INTRODUÇÃO FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 2
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- Francisca Estrada Macedo
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1 INTRODUÇÃO Este trabalho foi realizado nas aulas de Farmacologia I, em que se fez experiências para estudar o comportamento do canal deferente do ratinho, relativamente a agonistas e antagonistas de transmissão colinérgica periférica. Usou-se os fármacos: Acetilcolina e Carbacol agonistas totais de acção directa Fisostigmina ( ou eserina ) colinomimético de acção indirecta Atropina antagonista. O objectivo foi de estudarmos as curvas dose-resposta, de modo a podermos comparar o efeito da Fisostigmina (ou eserina) sobre as curvas à acetilcolina e ao carbacol. Para caracterizar um determinado fármaco, é necessário: medir a sua afinidade (capacidade do fármaco se ligar ao receptor); a sua actividade intrínseca (capacidade de, uma vez ligado ao receptor, desencadear uma resposta) que é dada pela amplitude da curva dose-efeito; a potência é dada pela posição da curva no eixo das abcissas, para calcular a potência é usual determinar o EC5, concentração do fármaco necessária para causar 5% da resposta máxima. Para comparar a potência dos agonistas é mais prático achar o logaritmo negativo da dose que produz 5% do efeito máximo ( - log [ EC5 ] ) que se denomina por pd2. Para caracterizarmos a capacidade bloqueadora dos antagonistas competitivos é necessário calcular o pa2. Segundo Schild, o pax é o logaritmo, na base de 1, da concentração molar de um antagonista que reduz o efeito de uma dose múltipla de um agonista ao efeito de uma dose unitária. De acordo com esta definição, o pa2 será o logaritmo negativo da concentração molar de um antagonista necessária para reduzir o efeito produzido por um dose dupla ( 2x ) de um agonista ao efeito produzido por uma dose unitária. Um antagonista competitivo compete com o fármaco para o mesmo local, podendo ser deslocado pelo antagonista, se a ligação não for irreversível, enquanto que o antagonista não competitivo compete para um local diferente do agonista, sendo impossível deslocar por aumento da concentração. É possível distinguir o tipo de antagonismo através do declive da Regressão de Schild, se for igual a um o antagonista é competitivo, à desvios proporcionais à concentração, se o declive da recta for diferente de um o antagonista pode ser competitivo ou não. FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 2
2 Os receptores colinérgicos são classificados farmacologicamente em nicotínicos e muscarínicos, mas só os segundos é que são do interesse para o nosso estudo. Os receptores muscarínicos são classificados em quatro subtipos, designados por M1, M2, M3, M4, tendo sido postulado com base em clonagem molecular um subtipo M5, com semelhanças ao M1. M1 e M4 predominam nos tecidos neuronais ( M1 nos gânglios vegetativos autónomos, córtex cerebral e hipocampo; M4 no estriado ) e em glândulas; M2 e M3 predominam nas áreas cerebrais inferiores e nos órgãos efectores periféricos, como o coração ( M2 ), músculo liso ( do intestino, dos vasos, da íris, das vias urinárias, etc. ) e glândulas ( M3 ). A caracterização farmacológica dos diferentes subtipos tem sido efectuada sobretudo pela utilização de antagonistas específicos, uma vez que não são ainda conhecidos agonistas dotados de uma selectividade elevada para cada subtipo. É sobretudo sobre os receptores muscarínicos do subtipo M3 é que se debruça o nosso estudo. Os efeitos da acetilcolina como mediador químico das terminações nervosas pós ganglionares parassimpáticas são assim todos mediados por receptores do tipo muscarínico. Os efeitos evocados nos vários órgãos são diferentes. De um modo geral, observa-se uma estimulação das células, traduzida, por exemplo, por uma contracção de quase todos os tipos de músculo liso (intestino, brônquios, vias urinárias, músculo circular da íris ) e por um aumento de secreção das glândulas exócrinas ( salivares, gástricas, entérias, sudoríparas, lacrimais, brônquicas, etc. ). O carbacol, como colinomimético, é capaz de provocar efeitos análogos aos dos compostos do parassimpático, pode actuar a nível pré-sinaptico, aumentando a libertação da acetilcolina, ou activar directamente os receptores muscarínicos, levando à contracção da musculatura lisa em questão (contracção do canal deferente do ratinho). A Fisostigmina (ou eserina) é um colinomimético de acção indirecta, isto é, um inibidor das colinesterases (enzimas que degradam a acetilcolina na fenda sináptica) bloqueando-as, permitindo, deste modo, a acumulação da acetilcolina em maior quantidade e durante mais tempo junto dos receptores, causando uma potenciação dos seus efeitos. A Atropina é capaz de bloquear os receptores muscarínicos da acetilcolina, diminuindo a capacidade funcional da célula efectora. Por exemplo, ao nível da FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 3
3 musculatura lisa das vias brônquicas, biliares, intestinais e urinárias verifica-se um relaxamento. Este estudo só pode ser feito graças ao estudo da acção dos fármacos em sistemas biológicos muito simples, como células ou tecidos isolados (canal deferente do ratinho) mantendo-os em condições fisiológicas normais, não sendo portanto necessário utilizar um animal inteiro, o que representa uma vantagem. Materiais e métodos Órgão utilizado: canal deferente de rato; íleo de rato - Líquido nutritivo : Solução de Krebs. Sistema de registo das contracções : transdutor isométrico + polígrafo. Carga : 1g. Oxigenação: Carbogenio ( CO 2 + O 2 ). Temperatura : 37º C. Volume dos Banhos /alíquotas: 2ml / 1 µl ;. Protocolo: o Quando se usou os agonistas : carbacol e acetilcolina (curva dose resposta única) 1. Lavar o órgão com solução de Krebs; 2. Adicionar a alíquota do fármaco em estudo ; 3. Registar as contracções ; 4. Lavar o órgão. Este procedimento foi repetido para todas as concentrações dos fármacos testados. FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 4
4 5. Repetir o procedimento anterior do agonista utilizando eserina (1 µm) 6. Lavar o órgão ; o Quando se usou o antagonista (curvas cumulativas) 1. Adicionar concentrações crescentes de agonista 2. Registar as contracções 3. Lavar o órgão 1. Adicionar alíquota do antagonista utilizado (atropina) 2. Esperar 1 minutos ; 3. Adicionar concentrações crescentes do agonista; 4. Registar a contracção ; 5. Lavar o órgão ; Repetiu-se este procedimento para diferentes concentrações de antagonista (atropina) o Soluções : Cloreto de acetilcolina: C 7 H 16 ClNO 2. PM=181,7 12 diluições de 1: 3 a partir de uma solução 2, mg/ml; Sulfato de atropina: (C1 7 H 23 NO 3 ) 2.H2SO4.PM=676,8 Soluções de 3x1-8, 1x1-7, 3x1-7 ; Cloreto de carbacol: C 6 H 15 ClN 2 O 2. PM=182,6 12 diluições de 1 : 3 a partir de uma solução 4 mg/ ml; Salicilato de eserina: C1 5 H 21 N 3 O 2.C 7 H 6 O 3.PM= 413,5 Solução 1 µm. FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 5
5 Resultados: Colinomiméticos de acção directa No canal deferente Carbacol Acetilcolina 3,7 3,5 log nm cm mn % Log nm cm mn % 1, , 1, , 2, ,3, ,999 2, , 3, ,5 3, , , ,4 1,12 17,3913 4, ,8 7, , , , 2,8 43, , ,3 8, , ,5 4,2 65, , ,9 7, , , ,3 6,44 1 5, ,9 5,32 82,687 Curva dose resposta de agonistas no canal deferente % de contracção máxima individual Log [agonista] Cch Ach Gráfico 1 EC 5 (Cch) = 7,9432 x 1-6 M pd 2 (Cch) = - log (7,9432 x 1-6 ) = 5,1 EC 5 (Ach) = 2,3988 x 1-5 M pd 2 (Ach) = - log (2,3988 x 1-5 ) = 4,62 Agonistas no intestino Carbacol Acetilcolina 2, 2, log nm cm mn % log NM Cm mn % 1 1,2,49 3, ,1,392 1, ,48 3,5 1,225 5, ,48 3,5 1,96 5, ,4 3,43 16, ,4 5,488 16, ,48 3 7, 17,15 8, ,48 3 3, 11,76 35, ,4 2,58 96, ,7 22,344 67, ,48 3 8,7 21, ,48 3 6,7 26,264 79, ,5 29,4 89, ,48 3 7,7 3,184 91, ,1 31,752 96, ,48 3 8,4 32, E+6 8,2 32,144 97,6195 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 6
6 Curva dose resposta de agonistas no intestino % de resposta máxima individual log [agonista] Cch Ach Gráfico 2 EC 5 (Cch) = 1,6218 x 1-7 M pd 2 (Cch) = - log (1,6218 x 1-7 ) = 6,79 EC 5 (Ach) = 6,166 x 1-7 M pd 2 (Ach) = - log (6,166 x 1-7 ) = 6,21 Colinomiméticos de acção indirecta Carbacol + eserina 1 µm Acetilcolina + eserina 1 µm 3,7 3,5 log nm cm mn % Log nm cm mn % 1, , 1, ,5 1,4 1, , ,7 1, , ,4 6,72 5 3, ,7 4, , , ,8 13,4 1 4, ,3 5, , , , 11,2 83, , ,5 9, , ,3 9,24 68,75 5, , 7, ,71429 Efeito da eserina na resposta do carbacol % de resposta máxima individual Cch Cch + Es log [Cch]] Gráfico 3 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 7
7 EC 5 (Cch+Es) = 7,9432 x 1-6 M pd 2 (Cch+Es) = - log (7,9432 x 1-6 ) = 5,1 Efeito da eserina na resposta à acetilcolina % de resposta máxima individual Ach Ach + Es log [Ach] Gráfico 4 EC 5 (Ach+Es) = 7,244 x 1-7 M pd 2 (Ach+Es) = - log (7,244 x 1-7 ) = 6,14 Contracção provocada pela eserina no intestino: cm % Acetilcolina 4 1 Eserina 1 µμ 3,3 82,5 Contracção provocada pela eserina no intestino % de resposta em relação à Ach Acetilcolina 82,5 Eserina 1 mm Gráfico 5 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 8
8 Estudo de antagonistas Carbacol Cch+atrop 3E-8M Cch+atrop 1E-7M Cch+atrop 3E-7M 4, 4, 4, 4, log nm Cm mn % cm mn % cm mn % cm MN % 1 1,5 1,225 8,333,,, 1,4771 3,7 1,715 11,67,,, 2 1 1,8 4,41 3,,, 2, ,5 8,575 58,33,3,74 4,839,1,25 1,79, 3 1 5,5 13,48 91,67 1,5 3,68 24,19,5 1,23 8,93, 3, , 14,7 1 3,3 8,9 53,23 1,9 4,66 33,9,1,25 1, , 14,7 96,77 4,5 11 8,4,3,74 4,762 4, ,2 15,2 1 5,5 13,5 98,2 2,2 5,39 34, ,6 13,7 1 5,4 13,2 85,71 5, ,3 15,4 1 Carbacol + atropina 1 % resposta Cch+atrop[3E-8] Cch+atrop[1E-7] Cch+atrop[3E-7] Cch log [agonista] Gráfico 6 [antag.] Log [] EC 5 DR log (DR-1) Carbacol 2,51E-7 Cch+Atrop 3,E-8-7,52 2,51E-6 1, 1, Cch+Atrop 1,E-7-7, 5,1E-6 19,95 1,3 Cch+Atrop 3,E-7-6,52 4,7E-5 162,18 2,21 y = 1,1986x + 9,9121 R 2 =,974 log (DR-1) Plot de Schild (atropina) 2,5 2 1,5 1,5-9, -7, -5, -3, -1, -,5 1, log [antagonista] pa 2 = -(intersecção da recta com o eixo das abcissas) pa 2 = 8,27 Gráfico 7 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 9
9 Acetilcolina Ach+atrop 3E--8M Ach+atrop 1E-7M Ach+atrop 3E-7M 2,5 2,5 2,5 2,5 Log nm cm mn % cm mn % cm mn % cm MN % 1 1,3 1,176 7,317,,, 1, ,8 3,136 19,51,,, 2 1 2,3 9,16 56,9,1,39 2,1277,, 2, ,1 12,15 75,6,3 1,18 6,383,, 3 1 3,8 14,89 92,68 1,2 4,7 25,532,4 1,568 8,51,1,39 2,8 3, ,1 16,7 1 2,2 8,62 46,89 1, 3,92 21,3,3 1,18 6, ,8 14,89 92,68 4,2 16,5 89,362 2,9 11,36 61,7 1,2 4,7 25 4, ,7 18,4 1 4,2 16,46 89,4 2,7 1,6 56, ,3 16,9 91,489 4,7 18,42 1 4,3 16,9 89,6 5, ,5 17,64 95,7 4,8 18, , ,8 Acetilcolina+atropina 1 % resposta Ach+atrp[3x1^-8] Ach+atp[1^-7] Ach+atp[3x1-7^] Ach log [agonista] Gráfico 8 [antag.] Log [] EC 5 DR log (DR-1) Acetilcolina 7,94E-8 Ach+Atrop 3,E-8-7,52 2,45E-6 3,9 1,49 Ach+Atrop 1,E-7-7, 6,31E-6 79,44 1,9 Ach+Atrop 3,E-7-6,52 2,51E-5 316,25 2,5 Plot de Schild (atropina) y = 1,78x + 9,826 R 2 =, ,5 log (DR-1) 2 1,5 1,5-9,5-7,5-5,5-3,5-1,5,5 log [antagonista] pa 2 = 8,96 Gráfico 9 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 1
10 Discussão dos resultados / Conclusões Podemos concluir a partir da experiência realizada e dos cálculos efectuados que o carbacol é mais potente que a acetilcolina, pois o pd 2 (carbacol) = 5,1 é superior ao pd 2 (acetilcolina )= 4,6 e quanto maior o pd 2 mais potente é o fármaco. Aliás uma menor concentração de carbacol (EC 5 =7,9x 1 M ) em relação à acetilcolina ( EC 5 = 2,4x1M ) foi capaz, como demonstrado nos resultados de desencadear 5% da resposta máxima. Segundo a bibliografia ambos os fármacos são agonistas totais com capacidade de atingir uma resposta de 1%, logo têm actividade intrínseca semelhante. Não podemos é comparar a sua actividade neste caso, por não termos utilizado a mesma fracção de canal deferente na experimentação de ambos os fármacos. As curvas dos respectivos agonistas têm uma inclinação semelhante, o que nos permite concluir que provavelmente actuam no mesmo tipo de receptores. Outro fármaco testado, a eserina, como colinomimética de acção indirecta potência a acção da acetilcolina havendo um deslocamento da curva para a esquerda (ver gráfico 4). Na resposta ao carbacol a eserina não teve qualquer efeito (ver gráfico 3), este agonista é resistente à degradação pelas colineterases, daí não ser potenciada a sua acção pela eserina. O pd 2 (acetilcolina + eserina) = 6,14 é superior ao pd 2 ( carbacol + eserina )= 5,1, pelo que a potência da acetilcolina é superior à do carbacol quando as colinesterases estão inibidas. No intestino quando aplicada isoladamente a eserina verificou-se, ao contrário do que seria de esperar, uma resposta contráctil de cerca de 82,5%. A situação é devida à inibição exercida pela eserina sobre as colinesterases impedindo deste modo a degradação da acetilcolina e aumentando a sua concentração na fenda sináptica. A acetilcolina actua então sobre os receptores provocando a contracção observada (ver gráfico 5). Tudo isto vem demonstrar a presença deste agonista endógeno e das colinesterases no intestino que degradam a acetilcolina impedindo a contracção do músculo. Ao compararmos a acetilcolina e o carbacol no canal deferente e no intestino, verificamos que o pd 2 aumenta no intestino, isto é, a potência do agonista aumenta. Este facto deve-se provavelmente ao elevado tónus parassinpático existente no intestino relativamente ao canal deferente, havendo sempre uma determinada quantidade de FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 11
11 acetilcolina libertada. Quando se adiciona uma determinada concentração de agonista, já se encontra presente na fenda sináptica uma elevada quantidade de agonista endógeno, deste modo a concentração efectiva de agonista na fenda sináptica é superior, registando-se contracções com concentrações mais baixas do agonista. A atropina bloqueia preferencialmente os receptores muscarínicos, como na presença de uma concentração crescente de atropina (antagonista), concentrações progressivamente maiores de agonista causam resposta progressivamente maiores, apesar de estas respostas serem significativamente menos intensas que as verificadas na ausência do antagonista. Assim na presença de atropina a curva dose/resposta sofre um deslocamento para a direita, mantendo-se paralela, em relação à curva dose/resposta quando o único fármaco presente é o agonista, podemos concluir que o carbacol e acetilcolina actuam nos receptores muscarínicos do intestino. A presença de antagonista aumenta a concentração de agonista necessária para um certo grau de resposta. Como os valores de declive obtido, quando traçada a regressão de Schild, ambos próximos de 1, podemos concluir que o antagonista testado (atropina) é competitivo. Os valores de pa 2 obtidos para a atropina com o carbacol e a acetilcolina são aproximados, pois esse valor é característico de um antagonista, devendo-se manter constante apesar de utilizarmos agonistas diferentes. FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 12
12 BIBLIOGRAFIA S.P.H. Alexander; J.ª Peters, Pharmacological Sciences 21 Receptor & Ion Channel Nomenclature Suplement, Twelfth Edition, London ( pag 6 ) H.P. Rang; J.M. Ritter;M.M. Dale, Farmacologia, 3ª edição, Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, ( Capítulo 6 ) Walter Osswald; Serafim Guimarães, Terapêutica Medicamentosa e suas Bases Farmacológicas, 4ª edição, Porto Editora, Porto, Jun/21. ( Capítulo 22). AGRADECIMENTOS Agradecemos ao Dr. Jorge Oliveira, pelo tempo e atenção dispensados. Queríamos também agradecer aos colegas das outras turmas laboratoriais por nos terem cedido os seus registos, sem os quais não poderíamos ter efectuado o nosso trabalho. FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 13
13 ANEXOS FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 14
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