Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células

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1 Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células Porto, 17 de Julho de 2008

2 Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células Disciplina: Trabalhos Práticos Curso: Mestrado em Engenharia Biomédica da Universidade do Porto Aluna: Adriana Alexandre dos Santos Tavares Orientador: João Manuel R. S. Tavares Professor Auxiliar do Departamento de Engenharia Mecânica e Gestão Industrial da FEUP Co-Orientador: Luís F. Metello Professor Adjunto do Curso de Medicina Nuclear da ESTSP Trabalhos Práticos 2

3 Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células Conteúdos da Apresentação: Culturas de Células; Ciclo Celular; Possíveis Destinos Finais das Células Irradiadas; Apoptose ou Morte Celular Programada Principais Vias para Início; Apoptose e Necrose; Radiofármaco; Radiofármaco Ideal para Terapêutica com Electrões de Auger; Citometria de Fluxo; Procedimento de Irradiação; Estudos de Influxo e Efluxo; Análise da Apoptose Radioinduzida; Conclusões Finais; Perspectivas Futuras. Trabalhos Práticos 3

4 Cultura de Células Cultura células o que são? Tipo de cultura de tecidos que envolve um conjunto de técnicas que permitem cultivar e/ou manter células isoladas fora do organismo de origem. Remover células de fragmentos de órgãos antes ou durante a cultura, com concomitante separação das células vizinhas. Trabalhos Práticos 4

5 Tipos de Cultura de Células Culturas Primárias Obtidas por recolha cirúrgica de pequenas peças de tecido; Culturas inicialmente heterogéneas, com o tempo tornam-se dominadas por fibroblastos; Tempo de sobrevivência in vitro reduzido; Propícia a desenvolvimento de contaminações. Linhas Celulares Crescimento rápido e contínuo; Proliferação limitada (cerca de 30 divisões celulares) ou ilimitada (ex: células tumorais); Mais homogéneas, estáveis e reprodutíveis que culturas primárias; Ampla disponibilidade. Trabalhos Práticos 5

6 Ciclo Celular Definição: conjunto de transformações dinâmicas e contínuas que decorrem desde a formação da célula até ao momento em que ela própria, por divisão, origina duas células-filhas carácter cíclico, com períodos de crescimento e de divisão. Trabalhos Práticos 6

7 Ciclo Celular Células de mamíferos em cultura Fase G1 1 a 8 horas; Fase S 6 a 8 horas; Fase G2 2 a 4 horas; Fase M < 1 hora. Mitose A célula divide-se Início ciclo celular A célula aumenta de tamanho, biossíntese Total 10 a 20 horas A célula preparase para se dividir Célula retida A célula replica o seu ADN A célula decide se prossegue ou não no ciclo celular Trabalhos Práticos 7

8 Possíveis Destinos Finais de Células Irradiadas Ausência de efeito; Atraso na divisão; Apoptose; Falha reprodutiva; Instabilidade genómica; Mutação; Transformação; Efeito bystander; Respostas adaptativas. Trabalhos Práticos 8

9 Apoptose ou Morte Celular Programada Principais Vias para Início Apoptose Iniciada via receptores de morte Iniciada por estímulos agentes externos (ex: radiação) Trabalhos Práticos 9

10 Apoptose e Necrose Normal Edema reversível Edema Irreversível Desintegração Normal Condensação Fragmentação Corpos Apoptóticos Trabalhos Práticos 10

11 Radiofármaco Dois componentes: Radionuclídeo emissões energéticas corresponder aos objectivos esperados e ao detector de radiação utilizado. Fármaco seleccionado, com base na sua localização preferencial num dado tecido ou órgão ou na participação fisiológica que terá sobre determinadas células ou receptores. Trabalhos Práticos 11

12 Citometria de Fluxo Técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas num meio líquido em fluxo. Através de um aparelho de detecção óptico-eletrónico é possível analisar características físicas e/ou químicas de uma simples célula. Comparação da Citometria Fluxo e Microscopia Clássica Microscopia Clássica Detecção visual Centenas de células analisadas Análise qualitativa Células imobilizadas na lâmina e contadas manualmente Citometria de Fluxo Detecção electrónica Milhares e milhões de células analisadas Análise quantitativa Células em suspensão, passam individualmente em frente ao laser do citómetro de fluxo Trabalhos Práticos 12

13 Procedimento de Irradiação Culturas de fibroblastos expostas a actividades de 740, 1480, 2220, 2960 e 3700 MBq/ml (20, 40, 60, 80 e 100 mci/ml) de 99m Tc; Concluídooprocessodeirradiação determinar quais as doses ideais de irradiação; Irradiar apenas com as doses ideais e para diferentes doses absorvidas, que se prevê situarem entre 1 e 2 Gy,utilizando-se intervalos cada 0.5 Gy. Trabalhos Práticos 13

14 Estudos de Influxo e Efluxo Estudo de influxo Estudo de efluxo Quantidade de 99m Tc-Pertecnetato de Sódio que penetrou a membrana celular. Quantidade de 99m Tc- Pertecnetato de Sódio que entrou na célula, mas foi de seguida expulso para o seu exterior. Centrifugação amostras cultura de células. Compreender a capacidade de difusão do radiofármaco pela membrana celular e sua consequente captação por parte da célula. Trabalhos Práticos 14

15 Análise da Apoptose Radioinduzida Citometria de fluxo com recurso à técnica da dupla marcação com anexina V e iodeto de propídio. Reagente Diagnóstico Celular Anexina V Iodeto de Propídio Células Viáveis Início de Apoptose Final Apoptose e Necrose Trabalhos Práticos 15

16 Conclusões Finais Linhas celulares grande disponibilidade e elevada capacidade de reprodutibilidade. Radiação apoptose, pela indução de danos ao ADN irreparáveis. Crescente interesse da comunidade científica relativamente aos radionuclídeos emissores de electrões de Auger, dos quais o 99m Tc faz parte. Pertinência e relevância da presente Dissertação Trabalhos Práticos 16

17 Perspectivas Futuras 1. Contribuição para a criação de um texto de revisão actualizado e completo sobre o tema da Dissertação; 2. Melhorar o conhecimento actual do papel do 99m Tc enquanto agente irradiante no contexto terapêutico, pela análise dos efeitos radiobiológicos em culturas de células seleccionadas; 3. Utilização de técnicas de citometria de fluxo para avaliação dos efeitos da radiação na célula, nomeadamente, a indução da apoptose; 4. Estudo de efluxo e influxo do 99m Tc-Pertecnetato de Sódio em culturas de células, de forma a relacionar o seu papel enquanto agente terapêutico com a sua dinâmica celular. Trabalhos Práticos 17

18 Referências Anazetti, M. C. (2007). "Morte Celular por Apoptose: uma visão bioquímica e molecular." Metrocamp Pesquisa 1(1): Baatout (2004). "Cytometric methods to analyze radiation effects." Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents 18(2): BD, B. (2007). "Annexin V - Introduction." Annexin V Retrieved 26 June 2008, from Besta, I. N. N. C. (2004). Detection of Contaminants in Human Cell Culture. L. P. f. H. C. Culture. Marina Mora, EuroBio Bank. Caprioglio, D. (2008). "Fluorescence in Biology." Retrieved 26 June 2008, from Coder, D. (1997). Assessment of cell viability. Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons. Coimbra, U. (2008). "Noções básicas de cultura de células." Retrieved Maio 2008, from Dash, P. (2008). "Apoptosis." Reproductive and Cardiovascular Research Group Retrieved Maio 2008, from Freshney, I. (2006). Basic Principles of Cell Culture. Culture of Cells for Tissue Engineering. G. V.-N. e. I. Freshney, Jon Wiley and Sons. Hanon E., V. A., Pastoret P. (1996). "The Use of Flow Cytometry for Concomitant Detection of Apoptosis and Cell Cycle Analysis." Biochemica 2(Technical Tips): Hartung, T. (2002). "Good Cell Culture Practice." ATLA 30: Howell, R. (1992). "Radiation Spectra for Auger-Electron Emitting Radionuclides: Report No.2 of AAPM Nuclear Medicine Task Group No.6." Medical Physics 19(6): Humm, J. (1989). "A New Calculational Method to Assess the Therapeutic Potential of Auger Electron Emission." International Journal of Radiation Oncology Biology Physics 17(2): Humm, J. (1994). "Dosimetry of Auger-Electron-Emitting Radionuclides." Medical Physics 21(12): Marques, F. (2001). "Alguns Aspectos Sobre Geradores e Radiofármacos de Tecnécio-99m e seus Controles de Qualidade." Radiologia Brasileira 34(4): Mather, J. (1998). Introduction to Cell and Tissue Culture. New York and London, Plenum Press. Nolla, H. (2008). Basic Principles in Flow Cytometry. U. o. California. Berkeley. Riley, R. (2005). "Principles and Applications of Flow Cytometry." Retrieved 26 June 2008, from Ryan, J. (2008). Introduction to Aninmal Cell Culture. Technical Bulletin. Saha, G. (1998). Radiopharmaceuticals and Methods of Radiolabeling. Fundamentals of Nuclear Pharmacy. Springer. SIGMA (2008). Fundamental Techniques in Cell Culture... A Laboratory Handbook, SIGMA Laborartories. Silva, A. (2000). Terra, Universo de Vida. Porto, Porto Editora. Silva, T. R., Alberto; Hewitt, Christopher; Roseiro, Jose (2004). "Citometria de fluxo - Funcionalidade celular on-line em bioprocessos." Boletim de Biotecnologia 77(Métodos em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II): Suntharalingam, N. (2002). "Basic Radiobiology." Chapter 14 Retrieved 30 May 2008, from Unak, P. (2002). "Targeted Tumor Radiotherapy." Brazilian Archives of Biology and Technology 45: Wikipedia. (2008). "Centríolos." Retrieved 30 Maio 2008, from Trabalhos Práticos 18

19 Obrigada pela vossa atenção! FIM