região do planalto serrano de Santa Catarina. Alguns estudos tem apontado que méis de melato possuem maior teor de compostos fenólicos em comparação a méis florais (ESCRICHE et al., 2014; HALOUZKA; TARKOWSKI; ZELJKOVIĆ, 2016), e a avaliação do perfil de compostos fenólicos pode ser usada para ajudar a identificar marcadores de origem ou de autenticidade de méis (CAMPONE et al., 2014). Contudo, a determinação destes compostos em méis de melato ainda é restrita, principalmente em méis de melato de bracatinga (SERAGLIO et al., 2016). A robustez do método cromatográfico foi avaliada através do teste de Youden. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Materiais e reagentes Padrões de ácidos ferúlico, siríngico, clorogênico, p-cumárico e cafeico, além dos flavonoides campferol, luteolina, hesperidina, naringenina, pinobanksina, rutina e isoramnetina e o aldeído coniferaldeído foram obtidos da Sigma-Aldrich (Saint Louis, Missouri, EUA). Foram também utilizados os padrões de ácido benzoico (Riedel-de Haën, Seelze, Alemanha), ácido 3,4 dihidroxibenzóico (Acros Organic, Geel, Bélgica), quercetina (Fluka, Saint Gallen, Suiça), ácido gálico (Vetec, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil) e ácido salicílico (Nuclear, Diadema, São Paulo, Brasil). Metanol (MeOH), acetonitrila (ACN), tetrahidrofurano (THF) dimetilsulfóxido (DMSO) e ácido fórmico foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Saint Louis, Missouri, EUA). Os padrões sólidos foram diluídos em metanol com exceção de isoramnetina e hesperidina, dissolvidos em DMSO. Soluções estoque de aproximadamente 1000 µg ml -1, com exceção de pinobanksina (aproximadamente 500 µg ml -1 ) foram armazenadas a -18 C ± 2 até o momento das análises. 2.2 Condições cromatográficas A separação e quantificação de compostos fenólicos foi realizada em cromatógrafo líquido de alta eficiência 1260 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, E.U.A.), acoplado a detector de arranjo de diodos (HPLC/DAD) utilizando coluna Zorbax Poroshell 120 C 18 (50 mm x 4,6 mm d.i., tamanho da partícula de 2,7 µm). O volume de injeção foi de 3 µl. O gradiente de eluição foi composto de ácido fórmico 0,1%, MeOH, ACN e THF em 25 min de corrida. Os compostos fenólicos foram detectados em comprimentos de onda de 240, 260, 280, 300, 325 e 370 nm. 2.3 Avaliação da robustez Para a determinação da robustez do método foi empregado o teste de Youden. Sete parâmetros analíticos foram selecionados para avaliação e pequenas variações foram induzidas nos valores nominais de cada um destes parâmetros, cuja combinação resultou em oito ensaios conforme apresentado na Tabela 1.
3 Tabela 1. Parâmetros analíticos e suas variações aplicadas para avaliação da robustez pelo teste de Youden. Parâmetro analítico Valor nominal Valor alterado Temperatura da coluna ( C) 33 32,5 Vazão (ml min -1 ) 0,73 0,75 Volume de injeção (μl) 3,0 3,5 Comprimento de onda (nm) -* + 2 nm** Tempo de equilíbrio da coluna (min) 4,0 4,5 Concentração de ácido fórmico na fase móvel A (%) 0,10 0,08 Proporção de água na fase móvel de diluição (%) 94,0 91,0 *240, 260, 280, 300, 325 e 370 nm. ** adicionar 2 nm em cada um dos comprimentos de onda. Amostra de mel de melato de bracatinga proveniente da cidade de Urupema, SC fortificada em triplicata de preparo foi injetada em cada combinação dos parâmetros de robustez apresentados na Tabela 2. Para cada combinação foram avaliados as áreas dos picos, a resolução dos picos e o fator de retenção de cada composto. Tabela 2. Delineamento experimental dos parâmetros analíticos para avaliação da robustez pelo teste de Youden. Parâmetro analítico Combinação fatorial Temperatura da coluna ( C) A A A A a a a a Vazão (ml min -1 ) B B b b B B b b Volume de injeção (μl) C c C c C c C c Comprimento de onda (nm) D D d d d d D D Tempo de equilíbrio da coluna (min) E e E e e E e E Concentração de ácido fórmico na fase móvel A (%) F f f F F f f F Proporção de água na fase móvel de diluição (%) G g g G g G G g Condição resultante s t u v w x y z Letras maiúsculas indicam condições nominais e letras minúsculas indicam condições alteradas. A média dos valores nominais foi subtraída da média dos valores alterados, para cada um dos sete parâmetros analíticos estudados, conforme a Equação 1. Para avaliar as diferenças nas respostas após as alterações foi aplicado o teste t para todos os analitos e parâmetros estudados. em que P/p se referem ao efeito de cada um dos sete parâmetros. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Eq. 1 Na Tabela 3 estão apresentados os efeitos da alteração de parâmetros analíticos na resolução entre os pares de picos de compostos fenólicos adjacentes. Pode ser observado que método é robusto quanto a resolução entre os pares de picos adjacentes, com valores abaixo de ± 2,00 de variação entre o valor nominal e o valor alterado, para todos os compostos. Os parâmetros volume de injeção e
4 porcentagem de água na fase móvel de diluição não influenciaram a resolução, uma vez que o teste t não apresentou diferenças significativas entre a condição nominal e a alterada para estes parâmetros. O parâmetro concentração de ácido fórmico na fase móvel foi o que mais influenciou na diferenciação entre as médias de valores nominais e alterados através do teste t, sendo significativo para 4 compostos. Este parâmetro apresenta grande importância na ionização dos compostos em separações cromatográficas. O aumento do ph da fase móvel pode alterar a ionização, de modo que o analito será parcialmente não ionizado, podendo resultar em aumento da largura pico, um dos parâmetros de cálculo da resolução entre os picos. Os demais parâmetros causaram diferenças significativas apenas em um composto cada um. Tabela 3. Efeitos dos parâmetros analíticos na resolução entre os pares de picos de compostos fenólicos. Efeitos Compostos A-a B-b C-c D-d E-e F-f G-g Ácido gálico -0,17 0,43-0,17-0,93* 0,37 0,39 0,05 Ácido 3,4 dhb -0,30 0,15 0,17-0,19-0,12-0,17 0,19 Ácido clorogênico 0,03 0,07 0,00-0,02 0,00-0,10* 0,02 Ácido siríngico 0,11 0,07 0,02-0,11-0,12 0,03-0,12 Ácido cafeico -0,37-0,14-0,43-0,46-0,52 0,72-0,23 Ácido p-cumárico -0,10-0,05-0,16-0,16-0,08 0,34* -0,14 Ácido ferúlico 0,12-0,01 0,05 0,09-0,04 0,11-0,09 Coniferaldeído 0,01-0,18* 0,09 0,06-0,09 0,12-0,10 Ácido benzóico -0,04-0,27-0,06-0,15-0,11 0,36* -0,13 Rutina 0,10 0,87* -0,01-0,02 0,05-0,19 0,01 Ácido salicilico 0,16-0,08 0,04-0,04-0,13 0,09-0,13 Hesperidina 0,73 0,96 0,36 0,41 0,79-2,23* 0,41 Luteolina -0,01-0,10-0,19-0,13-0,22* 0,07 0,09 Quercetina 0,36-0,25 0,09-0,27-0,05-0,24 0,08 Pinobanksina 0,04-0,15 0,06-0,13 0,11-0,03-0,08 Naringenina -0,36* -0,24 0,13-0,02-0,21 0,03 0,29 Campferol + isoramnetina *diferença significativa (p < 0,05) entre a condição nominal e a alterada, pelo teste t; Na Tabela 4 estão apresentados os efeitos da alteração de parâmetros analíticos na área dos picos de compostos fenólicos. Os parâmetros temperatura da coluna, vazão e tempo de equilíbrio da coluna se mostraram robustos, sem provocar diferenças significativas devido a alterações dos mesmos. A alteração do parâmetro comprimento de onda não se mostrou robusta apenas para alterações de área do ácido benzoico, a alteração do parâmetro porcentagem de água na fase móvel de diluição provocou alterações de área dos compostos campferol + isoramnetina (quantificados juntos) e a alteração da concentração de ácido fórmico na fase móvel causou alterações de área dos compostos ácido siríngico e ácido p-cumárico. O parâmetro menos robusto foi o volume de injeção, cuja alteração propiciou valores significativamente diferentes para 13 compostos, sendo, portanto, o parâmetro mais susceptível a provocar alterações de área dos compostos, visto que devido a sensibilidade do sistema de HPLC, alterações de volume de injeção, ainda que pequenas, são detectadas pelo sistema e provocam aumento do sinal analítico. Sistemas cromatográficos automáticos podem minimizar possíveis erros relacionados ou volume de amostra injetado.
5 Tabela 4. Efeitos dos parâmetros analíticos na área dos picos de compostos fenólicos. Efeitos Compostos A-a B-b C-c D-d E-e F-f G-g Ácido gálico 3,32 9,26-27,01* 8,13 3,40-5,26-2,68 Ácido 3,4 dhb 3,92 9,21-28,94* 8,62-0,30-11,95-6,15 Ácido clorogênico -1,31 5,38-11,66* 2,98 2,95-5,64-4,60 Ácido siríngico 13,56 14,30-5,83-5,32-11,47-28,41* 11,03 Ácido cafeico -4,08 2,61-18,19* 0,01 7,86-5,27 2,41 Ácido p-cumárico 22,23 34,33-33,39 12,35 14,75-63,63* -1,59 Ácido ferúlico 3,28 16,36-24,74* 4,40-0,54-14,54 0,50 Coniferaldeído 3,89 13,88-21,61* -15,46-2,51-11,92 2,97 Ácido benzóico 11,17-2,69-21,93 72,38* -7,99-1,01-9,51 Rutina 0,69 0,14-5,92* 3,27-0,46-1,27 2,04 Ácido salicilico 4,51-7,58-22,19* 10,76 14,46 4,21-0,80 Hesperidina -9,02-0,44-22,98* -7,22-6,82 17,92-3,31 Luteolina 0,24 2,83-6,55* 3,13 1,10-1,10 2,03 Quercetina 2,27-0,30-0,49 0,58 1,21 0,01 6,97 Pinobanksina -20,91-0,50-29,87* -17,68 6,91 2,37 8,41 Naringenina 0,96 2,64-72,04* -35,94-2,89-6,05 16,39 Campferol + isoramnetina -1,29 2,72-10,42* 2,14 0,93-2,40 15,76* *diferença significativa (p < 0,05) entre a condição nominal e a alterada, pelo teste t; Na Tabela 5 estão apresentados os efeitos da alteração de parâmetros analíticos no fator de retenção dos compostos fenólicos. Nenhum parâmetro avaliado provocou diferenças significativas entre as condições nominais e alteradas para todos os compostos. Tabela 5. Efeitos dos parâmetros analíticos no fator de retenção dos picos do método para quantificação de compostos fenólicos. Efeitos Compostos A-a B-b C-c D-d E-e F-f G-g Ácido gálico -0,05 0,06 0,06 0,06 0,05-0,08-0,03 Ácido 3,4 dhb -0,10 0,11 0,10 0,10 0,09-0,14-0,05 Ácido clorogênico -0,16 0,21 0,15 0,12 0,09-0,13-0,09 Ácido siríngico -0,16 0,24 0,15 0,14 0,11-0,16-0,08 Ácido cafeico -0,19 0,16 0,17 0,19 0,13-0,16-0,14 Ácido p-cumárico -0,27 0,13 0,22 0,25 0,15-0,13-0,21 Ácido ferúlico -0,27 0,12 0,24 0,26 0,15-0,09-0,24 Coniferaldeído -0,26 0,15 0,26 0,27 0,15-0,11-0,24 Ácido benzóico -0,29 0,13 0,29 0,30 0,17-0,13-0,26 Rutina -0,33-0,06 0,27 0,29 0,11 0,10-0,35 Ácido salicilico -0,37 0,08 0,32 0,33 0,17 0,04-0,33 Hesperidina -0,37-0,13 0,30 0,30 0,11 0,16-0,42 Luteolina -0,51-0,16 0,37 0,42 0,19 0,20-0,64 Quercetina -0,55-0,18 0,39 0,43 0,18 0,21-0,65 Pinobanksina -0,56-0,15 0,41 0,45 0,19 0,20-0,64 Naringenina -0,57-0,19 0,41 0,45 0,20 0,23-0,68 Campferol + isoramnetina -0,63-0,25 0,44 0,48 0,20 0,34-0,75
6 O Inmetro (2011) recomenda que se não houver diferença significativa, deve-se calcular a média e o desvio entre os 8 resultados, de s até z. O coeficiente de variação entre os 8 ensaios para o fator de retenção dos compostos variou entre 2,69 e 7,11%, demonstrando a robustez do método para avaliação do fator de retenção. Pode ser observado que a aplicação do teste t é importante na avaliação da robustez de métodos analíticos, pois a avaliação através apenas dos dados obtidos da equação recomendada pelo teste de Youden pode gerar interpretações equivocadas referentes aos parâmetros analíticos testados para alguns compostos. 4. CONCLUSÕES Os resultados mostram que os parâmetros que exigem mais atenção são o volume de injeção e a concentração de ácido fórmico na fase móvel, já que estes foram os responsáveis por propiciar diferenças significativas em maior número de compostos. Entretanto, pode-se considerar que o método é adequadamente robusto, uma vez que erros devido a volumes de injeção diferentes não são tão comuns já que o sistema cromatográfico é completamente automatizado. O preparo correto de fase móvel é uma etapa crítica, seja pela importância de manutenção do sistema em perfeitas condições de uso, seja pela preocupação em não provocar alterações quando do preparo incorreto. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia para Qualidade em Química Analítica: Uma Assistência a Acreditação. [s.l: s.n.]. v. 1 CAMPONE, L. et al. Determination of phenolic compounds in honey using dispersive liquid-liquid microextraction. Journal of Chromatography A, v. 1334, p. 9 15, ESCRICHE, I. et al. Suitability of antioxidant capacity, flavonoids and phenolic acids for floral authentication of honey. Impact of industrial thermal treatment. Food Chemistry, v. 142, p , EURACHEM. The fitness for purpose of analytical nethods a laboratory guide to method validation and related topicseurachem Guide, Disponível em: < HALOUZKA, R.; TARKOWSKI, P.; ZELJKOVIĆ, S. Ć. Characterisation of phenolics and other quality parameters of different types of honey. Czech Journal of Food Sciences, v. 34, n. No. 3, p , INMETRO. (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial). DOQ-CGCRE Orientação sobre validação de métodos analíticos, p. 20, SERAGLIO, S. K. T. et al. Development and validation of a LC-ESI-MS/MS method for the determination of phenolic compounds in honeydew honeys with the diluted-and-shoot approach. Food Research International, v. 87, p , YOUDEN, W. J.; STEINER, E. H. Statistical manual of AOAC Association of Official Analytical Chemistry. Washington: AOAC, 88 p., 1975.
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