Epigenomics-Based Diagnostics Diagnóstico Baseado em Epigenômica

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1 Epigenomics-Based Diagnostics Diagnóstico Baseado em Epigenômica, Chefe da Bioquímica Clínica, Departamento de Bioquímica Clínica, Mount Sinai Hospital and University Health Network, e Professor e Chefe, Divisão de Bioquímica Clínica, Departamento de Medicina Laboratorial e Patobiologia, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada. O termo "epigenética," primeiro criado em 1942, se refere às características hereditárias das células (após muitas rodadas de divisão celular) que não envolvem mudanças na sequência subjacente do DNA. Os 2 mecanismos epigenéticos predominantes são metilação do DNA e modificação da histona. Mudanças epigenéticas, especialmente metilação do DNA na posição 5 da citosina, que ocorre nas regiões ricas em guanina/citosina (ilhas CpG ), podem ter grandes efeitos na transcrição dos genes. Por exemplo, é sabido que extensiva metilação nas regiões ricas em GC dos promotores dos genes ou outras áreas podem afetar dramaticamente a transcrição dos genes e consequentemente toda a biologia de uma célula específica. Mudanças epigenéticas são preservadas quando as células se dividem. Embora seja bem conhecido que o câncer pode ser causado pela perda dos genes supressores de tumores (por exemplo, através da mutação ou deleção), outro importante mecanismo de silenciar genes críticos é através da metilação. Existem numerosos exemplos de genes que podem ser silenciados por metilação. Desse modo é razoável sugerir que a metilação do DNA possa ser um marcador do silenciamento do gene e que tais modificações possam se correlacionar com o início e progressão do câncer. Por essa razão, é provável que mudanças epigenéticas no DNA possam carregar informação diagnóstica, prognóstica ou preditiva. Desse modo não é surpreendente que mudanças epigenômicas/epigenéticas tenham atraído grande atenção recentemente para sua possível aplicação no câncer e em outros diagnósticos de doenças. Nessa, 4 peritos no campo discutem o presente e o futuro da epigenômica e como são usadas nas aplicações diagnósticas. Você poderia descrever rapidamente o campo da epigenômica? David Sidransky2: O campo da epigenômica está focado em achar alterações genômicas além das mudanças na sequência do DNA. Peter W. Laird3: Epigenômica é o estudo da escala do genoma da distribuição das marcas epigenéticas, que são modificações estáveis do DNA ou da conformação do DNA que transmitem informação hereditária não geneticamente codificada. Embora haja algum debate quanto a que marcas são fielmente preservadas durante a divisão celular, é geralmente aceito que as marcas epigenômicas incluem metilação do DNA na citosina 5, modificações das extremidades das histonas, e posicionamento do nucleossoma. Paul Cairns4: O estudo da metilação do DNA, das modificações da histona, do estado da cromatina, a da interferência do RNA, e o efeito relacionado sobre a expressão gênica em diferentes tipos de células normais que compartilham um genoma idêntico, entre a célula pro-

2 genitora normal e a célula tumoral, e em outras doenças humanas. Bharati Bapat5: Epigenômica se refere à regulação do genoma por mudanças hereditárias na expressão gênica mediadas por fatores de sequência de não DNA. Essas incluem metilação do DNA, regulação da estrutura e função da cromatina, e pequena regulação mediada por RNA não codificante. Uma característica única é que diferente das mutações nas sequências do DNA, muitas dessas alterações são potencialmente reversíveis por natureza e desse modo fornecem alvos atraentes para abordagens terapêuticas. Quais técnicas são usadas para diagnóstico epigenômico? Essas técnicas são facilmente adaptáveis aos laboratórios diagnósticos? David Sidransky: Existem muitas técnicas usadas para encontrar mudanças epigenômicas em células cancerosas. Para metilação do promotor, essas incluem sequenciamento do DNA modificado, abordagens baseadas nos arranjos, e testes baseados no PCR quantitativo. Sim, todas essas abordagens podem ser adaptadas aos laboratórios diagnósticos. Algumas, como o PCR quantitativo, já estão integradas em muitos laboratórios. Peter W. Laird: Técnicas da escala do genoma para análise epigenética são tecnicamente desafiadoras e improváveis de ser adaptadas por laboratórios diagnósticos no futuro próximo. Testes específicos dos genes baseados no PCR em tempo real são mais facilmente adaptados às plataformas comerciais presentes nos laboratórios diagnósticos e oferecem a vantagem de elevada sensibilidade e especificidade técnica. Paul Cairns: PCR específico da metilação é a tecnologia predominante usada para diagnóstico baseado na epigenômica. A disponibilidade de kits comerciais de modificação de bissulfito e da tecnologia quantitativa do PCR em tempo real significa que a metilação é mais prontamente adaptável aos laboratórios diagnósticos. Mais recentemente, PCR quantitativo de transcrição reversa tem sido usado para detecção da expressão do microrna como uma ferramenta diagnóstica. Bharati Bapat: Várias técnicas estão disponíveis para detectar mudanças epigenômicas. Metilação do DNA é detectada por análise de sequência do DNA modificado de bissulfito. Para diagnóstico epigenético, metilação do DNA e micrornas são detectados por testes quantitativos baseados no PCR e técnicas de alta produtividade baseadas nos microarranjos. Testes baseados no PCR são facilmente adaptáveis aos laboratórios diagnósticos e já estão implementados no diagnóstico do câncer. Quais são as distintas vantagens da epigenômica sobre outras técnicas para o diagnóstico? Quais são as desvantagens mais sérias do diagnóstico baseado na epigenômica? David Sidransky: No câncer, metilação do promotor produz um sinal positivo, portanto achar alelos metilados torna o trabalho de encontrar células ou moléculas raras mais fácil do que procurar por eventos que estejam ausentes nas células. Ao contrário das mutações genéticas, onde um grupo de tumores pode ter centenas de diferentes mutações, definir metilação densa em um local é mais fácil e mais sensível às técnicas de alta produtividade. As desvantagens dessa abordagem são que mudanças epigenéticas são diversas e requerem vários tipos de materiais e testes. Também, ainda temos que testar vários locais ou alterações para cobrir um tipo de tumor. Peter W. Laird: Perfis epigenômicos são bastante estáveis e relativamente impermeáveis às flutuações no estado fisiológico e às condições de coleta das amostras. Testes de metilação do DNA possuem uma vantagem de que o analito do DNA é resistente à degradação, tanto in vivo quanto após se obter a amostra. As marcas epigenéticas em uma região do genoma determinam o potencial para expressão gênica, em vez do estado real da expressão. Portanto, o epigenoma transmite informação não plenamente

3 capturada pelos perfis de expressão gênica. A desvantagem mais séria do diagnóstico baseado na epigenômica é a dificuldade técnica da análise epigenômica. Paul Cairns: Para diagnóstico de câncer as vantagens distintas são que hipermetilação aberrante é frequente e precoce na carcinogênese, que é uma mudança positiva, e que tecnologia de detecção sensível está disponível. As desvantagens da metilação são que uma quantidade relativamente grande de bioamostra é necessária (como com qualquer alvo de detecção baseado no ácido nucléico) e que a robustez do teste depende de cuidadoso design e operação. Bharati Bapat: A detecção das mudanças epigenéticas, particularmente mudanças da metilação do DNA, possui várias vantagens sobre os marcadores genéticos convencionais. Para um dado gene, mutações pontuais frequentemente ocorrem em vários locais nos tumores individuais. Em contraste, metilação do DNA geralmente ocorre sobre a mesma região do gene (por exemplo, promotor), e isso grandemente simplifica o design e interpretação dos testes de seleção. Metilação do DNA constitui um sinal positivamente detectável, ao contrário de uma perda de sinal, tais como deleções cromossômicas. Metilação anormal do DNA geralmente não ocorre em células normais. Portanto, DNA derivado do tumor pode ser detectado com um alto grau de especificidade, particularmente em fluidos corporais tais como saliva, soro, ou amostras de urina. A principal desvantagem do diagnóstico baseado na epigenômica é que vários diferentes testes podem ser necessários para detectar diferentes tipos de mudanças epigenéticas num câncer. Quais são os cânceres mais preferidos para diagnóstico por epigenômica? David Sidransky: Todos os cânceres possuem alterações epigenômicas. Câncer de pulmão, mama, próstata, cabeça e pescoço, e cólon também pode ser sensível a abordagens precoces de detecção. Peter W. Laird: Anormalidades epigenômicas têm sido descritas para uma ampla variedade de tipos de câncer. Perfis epigenômicos podem ser usados para identificar subtipos moleculares de um câncer específico, com resultados clínicos associados. Um exemplo disso seria os fenótipos metiladores da ilha CpG, descritos para vários tipos de câncer. Padrões anormais da metilação do DNA podem ser usados para detectar a presença de células malignas ou préneoplásicas em amostras luminais ou biópsias de tecidos para cânceres em locais acessíveis. Metilação do DNA anormal também pode ser detectada no DNA flutuante derivado do tumor na corrente sanguínea de alguns pacientes com câncer. Tais testes são melhores aplicados aos cânceres com procedimentos de detecção de acompanhamento bem estabelecidos, tais como colonoscopia para câncer colorretal. Paul Cairns: Existem estudos de viabilidade do diagnóstico de todos os tipos câncer na literatura. Cânceres onde as biópsias dos tecidos são obtidas, provavelmente possuem mais atração porque eles geralmente contêm uma maior proporção de células neoplásicas comparada a uma amostra do fluido corporal. Bharati Bapat: Todos os cânceres carregam alterações epigenéticas. Atualmente, testes de detecção da metilação do DNA são oferecidos para a detecção de cânceres de próstata, pulmão, cérebro, e também certos subtipos (mismatch-repair deficiente) de câncer do cólon. Testes de detecção do microrna também estão atualmente sendo desenvolvidos para a detecção de câncer pancreático e outros cânceres. Existem aplicações diagnósticas epigenômicas além do câncer que tenham sido consideradas? David Sidransky: Eu não sou perito nessa área. Peter W. Laird: Caracterizações epigenômicas estão em andamento para um grande número de condições crônicas, incluindo doenças psiquiátricas e neurodegenerativas, doença cardiovascular, e diabetes. Dois principais problemas confrontam o uso do diagnóstico epigenômico para tais doenças. Primeiro, essas doenças ge-

4 ralmente não têm expansão clonal das células com uma definida anormalidade epigenética, e, segundo, o tecido alvo da doença pode não estar prontamente acessível para testes diagnósticos. Até o ponto em que a doença é reflexiva de alterações epigenômicas sistêmicas, tecidos substitutos tais como leucócitos podem ser fontes diagnósticas apropriadas de DNA ou cromatina. Paul Cairns: Sim, para duas doenças, síndromes de Prader Willi e Angelman, onde uma minoria dos casos surge de um defeito na impressão. Bharati Bapat: Outras aplicações diagnósticas epigenéticas não são tão comuns quanto aquelas vistas para o diagnóstico do câncer. Entretanto, análise da metilação do DNA é um dos testes diagnósticos oferecidos para doenças genéticas hereditárias associadas com "impressão genômica," tais como síndrome de Angelman, síndrome de Prader Willi, e síndrome de Beckwith Wiedemann. As duas últimas doenças estão associadas com desenvolvimento do tumor. Existem testes comerciais para diagnóstico epigenômico no momento? Eles são usados na clínica? David Sidransky: A metilação da MGMT6 (O-6- metilguanina-dna metiltransferase) no glioblastoma e a metilação da GSTP1 (glutationa S- transferase pi 1) nos cânceres de próstata possuem estudos bem discutidos e são oferecidas agora nos laboratórios da CLIA. Ambas provavelmente serão aprovadas relativamente em breve pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos. Peter W. Laird: Eu tenho um conflito de interesse em responder essa pergunta. Paul Cairns: Hipermetilação do promotor gênico da MGMT para previsão de resposta para temozolomida no tecido do glioma, GSTP1 e APC (polipose coli adenomatosa) hipermetilação no tecido da biópsia da próstata para detecção de câncer, metilação da vimentina em teste baseado nas fezes para câncer colorretal, e SEPT9 (septina 9) metilação no DNA sérico para câncer colorretal. Também existem testes para as síndromes de Prader Willi e Angelman. Bharati Bapat: Sim, detecção da metilação da GSTP1 no câncer de próstata, MLH1 [mutl homólogo 1, câncer de cólon, metilação da não polipose do tipo 2 (E. coli)] com deficiente mismatch-repair para câncer de cólon, e metilação da MGMT no glioblastoma são alguns exemplos de tais testes usados na clínica. Qual é o seu ponto de vista sobre o futuro do diagnóstico baseado na epigenômica para os próximos 10 anos? David Sidransky: Testes epigenômicos serão incorporados à maioria dos tipos de câncer para detecção precoce, prognóstico, e previsão para resposta terapêutica. Peter W. Laird: A aplicação clínica do diagnóstico epigenético provavelmente ficará restrita aos marcadores de metilação do DNA no futuro próximo. O custo rapidamente declinante do sequenciamento genômico pode possibilitar o perfil epigenômico de todo o genoma na próxima década. Entretanto, é mais provável que abordagens de todo o genoma serão usadas para descoberta do marcador em cenários de pesquisa e que testes clínicos epigenéticos serão baseados nos genes individuais, ou em painéis de genes. Paul Cairns: Para o câncer, dependerá do nosso entendimento da carcinogênese precoce e em particular a interface entre envelhecimento e câncer. É possível que metilação aberrante se torne um marcador de risco do câncer. Para outras doenças comuns, como Andy Feinberg ressaltou, alterações no epigenoma acumuladas durante a vida são pelo menos uma causa subjacente para diferentes susceptibilidades à doença entre indivíduos quanto, digamos, polimorfismos de nucleotídeo único, e epigenômica na doença com exceção do câncer está se tornando uma área de intenso estudo. Bharati Bapat: Diagnóstico baseado na epigenômica é uma área emergente com grande potencial para aplicação clínica. No futuro, metila-

5 ção do DNA e testes baseados no microrna progressivamente serão incorporados como biomarcadores do câncer de detecção e prognóstico precoces e como preditores de resposta à terapia. No contexto da medicina personalizada, como a epigenômica irá interagir com outros desenvolvimentos diagnósticos moleculares? David Sidransky: Epigenômica será uma das várias alterações comumente testadas para definir a melhor maneira para lidar com ou tratar um paciente com câncer. Peter W. Laird: Perfis epigenômicos transmitem informação que complementa a expressão gênica e perfis de mutação. Alguns subtipos moleculares, tais como fenótipos dos metiladores da ilha CpG são mais facilmente reconhecidos pelo perfil epigenômico do que pela expressão, número de cópias, ou perfil de mutação. Portanto, eu antecipo que análise epigenômica será uma ferramenta indispensável em nosso arsenal diagnóstico para selecionar as estratégias terapêuticas mais apropriadas para cada paciente. Paul Cairns: Para o câncer, por exemplo, é muito provável que quimioresistência intrínsica e adquirida terá um componente epigenético. Inativação do BRCA1 (câncer de mama 1, início precoce) por hipermetilação no câncer esporádico de mama ou de ovário deve conferir sensibilidade semelhante aos inibidores polimerase poli(adp-ribose) como as mutações pontuais de inativação fazem nos cânceres hereditários. Para outras doenças humanas comuns é possível, até mesmo provável, que conhecimento epigenômico seja tão importante quanto o genoma na susceptibilidade. Bharati Bapat: Detecção de um ou de vários biomarcadores epigenéticos estará integrada com outros testes de diagnósticos moleculares para determinar as estratégias ideais para tratamentos de pacientes com câncer. Notas de Rodpé 2 David Sidransky, Diretor, Pesquisa do Câncer de Cabeça e Pescoço, Johns Hopkins Sidney Kimmel Cancer Center, e Professor, Otolaringologia e Oncologia, Johns Hopkins University, Baltimore, MD; e Presidente, Rede de Pesquisa de Detecção Precoce, National Cancer Institute, Rockville, MD. 3 Peter W. Laird, Diretor, USC Epigenome Center, Norris Comprehensive Cancer Center, Keck School of Medicine, University of Southern California, e Professor Adjunto, Departamentos de Cirurgia e de Bioquímica e Biologia Molecular, University of Southern California, Keck School of Medicine, Los Angeles, CA. 4 Paul Cairns, Professor Adjunto, Departamentos de Oncologia Cirúrgica e Patologia, Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA. 5 Bharati Bapat, Cientista, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, e Professor, Departamento de Medicina Laboratorial e Patobiologia, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada. 6 Genes humanos: MGMT, O-6-metilguanina- DNA metiltransferase; GSTP1, glutationa S- transferase pi 1; APC, coli polipose adenomatosa; SEPT9, septina 9; MLH1, mutl homólogo 1, câncer de cólon, não polipose do tipo 2 (E. coli); BRCA1, câncer de mama 1, início precoce. Contribuições dos Autores: Todos os autores confirmaram que eles contribuíram para o conteúdo intelectual desse paper e satisfizeram os 3 seguintes requisitos: (a) contribuições significantes para a concepção e design, aquisição de dados, ou análise e interpretação dos dados; (b) rascunhando ou revisando o artigo para conteúdo intelectual ; e (c) aprovação final do artigo publicado. Revelações dos Autores de Potenciais Conflitos de Interesse: Na submissão do manuscrito, todos os autores completaram o formulário de Revelações de Potenciais Conflitos de Interesse. Potenciais conflitos de interesse: Emprego ou Liderança: Nada a declarar. Consultor ou Papel Consultivo: D. Sidransky, Oncomethylome Sciences; P.W. Laird, Epigenomics; P. Cairns, Oncomethylome Sciences.

6 Posse dos Valores: D. Sidransky, Oncomethylome Sciences; P. Cairns, Oncomethylome Sciences. Honorários: P.W. Laird, Epigenomics. Fundo de Pesquisas: D. Sidransky, Oncomethylome Sciences. Testemunho Hábil: Nada a declarar. Papel do Patrocinador: As organizações patrocinadoras não desempenharam papel algum no design do estudo, escolha dos pacientes inscritos, revisão e interpretação dos dados, ou preparação ou aprovação do manuscrito. 1, Chefe da Bioquímica Clínica, Departamento de Bioquímica Clínica, Mount Sinai Hospital and University Health Network, e Professor e Chefe, Divisão de Bioquímica Clínica, Departamento de Medicina Laboratorial & Patobiologia, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada. This article has been translated with the permission of AACC. AACC is not responsible for the accuracy of the translation. The views presented are those of the authors and not necessarily those of the AACC or the Journal. Reprinted from Clin Chem, 2010; 56 no , by permission of AACC. Original copyright 2010 American Association for Clinical Chemistry, Inc. When citing this article, please refer to the original English publication source in the journal, Clinical Chemistry. Este artigo foi traduzido com a permissão da AACC. AACC não é responsável pela acurácia da tradução. Os pontos de vista apresentados são aqueles dos autores e não necessariamente os da AACC ou do Jornal. Reimpresso da ClinChem, 2010; 56 no , por permissão da AACC. Cópia original 2010 American Association for Clinical Chemistry, Inc. Quando citar este artigo, por favor refira-se à fonte de publicação original em inglês na revista,clinical Chemistry.