ALIMENTOS PROBIÓTICOS: APLICAÇÕES COMO PROMOTORES DA SAÚDE HUMANA PARTE 1 PROBIOTICS FOODS: APPLICATION AS THE PROMOTERS OF THE HUMAN HEALTH PART 1

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1 ALIMENTOS PROBIÓTICOS: APLICAÇÕES COMO PROMOTORES DA SAÚDE HUMANA PARTE 1 PROBIOTICS FOODS: APPLICATION AS THE PROMOTERS OF THE HUMAN HEALTH PART 1 ANDRÉA CÁTIA LEAL BADARÓ Docente dos cursos de Nutrição e Farmácia do Centro Universitário do Leste de Minas Gerais Unileste-MG andreabadaro@uol.com.br ANA PAULA MUNIZ GUTTIERRES Doutoranda em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa UFV paulagutti@yahoo.com.br ANA CAROLINA VALENTE REZENDE Mestranda em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa UFV carolvrezende@yahoo.com.br PAULO CÉSAR STRINGHETA Doutor em Ciências dos Alimentos pela Universidade de Campinas Unicamp pstringheta@yahoo.com.br RESUMO O papel de uma alimentação saudável na manutenção da saúde tem despertado interesse dos consumidores e da comunidade científica, o que vem estimulando inúmeros estudos com o intuito de comprovar a atuação de componentes bioativos na redução de riscos de certas doenças. Os alimentos funcionais devem produzir benefícios específicos à saúde, reduzindo o risco de diversas doenças, conduzindo ao bem estar físico e mental. Assim sendo, tem ocorrido um grande avanço no desenvolvimento dos chamados produtos probióticos, prebióticos e simbióticos. Entre os papéis potencialmente benéficos dos probióticos, são citadas a ativação do sistema imune, atividade anticarcinogênica, síntese de vitaminas do complexo B, melhora na digestão da lactose por indivíduos lactase não persistentes e a modulação dos níveis de colesterol sérico. Este trabalho apresenta uma revisão sobre os conceitos, principais microrganismos, alegações de função e saúde dos probióticos em alimentos destinados para humanos. Palavras-chave: probióticos, alimentos funcionais, microbiota intestinal. ABSTRACT

2 2 The role of the healthy feed on health maintenance have increase the interest or consumers and scientists, stimulating many studies aiming to give evidence the performance of bioactives ingredients on decreased of diseases hazards. The functional foods should to enhance specific benefits to the health, reducing the risk of several diseases and promoting physicals and mental health. The main roles of probiotics are to stimulate the immune system, the antimutagenic and the anticarcinogenic properties, complex B vitamins syntesis, alleviation of lactose intolerance and modulation on serum cholesterol. This work shows the review about the concepts, main microorganisms, functional and health claim of the probiotics used in foods to human. Key words: probiotics, functional foods, intestinal microorganisms. INTRODUÇÃO Desde os tempos remotos, o alimento é considerado essencial e indispensável à vida humana. Ele provê todos os elementos necessários para homem, não só para o desenvolvimento físico, mas também para todas as atividades intelectuais e sociais. Vários estudos mostram que qualidade de vida é intimamente associada com o tipo de dieta diária e o estilo de vida de cada indivíduo (MOURA, 2005; CRUZ et al., 2007). O papel da alimentação equilibrada na manutenção da saúde tem despertado interesse pela comunidade científica que tem produzido inúmeros estudos com o intuito de comprovar a atuação de alguns alimentos na redução de riscos de certas doenças, além do considerável interesse em incentivar as pesquisas de novos componentes naturais e o desenvolvimento de novos ingredientes, possibilitando a inovação em produtos alimentícios e a criação de novos nichos de mercado para estes ingredientes (THAMER e PENNA, 2006; ARAÚJO, 2007). A evolução dos conhecimentos sobre o papel dos componentes fisiologicamente ativos dos alimentos, de fontes vegetais e animais tem mudado o entendimento do papel da dieta sobre a saúde (ADA, 2004). Este fato tem aumentado o interesse mundial para melhorar a qualidade da nutrição e reduzir os gastos com saúde por meio da prevenção de doenças crônicas, da melhoria da qualidade e da expectativa de vida ativa (STRINGHETA et al., 2007a). Segundo Moraes e Colla (2006), inúmeros fatores influenciam a qualidade da vida moderna, levando a população a conscientizar-se da importância de alimentos contendo substâncias que auxiliam a promoção da saúde, melhorando o estado nutricional. A incidência de morte provocada por câncer, acidente vascular cerebral, aterosclerose, enfermidade hepática, dentre outros, pode ser minimizada por meio de bons hábitos alimentares.

3 3 Em meados dos anos 80, surgiu no Japão o termo alimentos funcionais, como resultado de esforços para desenvolver alimentos que possibilitassem a redução dos gastos com saúde pública, considerando a elevada expectativa de vida naquele país (ARAYA e LUTZ, 2003). Até aquela data, o Japão era o único país que tinha formulado uma regulação específica para os alimentos funcionais, conhecidos como Alimentos para Uso Específico de Saúde (FOSHU) (ROBERFROID, 2002). O termo funcional implica que o alimento tem algum valor principal identificado para o benefício da saúde, incluindo a redução do risco de doença para a pessoa que o esteja consumindo (STRINGHETA et al., 2007b). Os alimentos funcionais podem ser considerados como parte importante do bem-estar, no qual também se incluem uma dieta equilibrada e atividade física. O guia alimentar para a população brasileira recomenda o estímulo à prática de atividade física e a adoção de uma dieta variada e alerta para não se mistificar os componentes funcionais dos alimentos (MORAES & COLLA, 2006; STRINGHETA et al., 2007b). Alimentos funcionais também são conhecidos por outros nomes, como nutracêuticos, alimentos terapêuticos e alimentos medicinais. Tais alimentos podem conter um ou até mesmo uma combinação de componentes que dão desejáveis efeitos fisiológicos no corpo humano (CRUZ et al., 2007). No Brasil, estima-se que as vendas de alimentos funcionais chegam a US$ 500 milhões por ano, representando aproximadamente 1% do total do comércio brasileiro de alimentos processados industrializados, segundo dados da Associação Brasileira de Indústrias de Alimentos (ABIA). Esta associação representa os interesses da indústria de alimentos brasileiros e adicionalmente dos produtos lácteos funcionais, nutracêuticos e produtos à base de soja que já ocupam um significativo e promissor mercado (ALIMENTO SEGURO, 2005). Neste contexto, tem ocorrido um grande avanço no desenvolvimento dos chamados produtos probióticos, prebióticos e simbióticos (LOURENS-HATTING, 2002). O interesse pelos efeitos benéficos à saúde humana proporcionado especialmente por bactérias ou leveduras viáveis tem provocado um aumento mundial na comercialização de produtos que contenham estes microrganismos (ARAÚJO, 2007). Este trabalho apresenta uma revisão sobre os conceitos, principais microrganismos e fontes, alegações de função e de benefícios para saúde. CONCEITOS DE PROBIÓTICOS, PREBIÓTICOS E SIMBIÓTICOS

4 4 simbióticos. Uma classe importante de alimentos funcionais são os probióticos, prebióticos e A palavra Probiótico, que significa para a vida, é um termo derivado da língua grega (NEVES, 2005). A terminologia conceitual foi inicialmente proposta por Fuller, após os primeiros ensaios clínicos. Probióticos podem ser definidos como suplementos alimentares que contêm microrganismos vivos, ou componentes microbianos que, quando ingeridos em determinado número, apresentam efeito benéfico sobre a saúde e bem-estar do hospedeiro. São capazes de melhorar o equilíbrio microbiano intestinal produzindo efeitos positivos à saúde do indivíduo (SALMINEN et al., 1999; DUPONT, 2001; FAO/WHO, 2001; ISOULARI, 2001; REID et al., 2001; BRASIL, 2002; SANDERS, 2003). O conceito de probiótico pode ser também definido como o uso de exclusão competitiva para melhorar uma ecologia específica. A terapia ou prevenção com probióticos introduz um tipo de bactéria benéfica em detrimento à diminuição de outra espécie de bactéria (MOMBELLI e GISMONDO, 2000). As células probióticas depois de ingeridas devem ser capazes de sobreviverem às condições de estresse presentes no trato gastrointestinal, como suco gástrico, presença de sais biliares e enzimas digestivas e manter sua viabilidade e atividade metabólica no intestino para exercerem os efeitos benéficos aos hospedeiros. Quanto aos desafios tecnológicos para a produção industrial de células, estas devem manter-se estáveis e viáveis em níveis satisfatórios durante todo o prazo de validade do produto (SAAD, 2006; ARAÚJO, 2007). Segundo Santos et al. (2003) e Brizuela et al. (2001), são sete os critérios para um microrganismo ser empregado como probiótico: i) não apresentar patogenicidade; ii) ser Grampositivo; iii) ser produtor de ácido e ser ácido resistente; iv) apresentar especificidade ao hospedeiro; v) apresentar excreção de fator anti-e. coli; vi) ser resistente à bile, e vii) ser viável/estável. Os Prebióticos são definidos como oligossacarídeos que não são digeríveis no intestino delgado e atingem o intestino grosso onde atuam estimulando seletivamente o crescimento de bactérias desejáveis no cólon, alterando a microbiota em favor de uma composição mais saudável (MANNING et al., 2004). Os oligossacarídeos, como os frutooligossacarídeos (FOS) e inulina atendem as condições dos prebióticos. Adicionalmente, os prebióticos podem inibir a multiplicação de patógenos, garantindo benefícios adicionais à saúde do hospedeiro. Esses componentes atuam mais freqüentemente

5 5 no intestino grosso, embora eles possam ter também algum impacto sobre os microrganismos do intestino delgado (GIBSON e ROBERFROID, 1995; ROBERFROID, 2001; SAAD, 2006). Eles agem estimulando o crescimento dos grupos endógenos de população microbiana benéfica para a saúde humana, como as bifidobactérias e os lactobacilos (ROBERFROID, 2002). De acordo com Lorente e Serra (2001), as substâncias mais estudadas por seu efeito prebiótico são os oligossacarídeos, os glicoconjugados do leite humano e os frutooligossacarídeos encontrados em frutas e hortaliças. Os oligossacarídeos protegem especificamente os recém-nascidos frente à patógenos causadores de diarréia, favorecendo a colonização por Bifidobacterium bifidum e interferem na ação patógena de Escherichia coli e Campylobacter jejuni. Os Simbióticos referem-se à combinação de bactérias probióticas e de substâncias prebióticas que afetam beneficamente o hospedeiro por melhorar a sobrevivência e implantação de microrganismos vivos no trato gastrodigestório e por favorecer seletivamente o crescimento ou atividade metabólica de bactérias promotoras de saúde no cólon (O SULLIVAN, 2001; ARAÚJO, 2007). Os alimentos simbióticos estão representados principalmente pelos produtos lácteos fermentados (ROWLAND et al., 1997; DIPLOCK et al., 1999). A interação entre o probiótico e o prebiótico in vivo pode ser favorecida por uma adaptação do probiótico ao substrato prebiótico anterior ao consumo, podendo resultar em uma vantagem competitiva para o probiótico, se ele for consumido juntamente com o prebiótico. Alternativamente, esse efeito simbiótico pode ser direcionado às diferentes regiões do trato gastrintestinal. O consumo de probióticos e de prebióticos apropriadamente selecionados pode aumentar os efeitos benéficos de cada um deles, uma vez que o estímulo de cepas probióticas conhecidas leva à escolha dos pares simbióticos substrato-microrganismo ideais (BIELECKA et al., 2002; HOLZAPFEL e SCHILLINGER, 2002; MATTILA- SANDHOLM et al., 2002; PUUPPONEN-PIMIÄ et al., 2002; SAAD, 2006). Em virtude dos efeitos benéficos produzidos pelos probióticos e prebióticos, tem havido um considerável interesse por parte das indústrias em desenvolver produtos alimentícios que contenham estes microrganismos e ingredientes funcionais (STANTON et al., 1998). A MICROBIOTA INTESTINAL

6 6 O trato gastrintestinal humano é um microecossistema cinético que possibilita o desempenho normal das funções fisiológicas do hospedeiro, a menos que microrganismos prejudiciais e potencialmente patogênicos dominem a microbiota (SAAD, 2006). A microbiota normal do intestino é ainda um órgão de defesa inexplorado do organismo. Embora sejam distribuídas bactérias ao longo do intestino, a maior concentração de microrganismos e atividade metabólica é encontrada no intestino grosso (BERG, 1996; SALMINEN et al., 1998; GUARNER e MALAGELADA, 2003). A cavidade oral possui uma microbiota complexa, que consiste em anaeróbios facultativos e estritos, incluindo estreptococos, Bacteroides, lactobacilos e leveduras. O intestino delgado é escassamente povoado, e a partir do íleo as concentrações bacterianas aumentam gradualmente, alcançando a Unidades Formadoras de Colônia (UFC)/g no cólon. Até 500 espécies de bactérias podem estar presentes no intestino grosso de um humano adulto, levando em conta que os microrganismos correspondam por 35-50% do volume do conteúdo do cólon humano (ISOLAURI et al., 2004). A microbiota gastrointestinal humana exerce um papel fundamental na nutrição e saúde. Pelo processo de fermentação, as bactérias do intestino metabolizam vários substratos (principalmente componentes dietéticos) formando produtos finais como ácidos graxos de cadeia curta e gases. Este metabolismo contribui positivamente para atendimento das necessidades energéticas diárias do hospedeiro. O intestino grosso humano é um órgão metabolicamente bastante ativo, fato atribuído para a microbiota residente e suas atividades. Normalmente, o organismo hospedeiro vive em harmonia com a microbiota complexa do intestino (RASTAL et al., 2000). Quando em equilíbrio, a microbiota intestinal impede que microrganismos potencialmente patogênicos nela presentes exerçam seus efeitos. Por outro lado, o desequilíbrio desta microbiota pode resultar na proliferação de patógenos, com conseqüente infecção bacteriana (ZIEMER e GIBSON, 1998; ISOLAURI et al., 2004). A influência benéfica dos probióticos sobre a microbiota intestinal humana inclui fatores como os efeitos antagônicos e a competição contra microrganismos indesejáveis e os efeitos imunológicos (PUUPPONEN-PIMIÄ et al., 2002). Porém, sob certas circunstâncias como a ingestão de antimicrobianos, dieta pobre em determinados nutrientes e condições de vida, o equilíbrio da microbiota pode sofrer alterações

7 7 e transtornos. Além disso, o processo fermentativo normal pode produzir metabólitos indesejáveis como amônia, compostos fenólicos e toxinas (RASTAL et al., 2000). A microbiota do intestino também está susceptível à contaminação por patógenos passageiros, que altera a estrutura da colonização normal, podendo levar a desordens intestinais agudas e/ou crônicas. Sendo assim, o intestino grosso é o foco principal para os alimentos funcionais que são utilizados no fortalecimento das funções normais do intestino, e ajudando a prevenir deficiências orgânicas. A colonização da microbiota é determinada pela suscetível ação de certos grupos e mecanismos dietéticos (SALMINEN et al., 1998). A hidrólise e o metabolismo de carboidratos no intestino grosso são influenciados por uma variedade de fatores físicos, químicos, biológicos e ambientais. Destes, provavelmente seja a natureza e quantidade de substrato disponível que tenha maior significado, fazendo da dieta o principal e mais fácil mecanismo pelo qual se pode influenciar o perfil de fermentação. Outros fatores que afetam a colonização e crescimento de bactérias no intestino são o ph do intestino, a produção de metabólitos inibidores (ácidos e peróxidos) e de substâncias inibitórias específicas (bacteriocinas), sais biliares e eventos imunológicos (RASTAL et al., 2000). O conhecimento da microbiota intestinal e suas interações levou ao desenvolvimento de estratégias alimentares objetivando a manutenção e o estímulo das bactérias normais ali presentes (GIBSON e FULLER, 2000). É possível aumentar o número de microrganismos promotores da saúde no trato gastrintestinal através da introdução de probióticos pela alimentação ou com o consumo de suplemento alimentar prebiótico, o qual irá modificar seletivamente a composição da microbiota, fornecendo ao probiótico vantagem competitiva sobre outras bactérias do ecossistema (CRITTENDEN, 1999). A ligação de bactérias probióticas aos receptores da superfície celular dos enterócitos também dá início às reações em cascata que resultam na síntese de citocinas (KAUR et al., 2002). Dados experimentais indicam que diversos probióticos são capazes de modular algumas características da fisiologia digestiva, como a imunidade da mucosa e a permeabilidade intestinal (FIORAMONTI et al., 2003). OS PROBIÓTICOS As bactérias do ácido lático são as principais representantes dos probióticos em alimentos e produtos farmacêuticos. Dentre essas podemos incluir muitas espécies de

8 8 Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus e ainda algumas cepas não patogênicas de Escherichia coli (CABRÉ e GASSULL, 2007). A reintrodução destes grupos microbianos no hospedeiro é feita por meio da administração de probióticos que afetam beneficamente o hospedeiro pela melhora do balanço da microbiota intestinal (BOTELHO, 2005). As bactérias lácticas são Gram-positivas, quase sempre catalase negativas, não formadoras de esporos e acumulam ácido lático no ambiente em que crescem como produto do metabolismo primário. Todos os componentes do grupo lático são fastidiosos e estão presentes em ambientes nutricionalmente ricos como vegetais, leite, carne e trato intestinal. São anaeróbios, anaeróbios facultativos ou microaerófilos (SAAD, 2006). Para garantir um efeito contínuo, os probióticos devem ser ingeridos diariamente. Alterações favoráveis na composição da microbiota intestinal foram observadas com doses de 100 g de produto alimentício contendo UFC de microrganismos probióticos (10 7 a 10 6 UFC/g de produto), geralmente com a administração durante o período de 15 dias (BLANCHETTE et al., 1996; JELEN e LUTZ, 1998). Bactérias pertencentes aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium e, em menor escala, Enterococcus faecium, são mais freqüentemente empregadas como suplementos probióticos para alimentos, uma vez que elas têm sido isoladas de todas as porções do trato gastrintestinal do humano saudável (SAAD, 2006). O íleo terminal e o cólon parecem ser os locais de preferência para colonização intestinal dos lactobacilos e bifidobactérias (CHARTERIS et al., 1998; BIELECKA et al., 2002). Entretanto, deve ser salientado que o efeito de uma bactéria é específico para cada cepa, não podendo ser extrapolado, inclusive para outras cepas da mesma espécie (GUARNER e MALAGELADA, 2003). Bactérias pertencentes aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium são mais freqüentemente empregadas como suplementos probióticos para alimentos (CHARTERIS et al., 1998). O uso mais comum de microrganismos probióticos tem sido em produtos lácteos - leites fermentados, sorvetes e queijos. E sua viabilidade neste tipo de produto pode ser afetada por vários fatores como a produção de ácido lático e peróxido de hidrogênio por fermentos tradicionais, presença de oxigênio, assim como interações entre cepas presentes e a concentração de açúcar (BARRETO et al., 2003; SHAH et al., 2007). Microrganismos probióticos são freqüentemente usados em alimentos fermentados e a fermentação age para reter e otimizar a viabilidade microbiana e produtividade, enquanto, simultaneamente, preserva as propriedades probióticas. Durante a fermentação, vários

9 9 produtos metabólicos aparecem no alimento, incluindo ácido láctico, ácido acético, bacteriocinas, e o ph do produto diminui. Estas mudanças podem afetar a estabilidade de bactérias probióticas, alterando suas propriedades funcionais. Na aplicação em produtos fermentados devem também contribuir na melhoria da qualidade sensorial do produto (ISOULARI et al., 2004). Gênero Bifidobacterium Segundo Gomes e Malcata (2002), as bifidobactérias foram isoladas pela primeira vez no final do século 19 por Tissier, sendo, em geral, caracterizadas por serem microrganismos gram-positivos, não formadores de esporos, desprovidos de flagelos, catalase-negativos e anaeróbios. No que diz respeito à sua morfologia, podem ter várias formas que incluem bacilos curtos, curvados ou bifurcados. Atualmente, o gênero Bifidobacterium inclui 30 espécies, 10 das quais são de origem humana (cáries dentárias, fezes e vagina), 17 de origem animal, 2 de águas residuais e 1 de leite fermentado. Esta última tem a particularidade de apresentar uma boa tolerância ao oxigênio, ao contrário da maior parte das outras do mesmo gênero. Dentre as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium, destacam-se B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. animalis, B. longum e B. thermophilum (LEE et al., 1999; SANDERS e KLAENHAMMER, 2001). Somente cinco espécies de Bifidobacterium de origem humana (B. longum, B. bifidum, B. breve, B. infantis e B. adolescentis) têm atraído a atenção da indústria para a produção de produtos lácteos fermentados com fins terapêuticos (BOTELHO, 2005). Bifidobactérias são habitantes naturais do trato gastrintestinal humano. Atualmente, estudos científicos in vivo usando animais ou voluntários humanos têm demonstrado que o consumo de células vivas destes microrganismos tem efeito sobre a microbiota do trato digestivo. Estirpes selecionadas sobrevivem ao estômago e ao trânsito intestinal e atingem o cólon em número elevado. Recém-nascidos são colonizados por bactérias bífidas durante os dias após o nascimento e a população parece se manter relativamente estável até idade avançada, quando ocorre um declínio. Entretanto, dieta, antibióticos e estresse são apontados como capazes de influenciar a população de bifidobactérias no intestino (SHAH, 2007). Para resistir às condições do trato gastrointestinal culturas probióticas devem apresentar tolerância à bile e atividade de hidrólise de sais biliares, além de resistir a condições ácidas e ricas de proteases. Adicionalmente, devem ser capazes de competir com a

10 10 microbiota normal e resistir aos metabólitos produzidos por membros dessa microbiota, incluindo bacteriocinas, ácidos orgânicos e outros agentes antimicrobianos (KLAENHAMMER e KULLEN, 1999). Quanto ao aspecto taxonômico, as culturas probióticas devem ser identificadas e classificadas, com base em suas características fenotípicas e, principalmente, genotípicas. Na caracterização genética é importante incluir análises filogenéticas em diferentes graus de sofisticação, objetivando não só a correta classificação, mas também a geração de fingerprints ou impressão digital da bactéria, que permitam a inequívoca recuperação e identificação em alimentos e também quando introduzidas no sistema gastrointestinal em estudos de sobrevivência, colonização e atividade funcional in vivo (KLAENHAMMER e KULLEN, 1999). Gênero Lactobacillus Outro gênero que integra o hall dos agentes probióticos é o Lactobacillus, isolado pela primeira vez por Moro, em 1900, a partir das fezes de lactentes amamentados com leite materno. Este investigador atribuiu-lhes o nome de Bacillus acidophilus, designação genérica dos lactobacilos intestinais. O gênero Lactobacillus conta hoje com 56 espécies reconhecidas, das quais 5 contêm subespécies (delbrueckii, aviarius, salivarius, coryniformis e paracasei). Dezoito delas, presentes na microbiota intestinal de humanos, são consideradas de interesse como probióticos. Dentre as bactérias láticas deste gênero, destacam-se Lb. acidophilus, Lb. helveticus, Lb. casei - subsp. paracasei e subsp. tolerans, Lb. paracasei, Lb. fermentum, Lb. reuteri, Lb. johnsonii, Lb. plantarum, Lb. rhamnosus e Lb. salivarius (KLAENHAMMER e KULLEN, 1999). De acordo com o Bergey s Manual of Determinate Bacteriology, o gênero Lactobacillus é composto por bacilos Gram positivos, regulares e não esporulados. Possuem morfologia celular variando de bacilos longos e finos até, algumas vezes, como bacilos curvados e pequenos (BOTELHO, 2005). Este gênero compreende, neste momento, 56 espécies oficialmente reconhecidas (GOMES e MALCATA, 2002). A dificuldade na classificação é discutida por diversos autores, já que o gênero comporta muitas espécies, sendo algumas, muito distantes geneticamente umas das outras e outras altamente relacionadas, variando somente na extensão da fermentação de alguns carboidratos (BOTELHO, 2005).

11 11 Os Lactobacillus são microaerófilos e, quando cultivados em meios sólidos, geralmente o desenvolvimento é melhor em anaerobiose ou pressão de oxigênio reduzido e 5% a 10% de CO 2 ; alguns são anaeróbios em isolamento. Nos meios usuais de crescimento, os lactobacilos raramente produzem pigmentos que, quando presentes, são amarelados, laranja-ferrugem ou vermelho-tijolo. Crescem em temperaturas que variam de 2ºC a 53ºC, com valores ótimos, geralmente, de 30ºC a 40ºC. São acidúricos, com ph ótimo entre 5,5 e 6,2; o crescimento ocorre a ph 5,0 ou menos. A taxa de crescimento é freqüentemente reduzida em meios neutros ou alcalinos. Nas diversas espécies, a redução do nitrato não é usual, podendo acontecer, porém, quando o ph terminal é estabilizado acima de 6,0 (BOTELHO, 2005). As características fenotípicas mais utilizadas na identificação de Lactobacillus são: forma, coloração de Gram, arranjo, motilidade, catalase, temperatura máxima e mínima de crescimento e fermentação de 33 diferentes tipos carboidratos (BOTELHO, 2005). MECANISMOS DE AÇÃO Três possíveis mecanismos de atuação são atribuídos aos probióticos, sendo o primeiro deles a supressão do número de células viáveis através da produção de compostos com atividade antimicrobiana, a competição por nutrientes e a competição por sítios de adesão. O segundo desses mecanismos seria a alteração do metabolismo microbiano, através do aumento ou da diminuição da atividade enzimática. O terceiro seria o estímulo da imunidade do hospedeiro, através do aumento dos níveis de anticorpos e o aumento da atividade dos macrófagos. O espectro de atividade dos probióticos pode ser dividido em efeitos nutricionais, fisiológicos e antimicrobianos (SAAD, 2006). Os probióticos exercem ações diversas sobre a saúde mediante distintos mecanismos de ação. Atuam acidificando a luz intestinal, se agregando às substâncias que inibem o crescimento de microrganismos patogênicos, consumindo nutrientes específicos, competitividade a receptores intestinais de forma que mantêm a microbiota intestinal evitando a ação de patógenos. Têm atividades imunomoduladoras, principalmente por modificarem a resposta a antígenos; aumentarem a secreção de IgA especifica frente a rotavirus; facilitarem a captação de antígenos na placa de Peyer; produzirem enzimas hidrolíticas, e diminuirem a inflamação intestinal (LORENTE e SERRA, 2001).

12 12 Os prebióticos exercem um efeito osmótico no trato gastrintestinal, enquanto não são fermentados. Quando fermentados pela microbiota endógena, eles aumentam a produção de gás. Portanto, os prebióticos apresentam o risco teórico de aumentar a diarréia em alguns casos (devido ao efeito osmótico) e de serem pouco tolerados por pacientes com síndrome do intestino irritável. Os probióticos, por outro lado, não apresentam esse inconveniente teórico e têm sido efetivos na prevenção e no alívio de diversos episódios clínicos, envolvendo diarréia (MARTEAU e BOUTRON-RUAULT, 2002). A modulação da microbiota intestinal por esses prebióticos é conseqüente à alteração da composição desta microbiota por uma fermentação específica, a qual resulta em uma comunidade em que há predomínio de bifidobactérias (KAUR e GUPTA, 2002). Vem crescendo as evidências que sugerem que probióticos possam ser efetivos na prevenção de infecção no trato urinário. O mecanismo de ação proposto inclui inibição do crescimento e adesão de patogênicos na mucosa vaginal e uretral antes do acesso destes patógenos dentro da bexiga (GERASIMOV, 2004). ALEGAÇÕES DE FUNÇÃO E BENEFÍCIOS PARA SAÚDE No início do século passado, Metchnikoff introduziu a hipótese do efeito benéfico das bactérias por meio da teoria da longevidade dos caucasianos, cuja dieta era baseada na ingestão de leites fermentados. Segundo ele, os lactobacilos presentes nestes produtos criariam no intestino humano condições desfavoráveis a outros microrganismos que poderiam produzir um efeito tóxico ao hospedeiro (HOLZAPFEL e SCHILLINGUER, 2002). Muitos estudos clínicos têm investigado o uso de probióticos como suplementos na alimentação em casos de infecções do trato gastrodigestório e condições inflamatórias. Evidências demonstram que estirpes específicas selecionadas da microbiota intestinal saudável exibem poderosas capacidades antipatogênicas e antiinflamatórias e são conseqüentemente envolvidas na modulação da microbiota intestinal (ISOLAURI et al., 2004). Segundo Saad (2006), os principais benefícios à saúde do hospedeiro atribuídos à ingestão de culturas probióticas podem ser resumidos em: Controle da microbiota intestinal; Estabilização da microbiota intestinal após o uso de antibióticos;

13 13 Promoção da resistência gastrintestinal à colonização por patógenos; Diminuição da população de patógenos através da produção de ácidos acético e lático, de bacteriocinas e de outros compostos antimicrobianos; Promoção da digestão da lactose em indivíduos intolerantes à lactose; Estimulação do sistema imune; Alívio da constipação; Aumento da absorção de minerais e produção de vitaminas. Os probióticos auxiliam a recompor a microbiota intestinal, através da adesão e colonização da mucosa intestinal, ação esta que impede a adesão e subseqüente produção de toxinas ou invasão das células epiteliais (dependendo do mecanismo de patogenicidade) por bactérias patogênicas. Adicionalmente, os probióticos competem com as bactérias indesejáveis pelos nutrientes disponíveis no nicho ecológico. O hospedeiro fornece as quantidades de nutrientes que as bactérias intestinais necessitam e estas indicam ativamente as suas necessidades. Essa relação simbiótica impede uma produção excessiva de nutrientes, a qual favoreceria o estabelecimento de competidores microbianos com potencial patogênico ao hospedeiro. Além disso, os probióticos podem impedir a multiplicação de seus competidores, através de compostos antimicrobianos, principalmente bacteriocinas, ácidos orgânicos voláteis e peróxido de hidrogênio (KOPP-HOOLIHAN, 2001; CALDER e KEW, 2002; GUARNER e MALAGELADA, 2003). O efeito dos probióticos no sistema imune tem também sido objeto de numerosos estudos há mais de 20 anos. Certas linhagens de Bactérias do Ácido Lático são capazes de estimular, bem como regular, vários aspectos das respostas imune natural e adquirida. Estas incluem, por exemplo, aumento da atividade fagocítica de leucócitos, estimulação de resposta não-específica (IgA) e específica (anticorpos) e aumento da produção de citocinas in vivo. Grande parte das evidências de sistemas in vitro e de modelos animais e humanos sugere que os probióticos podem estimular tanto a resposta imune não-específica quanto específica. Acredita-se que esses efeitos sejam mediados por uma ativação dos macrófagos, por um aumento nos níveis de citocinas, por um aumento da atividade das células destruidoras naturais (NK = natural killer) e/ou dos níveis de imunoglobulinas (GILLILAND, 2001; SAAD, 2006). Quanto aos critérios dietéticos e terapêuticos, culturas probióticas destinadas ao consumo humano devem ser originárias do trato intestinal humano, porque são altamente

14 14 compatíveis com o ambiente intestinal e toleradas pelo sistema imunológico do hospedeiro, uma vez que persistem nesse ecossistema ao longo do tempo (KLAENHAMMER e KULLEN, 1999). Strauss e Caly (2003) citam que há possibilidade de opcionalmente se prevenir com probióticos a recorrência de peritonite bacteriana espontânea causada por cirrose ou insuficiência hepática, por diminuir o número de bactérias patogênicas e por aumentar a imunidade do intestino, juntamente com antibióticos de uso contínuo como a norfloxacina que já são utilizados no tratamento clássico. A alteração do metabolismo microbiano pelos probióticos ocorre por meio do aumento ou diminuição da atividade enzimática. Uma função vital das bactérias láticas na microbiota intestinal é produzir a enzima β-d-galactosidade (galactosidase), auxiliando a quebra da lactose no intestino. Essa ação é fundamental, particularmente no caso de indivíduos com intolerância à lactose, os quais são incapazes de digeri-la adequadamente, o que resulta em desconforto abdominal em grau variável (LOURENS-HATTINGH e VILJOEN, 2002). Diversas evidências têm demonstrado que o consumo de quantidades adequadas, de cepas apropriadas de bactérias láticas (incluindo bactérias láticas não-probióticas como Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus) é capaz de aliviar os sintomas de intolerância à lactose. Desta maneira, consegue-se incorporar produtos lácteos e os nutrientes importantes que fazem parte desses produtos de volta à dieta de indivíduos intolerantes à lactose, que normalmente se vêem obrigados a restringir a ingestão desses produtos. Outro efeito descrito foi a redução ou supressão da atividade de enzimas fecais, como a β- glicuronidase, a nitrorredutase, a azorredutase (LEE et al., 1999; KOPP-HOOLIHAN, 2001). Lactobacilos e bifidobactérias estão relacionados com a redução do risco de alergias de origem alimentar. Estas bactérias são capazes de induzir a quebra de proteínas com potencial alergênico no trato gastrintestinal, processo que pode contribuir para a redução da alergenicidade de proteínas (MORAIS e JACOB, 2006). Até então, o único tratamento para alergias de origem alimentar era a eliminação do alimento envolvido da dieta. Entretanto, existem evidências científicas para a aplicação de probióticos no controle destas alergias. Os resultados de ensaios conduzidos em crianças confirmam que probióticos podem ser aplicados para atenuar sintomas de doenças alérgicas em humanos e pode levar a uma nova forma de tratamento de alergias de origem alimentar, particularmente em crianças que possuem microbiota em desenvolvimento (MATTILA- SANDHOLM et al., 1999).

15 15 Majamaa e Isolauri (1997) demonstraram que crianças com dermatite atópica e com alergia ao leite de vaca ao serem alimentadas com uma fórmula de hidrolisado de soro fortificado com probiótico (Lactobacillus GG.) durante o período de um mês de tratamento apresentaram uma melhoria clínica, com redução de mais de 50% do índice de dermatite atópica (SCORAD-Clinical score of atopic dermatitis) quando comparadas ao grupo placebo. As bactérias lácticas são fatores que garantem a preservação e as características sensoriais de vários produtos, contribuindo para textura, paladar, percepção do gosto e estabilidade de produtos fermentados pela síntese de exopolissacarídeos (SOUZA et al., 2007). A contribuição das bactérias do iogurte na melhora da microbiota intestinal tem sido vastamente reconhecida. A incorporação de L. acidophilus e B. bifidum nos iogurtes geram produtos de excelente valor terapêutico. Um consumo regular de iogurte ( g/semana) contém 1,0 x 10 6 UFC/g de Bifidobacterium sp. e L. acidophilus, estes por sua vez deverão sobreviver à passagem pelo trato intestinal para que possam oferecer seus efeitos terapêuticos benéficos (BOTELHO, 2005). Embora ainda não comprovados, outros efeitos atribuídos a essas culturas são a diminuição do risco de certos tipos câncer (como o de cólon) e de doenças cardiovasculares. São sugeridos, também, a diminuição das concentrações plasmáticas de colesterol, efeitos anti-hipertensivos, redução da atividade ulcerativa de Helicobacter pylori, controle da colite induzida por rotavirus e por Clostridium difficile, prevenção de infecções urogenitais, além de efeitos inibitórios sobre a mutagenicidade (KAUR et al., 2002; TUOHY et al., 2003). Quanto aos seus efeitos anticarcinogênicos, estes podem ser atribuídos à inibição de enzimas prócarcinogênicas ou à estimulação do sistema imune do hospedeiro (ISOLAURI et al., 2004). Cabré e Gassull (2007) relatam que, em contraste com a colite ulcerativa e a inflamação aguda da mucosa intestinal, os benefícios da terapia com probióticos na prevenção da reincidência/reaparição da doença de Crohn estão longe de serem provados. Ainda os prebióticos, como os frutooligossacarídios, produzem efeitos benéficos à saúde humana, reduzindo o colesterol e prevenindo alguns tipos de câncer (PASSOS e PARK, 2003). VALOR NUTRITIVO

16 16 Os alvos de estudo mais comuns na avaliação do valor nutritivo de estirpes probióticas são os produtos lácteos fermentados por lactobacilos e bifidobactérias. Tais produtos contêm um elevado teor de nutrientes, que variam com o tipo de leite utilizado, o tipo de microrganismo adicionado e o processo de fabricação escolhido. De uma forma geral, o aumento da digestibilidade das proteínas e gorduras, a redução do conteúdo em lactose (de particular importância para os indivíduos com intolerância à lactose), a absorção aumentada de cálcio e ferro, o equilíbrio de conteúdo em várias vitaminas e a presença de alguns metabólitos secundários, acoplados à presença de células probióticas viáveis, fazem dos leites fermentados um dos alimentos naturais mais valiosos recomendados para o consumo humano (GOMES e MALCATA, 2002). Barrenetxe et al. (2006) estudaram o efeito de dietas suplementadas com probióticos sobre a funcionalidade intestinal de ratos. Para tal, animais jovens (28 dias) da raça Swiss foram distribuídos em três grupos experimentais (controle, Lactobacillus casei e Bifidobacterium bifidum), os quais receberam dieta comercial durante 4 semanas acrescido dos respectivos probióticos diluídos em leite, com concentração de 10 8 UFC/mL. De acordo com os resultados, ambas as cepas bacterianas aumentaram a atividade imune, enzimática e de captação de nutrientes do intestino delgado sem prejudicarem o desenvolvimento normal dos animais. VALOR TERAPÊUTICO Inibição de infecções intestinais, um dos valores terapêuticos atribuídos às bactérias probióticas, está alicerçado em mecanismos de ação bem estabelecidos e reconhecidos pela comunidade científica. O epitélio intestinal desempenha um papel de barreira imunológica, estabelecendo a interface entre o conteúdo luminal e as células imunológicas subepiteliais. Qualquer perturbação a esta barreira, desencadeada por antígenos dietéticos, microrganismos patogênicos, agentes químicos ou radiações, conduz a um aumento da permeabilidade intestinal e a alterações estruturais no epitélio, as quais podem ocasionar aumento do fluxo de antígenos e provocar diversos tipos de inflamação (GOMES e MALCATA, 2002). Existem comprovações de que a administração conjunta de glutamina e probióticos na alimentação enteral de pacientes vítimas de traumatismo crânio-encefálico reduz significativamente a ocorrência de infecção (LOPES et al., 2007).

17 17 Arvola et al. (1999) realizaram um teste duplo cego controlado em 119 crianças (idade média de 4,5 anos) que receberam antibióticos para infecções respiratórias, juntamente com cápsulas de L. rhamnosus GG ou de placebo. Observou-se manifestação de diarréia em 5% das crianças que receberam o probiótico e em 16% das que receberam o placebo (p = 0,05). Já no estudo de Thomas e colaboradores (2001) não se pode observar a diminuição do risco de diarréia no teste controlado contra placebo em 267 adultos hospitalizados (29,3% versus 29,9%). Desta forma, é possível que os efeitos variem em função da região ou também da idade. Timmerman et al. (2007) demonstraram que o tratamento de ratos com peritonite bacteriana utilizando a associação da glutamina e probióticos confere um maior trofismo na mucosa, diminuindo o estresse infeccioso. McFarland et al. (1995, apud Marteau e Seksik, 2004) observaram que adultos que tiveram diarréia devido ao Clostridium difficilis pela primeira vez, o tratamento com 1g/dia de probiótico S. boulardii durante quatro semanas não foi significativo. Entretanto em indivíduos que tinham uma reincidência da infecção, foi observada uma redução de metade do risco de reincidência de tal diarréia (34,6 % vs 64,7 %, p = 0,04). Para obtenção destes resultados foram utilizados também testes com placebo. Surawicz et al. (2000) trataram adultos com reincidência de diarréia devido ao C. difficile com forte dose de vancomicina e posteriormente com S. boulardii (1 g/dia, n=18) ou placebo (n=14) durante 28 dias. Observaram que o risco de reincidência de C. boulardii foi de 16,7% para o grupo que recebeu o probiótico e de 50% para o grupo com placebo. Rembacken et al. (1999) realizaram um estudo controlado com 116 pacientes que tinham colite ulcerativa, a fim de avaliar a eficiência de uma estirpe de E. coli não patogênica (Nissle 1917) versus Mesalazine (considerado um eficiente anti-inflamatório) na prevenção de tal doença. Os autores observaram que o probiótico E. coli não patogênico teve a mesma eficiência que a droga farmacológica na redução da colite ulcerativa. Em relação às crianças assistidas por centros de tratamento especializados, Weizman et al. (2005) investigaram o efeito de duas diferentes espécies de probióticos na prevenção de infecções gastrointestinais e respiratórias. Por meio de estudo duplo-cego, placebo-controlado e randomizado, 201 crianças nascidas a termo, entre 4 e 10 meses de idade foram, aleatoriamente, divididas em 3 grupos, que receberam diferentes tratamentos, durante 12 semanas: as alimentadas com fórmulas contendo Bifidobacterium lactis (n=73, teste 1) ou Lactobacillus reuteri (n=68, teste2) e placebo (n=60). As crianças que receberam

18 18 suplementação (teste 1 ou 2) quando comparadas ao placebo, mostraram menos episódios de febre e diarréia, sendo estes episódios com menor duração. Tais efeitos foram mais proeminentes para o teste 2. Em relação à infecção respiratória não foi observada nenhuma modificação entre os tratamentos. Em um estudo desenvolvido por Gotteland et al. (2006) objetivou-se avaliar o efeito do consumo de um produto contendo Lactobacillus johnsonii La1, em diferentes concentrações, sobre a homeostase da microbiota intestinal. Foram avaliados 8 indivíduos saudáveis assintomáticos, os quais consumiram na primeira semana de teste 100 ml de um produto contendo 10 8 UFC/mL, na segunda 200 ml e 500 ml na terceira semana. A excreção fecal de La1 aumentou durante o período experimental até o 14º dia. Entretanto, observou-se aumento das populações de Lactobacillus (p=0,056) e Bifidobacterium (p=0,067) e redução de F. prausnitzii, um microrganismo potencialmente patogênico. Os resultados demonstraram que o consumo regular de La1 é capaz de modular favoravelmente a microbiota intestinal. Semelhante a esse estudo, Obregón e colaboradores (2003) avaliaram o consumo regular de um produto contendo Lactobacillus johnsonii La1 e os efeitos sobre a colonização por Helicobacter pylori (Hp) de indivíduos Hp positivo. Os resultados indicaram que a ingestão regular do probiótico pode modular a colonização por H. pylori, sendo benéfica a microbiota intestinal de indivíduos Hp positivo. Interessantes resultados foram obtidos por Olivares et al. (2006), que avaliaram os efeitos de duas cepas de probióticos sobre o sistema imune de indivíduos adultos. Trata-se de um estudo randomizado, duplo-cego, ensaio clínico placebo controle que avaliou a atividade das cepas Lactobacillus gasseri (CECT 5715) e Lactobacillus coryuniformis (CECT 5711), as quais foram comparadas com um iogurte padrão. Foram recrutados 30 voluntários saudáveis (15 mulheres) com idade entre 23 a 43 anos. Foram coletadas amostras sanguíneas antes e após o período experimental e amostras de fezes foram coletadas semanalmente. O consumo dos produtos contendo as cepas e de iogurte promoveu o aumento das concentrações e da atividade de células fagocíticas, como monócitos e neutrófilos. Entretanto, quando combinados, as duas cepas promoveram o aumento das concentrações de células natural killer e IgA. Assim, as cepas testadas apresentaram melhores efeitos sobre o sistema imune, em relação ao padrão, sendo os efeitos maiores após duas semanas de tratamento. Liong e Shah (2005) investigaram as habilidades de remoção do colesterol de 11 cepas (Lactobacillus acidophilus e L. casei) para entender os possíveis mecanismos de ação. E concluíram que todas as 11 cepas apresentaram capacidades variadas para remover colesterol

19 19 in vitro, e propuseram como possíveis mecanismos de ação a assimilação do colesterol durante o crescimento, a incorporação do colesterol na membrana da célula e a ligação do colesterol na superfície da célula. As cepas L. casei ASCC 292 e L. acidophilus 4962 foram as que mais removeram o colesterol, indicando que estas cepas podem ser candidatas promissoras usadas como um suplemento dietético para abaixar o colesterol sérico in vivo. Greany et al. (2004) avaliaram o efeito dos probióticos Lactobacillus acidophilys e Bifidobacterium longum na melhora do efeito das isoflavonas de soja em reduzir os níveis séricos de lipídios sanguíneos. Participaram do estudo 37 mulheres que receberam tratamentos distintos: isolado de proteína de soja (com isoflavona), isolado de proteína do leite (sem isoflavona) e isolado de proteína de soja adicionado dos probióticos estudados (isoflavona + probióticos). Comparando-se o isolado de proteína de soja ao do leite, o feito das isoflavonas foi evidente, observando-se redução de 2,2% (p=0,02) e 3,5% (p=0,005) nos níveis de colesterol total e LDL, respectivamente e aumento de 4,2% (p=0,006) no nível de HDL. No entanto, o isolado de proteína de soja adicionado de probióticos não desempenhou nenhum efeito adicional sobre os níveis de colesterol total e frações LDL e HDL. O leite materno é essencial ao aleitamento de neonatos por favorecer o desenvolvimento intestinal de bifidobactérias que participam da prevenção de infecções e da modulação imune do indivíduo. Entretanto, o desenvolvimento de novas formulações infantis contendo agentes probióticos se faz necessário em virtude do aleitamento materno nem sempre ser possível (HUET et al., 2006). Entre os benefícios creditados aos produtos de laticínio probióticos incluem-se: promoção do crescimento, em estudos com ratos e aves; produção de vitaminas (riboflavina, niacina, tiamina, vitamina B6, vitamina B12, ácido fólico); aumento na absorção de minerais; aumento da resposta imune, pela elevação na produção de imunoglobulina A; diminuição da população de patógenos, através da produção de ácido acético e ácido láctico e de bacteriocinas; redução da intolerância à lactose; supressão de enzimas microbianas potencialmente prejudiciais, associadas com o câncer de cólon, em animais; estabilização da microbiota intestinal, especialmente após severos estresses intestinais ou uso de antibióticos; alívio da constipação; redução do colesterol sangüíneo; e efeito antimutagênico (SGARBIERI e PACHECO, 1999). De uma forma geral, Urgell et al. (2005) salientam que os principais usos e indicações dos probióticos em clínica e alimentação infantil são para a prevenção e tratamento de diarréias infecciosas; para a modulação do sistema imune; para o tratamento de intolerância à

20 20 lactose; para a síntese ou produção de subprodutos metabólicos com ação protetora intestinal, e para a promoção endógena de mecanismos protetores para dermatite atópica e alergia de alimentos. Tendo em vista tantos benefícios, a divulgação dos efeitos positivos dos probióticos é crucial. Segundo Reid e Hammond (2005), o conhecimento médico das provas clínicas do uso de probióticos vai ajudá-los a sentirem-se confortáveis a recomendar o uso de suplementos contendo probióticos. CONSIDERAÇÕES FINAIS A dieta é o foco para manter uma vida saudável diminuindo os riscos de desenvolvimento de doenças crônicas, como doenças gastrointestinais, cardiovasculares, câncer, osteoporose, bem como a promoção de uma velhice saudável. Atualmente, existe um forte apelo por alimentos saudáveis e a indústria alimentícia é a grande responsável para o desenvolvimento desses produtos. A maior conscientização dos consumidores faz com que a indústria voltada para o desenvolvimento de produtos com alegações de funcional cresça por todo o mundo. A definição de probióticos sugere que a segurança e a eficácia destes produtos devem ser demonstradas para cada cepa e cada produto. Cepas selecionadas, principalmente pertencentes aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium, são cada vez mais utilizadas como probióticos. Estudos recentes contribuíram para o conhecimento do mecanismo e do efeito dos probióticos na saúde. Estudos com humanos demonstram que cepas probióticas específicas, trazem benefícios na saúde da população humana. No entanto, os atuais probióticos não são selecionados para fins específicos, sendo necessários novos métodos para selecionar e caracterizar as cepas probióticas com alvos determinados. REFERÊNCIAS AMERICAN DIETETIC ASSOCIATION (ADA). Position of the American Dietetic Association: Functional Foods. Journal or American Dietetic Association, v. 104, n. 5, p , 2004.

21 21 ARAÚJO, E. A. Desenvolvimento e caracterização de queijo tipo Cottage adicionado de Lactobacillus Delbrueckii UFV H2b20 e de Inulina f. (Dissertação - Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, ARVOLA, T.; LAIHO, K.; TORKKELI, S.; MYKKANEN, H.; SALMINEN, S.; MAUNULA, L.; ISOLAURI, E. Prophylactic Lactobacillus GG Reduces Antibiotic- Associated Diarrhea in Children With Respiratory Infections: A Randomized Study. Pediatrics, v. 104; n. 5; p ; BARRENETXE, J.; ARANGUREN, P.; GRIJALBA, A.; MARTÍNEZ-PEÑUELA, J. M.; MARZO, F.; URDANETA, E. Modulación de la fisiología gastrointestinal mediante cepas prebióticas de Lactobacillus casei y Bifidobacterium bifidum. An. Sist. Sanit. Navar., vol 29, n. 3, p , BARRETO, G. P. M.; SILVA, N.; SILVA, E. D.; BOTELHO, L.; YIM, D. K.; ALMEIDA, C. G.; SABA, G. L. Quantificação de Lactobacillus acidophilus, Bifidobactérias e Bactérias Totais em Produtos Probióticos Comercializados no Brasil. Braz. J. Food Technol., v. 6, n. 1, p , jan./jun BIELECKA, M.; BIEDRZYCKA, E.; MAJKOWSKA, A. Selection of probiotics and prebiotics for synbiotics and confirmation of their in vivo effectiveness. Food Research International, Amsterdam, v. 35, n. 2/3, p , BLANCHETTE, L.; ROY, D.; BELANGER, G.; GAUTHIER, S. F. Production of cottage cheese using dressing fermented by bifidobacteria. Journal Dairy Science, Lancaster, v. 79, p. 8-15, BOTELHO, L. Isolamento e identificação de lactobacilos e bifidobacterias em alimentos probióticos disponíveis no mercado brasileiro, Campinas, Tese (Doutorado em Alimentos e Nutrição). Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução de Diretoria Colegiada (RDC) n. 02, de 07 de janeiro de Aprova o Regulamento Técnico de Substâncias Bioativas e Probióticos Isolados com Alegação de Propriedades Funcionas e ou de Saúde. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 9 jan Disponível em: < showact.php?id=9059 &Word=>. Aceso em: 01 set BRIZUELA, M. A.; SERRANO, P.; PEREZ, Y. Studies on probiotics properties of two lactobacillus strains. Braz. arch. biol. technol., v. 44, n. 1, p , 2001.