Teste do tumor para identificar mutações somáticas
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- Jorge Sanches Fialho
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1 Teste do tumor para identificar mutações somáticas Data de preparo: Fevereiro de 2015; Data de validade : Fevereiro ,
2 Conteúdo Teste do tumor: Uma introdução Mutações BRCA somáticas no câncer de ovário Teste de mutação BRCA no tumor na prática Teste do tumor: O futuro Resumo
3 Teste do Tumor: Uma introdução
4 Teste do Tumor: Uma introdução Introdução ao teste do tumor para identificar mutações somáticas no câncer de ovário Mutações em diversos genes vêm sendo relacionadas com câncer de ovário Mutações podem ser herdadas (germinativas) ou podem ocorrer de novo no tecido ovariano (somáticas) A compreensão de como a base molecular do câncer de ovário, mutações germinativas e somáticas, pode auxiliar nas decisões de tratamento Romero I, Bast RC. Endocrinology 2012;153:
5 Teste do Tumor: Uma introdução Mutações Germinativas Uma mutação germinativa pode ser passada adiante para a próxima geração 1 Em oncologia, mutações germinativas contribuem para a probabilidade de desenvolvimento de determinados tipos de câncer e desempenham um papel significante na resposta à quimioterapia 2 Mutação germinativa presente em todas as células Mutação no óvulo ou espermatozoide Todas as células afetadas nos filhos 1. National Cancer Institute. ww.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer/cancergenomics. 2. Filipski KK, et al. Front Genet 2014;5:73.
6 Teste do Tumor: Uma introdução Mutações Somáticas Uma mutação somática não pode ser herdada, e não ocorre em células reprodutivas 1,2 Apesar de um indivíduo com uma mutação germinativa também poder desenvolver uma mutação somática Mutações somáticas fornecem indicações sobre a biologia subjacente do câncer Descobertas sobre mutações somáticas elucidam as alterações genéticas primárias impulsionando a tumorogênese e fornecem novos alvos moleculares para medicamentos Não herdadas Análise de DNA do tumor está crescentemente sendo utilizada, permitindo tratamento com direcionamento molecular 2 Novos medicamentos estão sendo desenvolvidos para alvos moleculares definidos, por exemplo, crizotinibe em câncer de pulmão de não pequena célula positivo para quinase de linfoma anaplásico Mutação somática (ex. mama) 1. National Cancer Institute. ww.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer/cancergenomics. 2. Filipski KK, et al. Front Genet 2014;5:73.
7 Mutações BRCA somáticas no câncer de ovário
8 Mutações BRCA somáticas no câncer de ovário Introdução ao BRCA BRCA1 e BRCA2 são genes supressores de tumor 1,2 Proteínas BRCA funcionais regulam o crescimento celular e previnem a divisão celular anormal que poderia levar ao desenvolvimento do tumor Proteína BRCA1 Proteínas BRCA são expressas em muitos tecidos diferentes e atingem o nível mais alto de expressão durante a fase S, indicativo do seu papel no reparo DSB do DNA Tumourigênese em portadoras de mutação BRCA1 / 2 germinativa (herdada) segue uma hipótese de dois acertos 3 Primeiro acerto sendo devido a uma mutação herdada de um alelo BRCA Segundo acerto devido à inativação do segundo alelo tipo selvagem Proteína BRCA2 Tipos principais de mutações Mutação em ponto: Pares de base de DNA substituídos alteram a estrutura /função da proteína ou expressão gênica 4 Mutações de desvio de estrutura ou inserção / deleção que alteram a estrutura de leitura 4 Grandes rearranjos: Seções de DNA que são transferidas para uma nova posição no genoma, completamente deletadas ou novas seções são inseridas, todas as quais podem alterar a expressão e afetar a função das proteínas resultantes 5 Todos estes tipos de mutações são encontrados em BRCA1 / 2 6 DSB, ruptura de dupla fita. 1. Gudmundsdottir K, et al. Oncogene 2006;25: ; 2. Venkitaraman AR. J Cell Sci 2001;114:3591 8; 3. Esteller M, et al. Hum Mol Genet 2001;10:3001 7; 4. Clancy S. Nature Education 2008;1:187; 5. Edw ards PA. J Pathol 2010;220:244 54; 6. Larsson N, et al. EMQN Guidelines 2007; MRC-Holland b.v.
9 Mutações BRCA somáticas no câncer de ovário Mutações somáticas são responsáveis por uma porção significante de aberrações gerais em BRCA1 / 2 Em uma análise de 28 cânceres de ovário com mutações BRCA1 / 2, ~40% foram consideradas como sendo mutações somáticas Teste de tumor Uma mutação BRCA foi determinada como sendo somática se nenhuma mutação BRCA1 / 2 pudesse ser encontrada no DNA germinativo Ambas as mutações, germinativas e somáticas, podem ser encontradas no tumor Tumor BRCA1 / 2 inclui mutações germinativas e somáticas (n=17) Somente BRCA1 somática (n=9) N=28 Somente BRCA2 somática (n=2) Hennessy BT, et al. J Clin Oncol 2010;28:
10 Mutações BRCA somáticas no câncer de ovário Mutações BRCA1 / 2 somáticas e germinativas conferem impacto positivo similar na sobrevida geral e resposta à platina Presença de mutações BRCA1 e BRCA2 no tecido de câncer de ovário foram associadas com PFS significantemente melhorada após quimioterapia a base de platina em comparação com câncer tipo selvagem para BRCA1 / BRCA2 em uma análise univariada (p=0,032; HR=0,65; IC 95%: 0,44 0,98) A comparação de pacientes que foram positivos para uma mutação BRCA somática versus germinativa não demonstrou diferença na PFS (p=0,69) Perda de função BRCA devido a aberrações somáticas frequentes em câncer de ovário provavelmente desregula recombinação homóloga e assim aumenta a sensibilidade a medicamentos de platina Consistente com estudos prévios de mutações BRCA1 / 2 germinativas PFS, sobrevida livre de progressão. Hennessy BT, et al. J Clin Oncol 2010;28:
11 Teste de mutação BRCA do tumor na prática
12 Teste de mutação BRCA no tumor na prática Teste de mutação somática e germinativa: Amostragem Se uma paciente for referida para teste de tumor e uma mutação (ou mutações) for identificada, uma amostra de sangue precisa ser avaliada para determinar se a paciente apresenta uma mutação germinativa herdada Tumor (germinativa e somática) FFPE Congelamento rápido Germinativa Amostra de sangue Swab (amostra) da boca FFPE, embebido em parafina e fixado em formalina. Comunicação pessoal da Dr Emma How e, Genomic Diagnostics Laboratory, St Mary s Hospital, Manchester, UK.
13 Teste de mutação BRCA no tumor na prática Desafios para o teste de tumor Teste de tumor de rotina atualmente enfrenta desafios no preparo da amostra e padronização das metodologias de teste: A rigor, a sensibilidade deve ser limite de detecção de mutação 1 Amostras do tumor têm células normais presentes Amostras FFPE tendem à degradação 2 Se usar um método a base de PCR, amplicons curtos (<160) devem ser usados, pois pouca amplificação ocorrerá se o DNA for degradado 1 Quantidade limitada de DNA extraído de amostra FFPE 2 PCR, reação em cadeia de polimerase. 1. Comunicação pessoal de Dr Emma How e Genomic Diagnostics Laboratory, St Mary s Hospital, Manchester, UK. 2. Bourgon R, et al. Clin Cancer Res 2014;20:
14 Teste de mutação BRCA no tumor na prática Análise de rotina de FFPE de tumores de mama e ovário é viável com NGS Amostras FFPE de ovário (n=68) e mama (n=30) (seções de 40micron) Método NGS usado que foi sensível o suficiente para detectar níveis baixos de mutações, multiplicadas para reduzir a quantidade de DNA necessário e apresenta um desenho de amplicon curto Variantes BRCA1 / 2 significantes foram identificadas Confirmado pela repetição de NGS e validado por sequenciamento de Sanger 87/98 das amostras (89%) (não incluindo replicatas) tiveram uma cobertura de >90% com uma profundidade mínima de 100x Profundidade média da cobertura foi >5000x para amostras com o uso recomendado de DNA Maioria das amostras fornece uma profundidade média de cobertura de >1000x para as regiões cobertas por este ensaio Importante para análise tumoral, assim variantes de nível baixo podem ser identificadas com confiança Mutações BRCA foram detectadas se presentes em >10% da amostra de DNA Possibilitou a detecção de mutações de nível baixo comumente encontradas no material tumoral NGS, sequenciamento de próxima geração. Ellison G, et al. Curr Oncol 2014;21:e378.
15 Teste de mutação BRCA no tumor na prática Métodos de teste de mutação BRCA no tumor Poucos laboratórios de serviço BRCA oferecem teste clínico de rotina para triagem de BRCA tumoral 1 3 Métodos de teste de BRCA germinativo podem precisar ser desenvolvidos novamente para funcionar em DNA de baixa qualidade de tecido tumoral FFPE 4 DNA de amostras tumorais podem ser de qualidade inadequada e baixo rendimento 4 NGS é uma tecnologia adequada para análise de material tumoral 4 Kits BRCA comercialmente disponíveis desenvolvidos para uso em amostras tumorais Método BRCA Mastr Dx para material congelado de tumor (CE-KIT) 1 GeneRead DNAseq Targeted Exon Enrichment Breast Panel (RUO) 2 Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 Panel (RUO-IVD) 3 Detalhes Fornecedor: Multiplicom Método NGS apenas para tecido congelado Fornecedor: QIAGEN Método NGS para uso em material FFPE O Human Breast Cancer GeneRead DNAseq Targeted Panel é uma coleção de ensaios com primer PCR multiplicado para enriquecimento direcionado das regiões de codificação (exônica) dos 44 genes mais comumente mutados nas amostras de câncer de mama humano Fornecedor: Life Technologies Método NGS Bourgon R, et al. Clin Cancer Res 2014;20:
16 Teste de mutação BRCA no tumor na prática BRCA Mastr Dx Abordagem de amplificação múltipla que fornece cobertura éxon completa de todas as sequências codificadoras de BRCA1 e BRCA2 Usa amostras de tecido fresco congelado Compatível com a maioria das plataformas NGS Testes de validação de BRCAMASTR Dx e MID Dx para kits Illumina MiSeq no FFT indicou alta sensibilidade ( 99,3%), especificidade ( 99,988%) e exatidão ( 99,988%)
17 Teste de mutação BRCA no tumor na prática GeneRead O GeneRead DNAseq painéis direcionados possibilita enriquecimento das regiões codificadoras e junções de éxon/íntron frequentemente mutadas em uma determinada doença Usando uma abordagem de enriquecimento direcionado PCR múltiplo de alta dimensão, DNAseq painéis direcionados aumenta a eficiência dos esforços de sequenciamento ao focar nos genes mais relevantes para uma doença específica Estes painéis fornecem enriquecimento para possibilitar sequenciamento ultra-profundo e detecção de mutações de baixa frequência nas amostras FFPE Adequado para uso em DNA extraído de material FFPE
18 Teste de mutação BRCA no tumor na prática Ion AmpliSeq Baseada em PCR ultra-alto múltiplo, a tecnologia Ion AmpliSeq direciona a conjuntos de genes de amostras FFPE Necessita apenas de pequenas quantidades de input DNA (10 ng) Ion AmpliSeq os painéis de comunidade BRCA1 e BRCA2 são usados para construir bibliotecas para teste BRCA1 / 2 Desenvolvido em colaboração com especialistas em ciência molecular no câncer de mama Verificado usando amostras que foram previamente triadas usando tecnologia ortogonal Construir biblioteca Preparar modelo Correr sequência Analisar dados Anotar resultados
19 Teste de mutação BRCA no tumor na prática Fornecedores do serviço de teste BRCA: Mutações somáticas Foundation Medicine oferece um serviço de teste BRCA que é realizado no tecido tumoral (FFPE ou biópsia com agulha) FoundationOne Usa NGS Pode identificar alterações no número de cópias, inserções, deleções e rearranjos Resultados de perfis são reportados para o médico e pareados com terapias direcionadas e/ou estudos clínicos Foundation Medicine
20 Teste de mutação BRCA no tumor na prática Futuro dos fornecedores do serviço de teste BRCA: Mutações somáticas Myriad estabeleceu um laboratório Tumor BRACAnalysis CDx na Europa 1 Estudo recente avaliou 131 pacientes previamente não tratados com câncer de ovário em alto grau 2 O teste Tumor BRACAnalysis CDx identificou 28,3% das mulheres com mutações BRCA1 / 2 germinativas ou somáticas 2 Em contraste, teste germinativo no sangue identificou apenas as 19,6% das pacientes com mutações BRCA1 / 2 germinativas 2 Mutações somáticas identificadas pelo teste Tumor BRACAnalysis CDx representa um aumento de 44% na detecção de mutações BRCA causadoras de câncer em relação ao teste germinativo 2 Médicos prescritores receberam os resultados do teste Tumor BRACAnalysis CDx em aproximadamente 2 semanas Acessado em 13 Nov Acessado em 13 Nov 2014.
21 Teste do tumor: O futuro
22 Teste do tumor: O futuro O futuro do teste de tumor para mutações somáticas em câncer de ovário O objetivo final futuro do teste de tumor em câncer de ovário é a disponibilidade do teste para mutações BRCA1 / 2 somáticas usando tecido FFPE 1 Direcionado por tecnologia NGS Métodos a base de kit Pode ser inicialmente realizado, pois tem o potencial para detectar mutações germinativas e somáticas Outros objetivos incluem: Testar pacientes com câncer de ovário seroso de alto grau com deficiência de recombinação homóloga, incluindo identificação de outras vias de sinalização molecular como RB, RAS/Raf, Notch e FOXM1 2 Desenvolver ensaio para hipermetilação BRCA1 somática, que também inativa um alelo de BRCA1 1 Painel de triagem NGS para incluir outros genes envolvidos no reparo por recombinação homóloga do dano do DNA, por exemplo, RAD51 1 Armazenamento de tecido fresco/congelado na biópsia inicial facilitaria o teste somático e superaria os problemas encontrados com tecido FFPE 1 1. Comunicação pessoal de Dr Emma How e, Genomic Diagnostics Laboratory, St Mary s Hospital, Manchester, UK. 2. Pothuri B. Ann Oncol 2013;24(Suppl. 8):viii22 viii27.
23 Resumo
24 Resumo Resumo Mutações somáticas que ocorrem de novo nas células no tecido de ovário estão cada vez mais sendo reconhecidas e relacionadas com câncer de ovário O teste futuro de rotina de tumor de amostras de tumor de ovário melhoraria os desfechos do paciente através de terapia adequadamente direcionada
25 AstraZeneca reconhece, com agradecimentos, as opiniões de especialistas e diretrizes recebidas de: Dr Andrew Wallace, Dr Emma Howard e membros associados do Genomic Diagnostic Laboratory, Manchester Centre for Genomic Medicine, Manchester Reino Unido durante o desenvolvimento desta plataforma educacional
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