VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA PARA A DETERMINAÇÃO DE FÁRMACOS POR HPLC VALIDATION OF METHODOLOGY FOR THE DETERMINATION OF DRUGS BY HPLC
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1 VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA PARA A DETERMINAÇÃO DE FÁRMACOS POR HPLC Tais Cristina Filippe 1 *; Franciane de Almeida Brehm 1 ; Júlio César Rodrigues de Azevedo 1,2 & Cristóvão Vicente Scapulatempo Fernandes 2 Resumo Uma grande variedade de contaminantes, incluindo os produtos farmacêuticos, é continuamente liberada no ambiente aquático. Os efluentes de estações de tratamento de esgoto são bem conhecidos por ser uma possível fonte para a introdução de medicamentos no sistema hídrico. O presente trabalho teve como objetivo validar uma metodologia para verificar sua eficiência na determinação de paracetamol, diclofenaco, ibuprofeno e fenoprofeno em quatro pontos de amostragem do rio Atuba. As amostras de água coletadas foram submetidas ao processo de extração em fase sólida e posteriormente foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para a determinação dos produtos farmacêuticos. Para realizar a validação da metodologia empregada foram utilizados os padrões estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária. O método de quantificação mostrou-se eficiente para a determinação desses analitos em amostras de água. Os resultados presentes neste trabalho indicam que a presença desses fármacos em águas naturais revela uma possível contaminação por águas residuais de ETE. Palavras-Chave Produtos farmacêuticos. Cromatografia líquida. VALIDATION OF METHODOLOGY FOR THE DETERMINATION OF DRUGS BY HPLC Abstract A wide variety of contaminants, including drugs, are continuously released into the aquatic environment. The sewage treatment effluents are well known to be a possible source of contaminants in the hidric system. The objective of this work it was to realize validation of methodology for check its efficiency in determining the paracetamol, diclofenac, ibuprofen and fenoprofen in four sampling points of Atuba river. The samples was submitted to the extraction process in solid phase and analyzed by high efficient liquid chromatography (HPLC) for the determination of the drugs. To perform the validation of the methodology employed were used the standards set by the Agência Nacional de Vigilância Sanitária. The method for the quantification proved to be efficient for the determination of these analytes in water samples. The results presented in this work indicate that the presence of these drugs in natural waters show a possible contamination of wastewater of sewage treatment effluents. Keywords Pharmaceutical drugs. Liquid chromatography. 1 Laboratório de Estudos Avançados de Química Ambiental, Universidade Tecnológica Federal do Paraná: taisfilippe@gmail.com 2 Laboratório de Estudos Avançados de Química Ambiental, Universidade Tecnológica Federal do Paraná: jcrazevedo@hotmail.com XXI Simpósio Brasileiro de Recursos Hídricos 1
2 INTRODUÇÃO A crescente expansão dos grandes centros urbanos e industriais tem promovido uma degradação progressiva da qualidade dos recursos hídricos devido ao aumento da contaminação de rios, lagos e reservatórios por compostos conhecidos como contaminantes emergentes. O desenvolvimento de métodos novos e mais sensíveis para detectar substâncias químicas e determinar seus efeitos biológicos vem chamando a atenção de pesquisadores para os contaminantes emergentes, como é o caso dos fármacos. Essas substâncias são frequentemente encontradas, em concentrações significativas, em efluentes de Estações de Tratamento de Esgoto (ETEs) e águas naturais devido a sua incompleta degradação (AL-ODAINIA et al, 2010; BILA e DEZOTTI, 2003). Estudos demonstram que uma extensa gama de fármacos e seus metabólitos estão presentes em ambientes aquáticos em várias partes do mundo (STUMPF et al, 1999). Em um trabalho realizado por Machado (2010), no rio Atuba, a concentração de hormônios sexuais femininos como o 17β-estradiol chegou a 13,45 µg L -1, de estrona, 1,80 µg L -1 e de etinilestradiol, 5,90 µg L -1. Osawa (2013) estudou a ocorrência de fármacos anti-hipertensivos e determinou 4,66 µg L -1 de metroprolol no rio Atuba. Com base nesses estudos, nota-se que os níveis de concentração detectados encontram-se na faixa de µg L -1, requerendo o desenvolvimento de metodologias eficientes para extração e detecção desses contaminantes na água, possibilitando sua quantificação para entender o nível de contaminação do rio Atuba por micropoluentes. MATERIAIS E MÉTODOS Área de Estudo e Amostragem A sub-bacia do rio Atuba possui uma área de drenagem de 63 km² e encontra-se altamente degradada, devido ao problema de ocupação irregular nas suas margens, ocasionando lançamentos clandestinos de esgoto doméstico e resíduos sólidos no mesmo (CHEPAK, 2008). Por ser um rio que recebe alta carga de esgoto doméstico suas águas não são mais utilizadas para captação de água para abastecimento desde 1998, mas apenas para assegurar a vazão remanescente (ANDREOLI, 2003). Foram realizadas duas campanhas amostrais no rio Atuba, a primeira em outubro de 2014 (período de estiagem) e a segunda em março do ano de 2015 (período de chuvas). Foi coletado um litro de amostra em quatro pontos ao longo do rio Atuba (AT1, AT2, AT3 e AT4). As amostras foram armazenadas em garrafas tipo âmbar com volume de 1 L, previamente descontaminadas com solução de detergente extran 5 %. Extração dos Fármacos da Água Os contaminantes emergentes analisados nesse trabalho estão presentes no Quadro 1, com suas respectivas classes. Esses fármacos foram escolhidos devido à grande produção e ao amplo consumo pela população em geral. Quadro 1 - Fármacos estudados Fármaco Classe Paracetamol Analgésico Fenoprofeno Anti-inflamatório Diclofenaco Anti-inflamatório Ibuprofeno Anti-inflamatório A metodologia utilizada para a análise dos fármacos foi adaptada de Ide (2013). Foi utilizado um volume de 1 litro de amostra para a extração dos fármacos. Primeiramente a amostra foi filtrada XXI Simpósio Brasileiro de Recursos Hídricos 2
3 em membranas de acetato de celulose 0,45 µm para retirada de material particulado. Em seguida o ph da amostra foi ajustado para 3 por meio da adição de HCl 6 mol L -1. Foi realizada a extração em fase sólida utilizando cartucho Supel-select HLB pré-condicionado com 6 ml de hexano, 6 ml de acetona, 6 ml de metanol e 6 ml de água Mili-Q. As amostras passaram pelos cartuchos com um fluxo de 12 a 15 ml min -1 e na sequência foram secos com nitrogênio gasoso por 10 min. A eluição dos analitos foi feita utilizando 6 ml de acetonitrila e 6 ml de acetona, recolhidos em balões de fundo redondo. As amostras foram então levadas para secar em rotaevaporador e em seguida reconstituídas com 1 ml de acetonitrila, sendo a seguir submetidas ao equipamento de ultra-som. Análise Cromatográfica A análise dos quatro fármacos extraídos das amostras de água foram realizadas por cromatografia em fase líquida em um aparelho Agilent modelo 1260, bomba quaternária de 600 bar, equipado com uma coluna de octadecilsilano (Eclipse Plus C18) com 5 μm de diâmetro de poro, 250 mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro interno. Utilizou-se detector com arranjo de fotodiodos, modelo As condições ótimas aplicadas no método foram eluição em modo isocrático com fase móvel composta por 70 % acetonitrila e 30 % água ultra-pura com ph ajustado para 3,0, uma vazão de 0,8 ml min -1 e volume de injeção de 5 µl. Os comprimentos de onda monitorados foram 230 nm (ibuprofeno), 244 nm (paracetamol e fenoprofeno) e 274 nm (diclofenaco). Os tempos de retenção dos analitos foram: 3,04 min para o paracetamol, 6,06 para o fenoprofeno, 7,05 para o diclofenaco e 7,92 para o ibuprofeno. O tempo total da corrida foi de 9 minutos. Validação do Método Cromatográfico A validação é o ato documentado que atesta que qualquer procedimento, processo, equipamento, material, operação ou sistema realmente conduza aos resultados verdadeiros ANVISA (2001). A metodologia empregada para validação do método analítico foi baseada nas Resoluções 475/02 e 899/03 da ANVISA. Utilizou-se padronização externa para a quantificação dos compostos de interesse por cromatografia. Foi preparada uma solução estoque de 1000 mg L -1 de cada analito por meio da pesagem do padrão sólido. A partir dessas soluções estoque foi preparada uma solução de 10 mg L -1 contendo os quatro compostos de interesse e as soluções de trabalho para as curvas analíticas foram preparadas pela diluição direta da solução de 10 mg L -1. A linearidade foi obtida por meio da equação da regressão linear no qual foi obtido o coeficiente de correlação (r 2 ) de acordo com a resolução 899/03 da ANVISA, e a sensibilidade foi expressa pela inclinação da curva analítica de regressão linear. Os limites de detecção e quantificação foram obtidos pelo método estatístico recomendado pela ANVISA, com base nas equações abaixo: LD = 3 S a (1) IC LQ = 10 S a IC (2) Onde S a é a estimativa do desvio padrão no intercepto com o eixo y de, no mínimo três curvas analíticas construídas contendo concentrações de analito próximas ao suposto limite de quantificação e IC é a inclinação da curva analítica. XXI Simpósio Brasileiro de Recursos Hídricos 3
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Validação do Método Cromatográfico A Tabela 1 mostra a equação da regressão linear e o coeficiente de correlação quatro compostos analisados. Tabela1 - Curvas analíticas e coeficientes de correlação (r 2 ) Composto Curva analítica Coeficiente de correlação (r 2 ) Paracetamol Área = 29,32conc + 0,1533 0,9975 Fenoprofeno Área = 4,31conc + 0,0318 0,9945 Diclofenaco Área = 11,95conc 0,3144 0,9965 Ibuprofeno Área = 7,11conc 0,4038 0,9980 Como recomendado pela resolução 899/03 da ANVISA, todas as curvas analíticas apresentaram coeficiente de correlação mínimo igual a 0,99. A sensibilidade foi verificada a partir da inclinação da curva analítica. As curvas analíticas tiveram concentrações variando de 0,1 a 1,0 mg L -1. A Figura 1 mostra as curvas analíticas dos compostos na terceira campanha amostral e através dela é possível verificar as tendências da sensibilidade para cada composto. Observa-se que o paracetamol é o composto que apresentou a maior sensibilidade dentre os quatro fármacos analisados por este método analítico. Figura 1- Curva analítica obtida com solução-padrão para os quatro fármacos analisados Os valores dos limites de detecção e de quantificação do método utilizado no HPLC-DAD constam na Tabela 2. Tabela 2 - Limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) Composto LD (ng.l -1 ) LQ (ng.l -1 ) Paracetamol Fenoprofeno Diclofenaco Ibuprofeno XXI Simpósio Brasileiro de Recursos Hídricos 4
5 Os limites de quantificação foram comparáveis aos resultados obtidos por Raimundo (2007). O diclofenaco foi o fármaco que teve os limites mais próximos ao estudo realizado por Raimundo (2007). Já o paracetamol e o ibuprofeno tiveram limites acima dos obtidos nesse estudo. Desse modo, os limites obtidos foram considerados satisfatórios para análise desses compostos em amostras de água. Determinação dos fármacos Concentrações de paracetamol foram detectadas nas duas campanhas amostrais e em três pontos de coleta. Apenas no ponto AT1 esse analito não foi encontrado como é mostrado na Tabela 3. Nas duas campanhas, as concentrações do paracetamol foram superiores no ponto AT4, localizado à jusante da ETE Atuba-Sul, em comparação com o ponto AT3, localizado à montante da ETE Atuba-Sul. Desse modo, nota-se que a estação de tratamento de esgoto Atuba-Sul contribui de forma significativa para a entrada desse fármaco no corpo hídrico receptor devido à provável ineficiência na remoção desse tipo de composto. Tabela 3 - Concentrações do paracetamol (ng.l -1 ) Ponto 1ª Campanha (10/2014) 2ª Campanha (03/2015) AT1 < LD < LD AT AT AT Os fármacos diclofenaco e ibuprofeno foram detectados nos quatro pontos de coletado do rio Atuba na primeira campanha, período de estiagem, em concentrações variando de a ng L -1 e a ng L -1 respectivamente. As concentrações desses fármacos também foram superiores no ponto AT4 em relação ao ponto AT3. Na segunda campanha amostral o ibuprofeno não foi detectado em nenhuma amostra em concentrações acima de 90 ng L -1, a qual corresponde ao limite de detecção do método empregado, e o diclofenaco foi encontrado apenas no ponto AT2 em concentração igual a ng L -1. As significativas variações nas concentrações desses contaminantes são devidas, provavelmente, à elevada precipitação pluviométrica no mês da segunda campanha amostral. O fenoprofeno foi o único fármaco que não foi detectado utilizando a metodologia empregada, sendo que nos quatro pontos amostrados e nas duas campanhas as concentrações ficaram abaixo do seu limite de detecção (LD = 46 ng L -1 ). CONCLUSÃO Os resultados obtidos na validação do método cromatográfico proporcionaram a confiabilidade do mesmo e, a quantificação dos analitos em concentrações baixas (ng L -1 ). Os limites foram comparáveis ao estudo realizado por Raimundo (2007) e mostraram-se satisfatórios para quantificação dos fármacos propostos. Os resultados das análises no rio Atuba mostraram que há uma possível contribuição da estação de tratamento de esgoto (ETE Atuba-Sul) com a contaminação das águas do corpo aquático receptor por produtos farmacêuticos. Com base nesses resultados, percebe-se a necessidade da realização de mais estudos na área de contaminação dos recursos hídricos por contaminantes emergentes, com a finalidade de identificar e quantificar esses compostos e suas possíveis fontes de contaminações. XXI Simpósio Brasileiro de Recursos Hídricos 5
6 REFERÊNCIAS AL-ODAINIA, N.A; ZAKARIA, M. P; YAZIZA, M.I; SURIFB, S. (2010). Multi-residue Analytical method for human pharmaceuticals and synthetic hormones in river water and sewage effluents by solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal Of Chromatography A, v. 1217, p ANDREOLI, C. V. (2003). Mananciais de abastecimento: planejamento e gestão: estudo de caso do Altíssimo Iguaçu. Curitiba: SANEPAR, 494 p. ANVISA; Agência Nacional de Vigilância Sanitária; Resolução - RE n 161, de 11 de setembro de ANVISA; Agência Nacional de Vigilância Sanitária; Resolução - RE n o 475, de 19 de março de ANVISA; Agência Nacional de Vigilância Sanitária; Resolução - RE n o 899, de 29 de maio de BILA, D. M.; DEZOTTI, M. (2003). Fármacos no meio ambiente. Química Nova, v. 26, n. 4, p CHEPAK, M. F. A. Atlas Geográfico do Município de Pinhais. (2008). Disponível em: Acessado em: 03/05/2015. IDE, A. H. (2013). Produtos Farmacêuticos e de Higiene Pessoal no Rio Iguaçu e seus Afluentes. 119f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia Ambiental). Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Ambiental. Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Campus Curitiba. MACHADO, K. S. (2010). Determinação de hormônios sexuais femininos na Bacia do Alto Iguaçu, Região Metropolitana de Curitiba-PR. 116p. Dissertação (Mestrado em Engenharia Ambiental) Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Recursos Hídricos e Ambiental, Universidade Federal do Paraná, Curitiba. OSAWA, R. A.(2013). Determinação de fármacos anti-hipertensivos na bacia do Alto Iguaçu. 86f. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Recursos Hídricos e Ambiental). Programa de Pós- Graduação em Engenharia de Recursos Hídricos e Ambiental. Universidade Federal do Paraná, Curitiba. RAIMUNDO, C. C. M. (2007). Ocorrência de interferentes endócrinos e produtos farmacêuticos nas águas superficiais da bacia do rio Atibaia. 126p. Dissertação (Mestrado em Química Analítica). Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, Campinas. STUMPF, M.; TERNES, T. A.; WILKEN, R.; RODRIGUES, S. V.; BAUMANN, W.(1999).Polar drug residues in sewage and natural waters in the state of Rio de Janeiro, Brazil. The Science of the Total Environment, v. 225, p XXI Simpósio Brasileiro de Recursos Hídricos 6
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