4. MATERIAL E MÉTODOS

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1 4. MATERIAL E MÉTODOS

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11 CARACTERIZAÇÃO ESPECTROSCÓPICA Espectrometria de Massa Acoplada a Cromatografia Gasosa (GC-MS) $)#)#%' ' ))%#$% ')) 0U/1 #)'- K)*# #%' $%'?% ,& %0*% ).,'1$5, ))' RU/E+,%$,&, $) ))) +,,#$*, #$% )$?#'%, % #,' % P( +,#%, ))' #'-,$'/ '0[$,)-)3(1)'B%))# #,$63 ))#%') ) "#S%) % )63 %' )' 0) U1 $5), +,# 'A8;I(J* % K)#)'-) )'#$:':#'%,$:)'?%)# U/-, 0;1 ':),)% #'?'# )-$- ' ) '2%%))U/A$)D)'','* %$.63% A8 C+, ;#$T$$ N$$''0',)*)),*41*+, #',5)4*)$%',, %')) %0W%' ))X1##))' #)'+,)63') )' %',- ), "%$' +,# ' $&'%*).', #' ' +,*2%;*%#$, '% '% +,)63) Espectrometria de Massa Acoplada a HPLC ) F/.5$ ))8 %%'5)#)#%' ' )) %#$ N 0N//: )#\1'' K) #)'-)% K)'-))),$')"# ').'), ))' N : 5, $, ) R)'% : )#\//I(EJ )%6K))', '),'$5) ) $:')9))%')# '%:$$R)'$I((JC,'$5))),')' #',), ': )#\>'#.,$5EL@-#5E(L* '(L*#'+,%((L@-#(L$ ' E

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13 4.2. SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS DA FAMÍLIA DOS PIRENOS SÍNTESE Éster de pentaclorofenol do ácido pirenobutírico (PyPCP) %$?,'$5#- ')'$)%% ),$' )?0, 2)1* "%)) '$-)%* )',*L,', ' F)&') \% 6/)# )',*.$3 * %#.,'&% 0\N*( µ $), * $%: : %$ 1 ))$- %$? 0# N* )'$1* % #'%$$ 0* <(E µ $)* B : %$ 1'.2 ))$- %$? )$,63),$''+,%'29' #', $,"0* L1%$' '%%$:"$%. 0*E µ $)* : %$ * )%.'#$# -51#- ' ))$- %$? *, -$, ''$( $," '#(,') #' %%$,)3 %63 '%'#% ' % 0*#$%))&$%$% '- $,)%' IS% * %D : %$)* )''* $ :* $%$CE *E #$%)$, &E"E% J%') ' : " % * )?-$:">%' <>E1 )', "%)) #)'$* )',%%$%E '$; = ),!'$,"# ),') #?) % '* ) #,') % #)63 -)#$- % (" %%$&%*F0#1 "%)) -#,63-$, %$? '2 9)%,0'-#^ L*).#))3,51*))$,63 %$? $- #'S)-5)%, )$,63 *F :?" )? )') )) +,)).)%)*, -5)#) ) M%* #),) %%)% N$ *F##%#' #'%$$)., #?.% ))?$ #) E

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17 SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA Cromatografias em coluna e em camada fina #,%63 2)' \ "%,'#% ' %$, 0)&$% $ /E ):* C):* C B* FH* 41###$ 2':7 /:"0 % $',*%, M ''E* % 1 %$, $,&# - 0',''$ '.'* $," )' ( #,'1 %, )', $,' :">%$? 0<>E1C %$:)%6K), )*% %\#,%$:)%6K)(/ *% -% # 0#$%))&$% $% '- $,)%'* " % * )?-$ :">%'<>E1#))3\0$,)%S%5,$1$ %$, ),* %M )%,*# $, 63 ) %, $M #4R( %#.,'&%* ), 2)' #'%$$* ), # ), # * #$%) +,')#?" )) E $%0E µ)$,63 µ $P 1*''* #$%))&$% $ 0IS% %D : %$)* )''* $ :* $% $ CE *E #$%)$, &E"E% J1 )#$%)*%%% $',%% % $,* $,&) )%'>%'0 > *-P-1% ' ))',* %") -)'+,)F$ )%) )', L#$,)),).)-) ) /.)%,, %M )%,*).$,5,$'/-$' (E *# %63$#)))#%'-) %:)$,)%') ),)#$%).,$5)%, )$,63* = %' 0#P-1 +,%) $' ' #$% +,% '!,)'# L* '2 #% ' %%%'&)'% '%63 ) ) # )0#7#,,) Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) %#.,'&%* ), 2)' #'%$$* ), # ), # 0%%# $ µ'':, %*#!%631 )#) #$: N (

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20 Estudo dos Espectros de Infra-Vermelho ) % #)') )',) 0 % #.,'&%* ), 2)' #'%$$* ), # ), # 1 %#) #)'$:). '#')))%#)'$:%': %%, 7%% #)'-$#%. ' #')) ) )#%') /- $:) )'), #$: D/ $ $E*% - '+,S%'E % / Estudo dos Espectros de Fluorescência ) )#%') $,)%S% ) % #)') )', 0 % #.,'&%* ), 2)' #'%$$* ), # ), # 1.')#))$,6K)+,': % )$-' )?-$ ) ',)# $) -) $,)%') ) %).$))')?-$#' 5#),'% #)63> = E/##$*=%''$ =,0-P-P-1 C $5))#%')% )$,6K)%%'63 # $P )?-$ )#%'$,& '* % / % 0#%'% )', ')* %:)'* F`* 41 $ #%'% <*,'$5 )),') %6K) "# ')>-$% - ' P)*- ') ))3 ' ; *%%63 $:.)* )$,63 * %%63')$M #%2$,$%)#$$)+,'5% * % #))?#'% (

21 4.3. DERIVADOS N-PIRENIL DE ANÁLOGOS DA CADEIA LATERAL DE ÁCIDOS BILIARES N-CONJUGADOS M.' "#))3 2% W$) % $'$ %).$)F/%!,)X)",)'- '.'%#&',$),$') )%,))30#' (1 #, )% #$'%$%63 +, ),) )%-*% )+,)'')#)F/%'$$%PE/'$ '$ F/'$%' P'$ *%,! )',', 2 $ 9 )',', ' %. E ) %).$) F/%!,) )),)#,'),63 0 )1 )')% #)'))'3)#&-)% %$ ' $-)' #,5 0a;; =* /$%: : %$ 1,))) +,$+, #,%63# PRIMEIRAS SÍNTESES DE AMIDAS FLUORESCENTES: SEGUIMENTO POR HPLC -63 ) ) ' 2) IE/'$ '$ 0E1 '$ 01J*%, "%)) $2)'0\1#'%$$ 01 % #.,'&% 0\N1* $, 9 63 % #.,'&% $-, $,)%' %63 2%,5, )$-' M% )%&-$%,*%, #+,##63 :?")?*;0 > *-P-1%9' #',.' F)# ))&')),'$5 %''$ 0, #,5W# NX1 % )$-'M% )%&-$%, C,'$5) )% '?) ')# $563 $))#% '$&+,$'#))30N1> '? D/$ '$ * % >,'/!%'.'50# #!%' '#$%% -$, )' µ1*..)% %) ))3)$-'* %#%# $563 ') %%'63,63 ' #* '%',$'/-$'% %#% (

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26 SEGUIMENTO DA FORMAÇÃO DE AMIDAS FLUORESCENTES A PARTIR DE AMINAS (2º PASSO DA REACÇÃO GLOBAL) Qualidade da água utilizada,,'$5 ') ) )) 2#,5# ) ) -), #$: $$# $$O 0$$# * * 41 #)' '#% ' Ω P% ))'S% (/##. %'7''$ M% 01,,'$5 ) "#S%)." )%') ) ##,5 #?# F) )',6K) +, #%, #'' -$ ),$') % )') '),'.")*,'$5 c, 8)'$ )'2$ 08d8, %$* E * S% E E8(1 $ ',) # ##6K) %S,'%)!%'-),):, *% %$5)). $$5)',2.%).)%'$+,$- )$ #$)#$'$$')*).' )5'C,) )#%$ )$,6K)#%!,')%') "#S%).'0% +,.' )'1 ' '')$563) $)) Lavagem do material a utilizar ).$K)-$, 2'%) ) %/%'),'$5) $-)*,$ '*% -5)),-$,,$$O*),) -5) ),-$, E/##$*),) -5)),-$, %''$ ))%)!%63E $-) *#$ )*(-$, ),$$O*(-$, )E/##$(-$, )%''$$- 2',#)E)%)%'), %# )'%#2 %)$-''2%.')))%)),'0).$:) 1%#2),!'.:,$')?%+,)#'S% " )#&-$F$2)%)$-' )%'))%))3)%)* %.%$-'* )', L Solução de marcador fluorescente ) /)( 2)' #'%$$ %#.,'&% 0\* )) $%,$ (*1 )%-%)':/)%,

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34 SEGUIMENTO POR ESPECTROMETRIA DE MASSA DA FORMAÇÃO DE AMINAS A PARTIR DE ANÁLOGOS AMIDA DOS ÁCIDOS BILIARES (1º PASSO DA DERIVAÇÃO) ))', 63 ))$)%$'$) %).$)*#,63% % #$"8N ( /NC NC* $5) -)))% )),')' #)%63>*E**<*E,') )') )),'$5 $ F/%'$$% 0C$,D <* $%:/ : %$*',)**41 )%$µ $P',.F ', )%$,-)%'' )'*'8N ( /NC % $"%))0E µ $) E µnc1*l,9' #',.'*',.)+,%': $ "'%')% )',.) %,) ' $:)% ' #)% -)' ' '$),!')9' #', L.:*,')' #)!%)*% '63,$%,')%63' # #-#63#)$-' %':2$9' #',.' "'%')% ))$- %''$, '$ ),!' )',#)#%' ' ))))#%'? '),'$5))3)%') #( CARACTERIZAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE MASSA DOS REAGENTES E PRODUTOS DO 2º PASSO DA REACÇÃO GLOBAL DE SÍNTESE ) % #)') %) )' '&',$ ),!') $) # )#%' ' )) ) )#%'? ') 0##$ 8\)' )* $) E(1,'$5)#)'- '%)63P563 )''#$%')#\'S)+,,#?$)% $)) )))* ).''$%'$ '% )'B $\)' 0-)3 1 )-) )#%') )).') +,) )#)'-P,'- K)* % ) %%'&)'%) ) -) % #)') $)) F $ '* %)%."&$%) $-))3 )',) '- )P ) #)'- )'))#%'? '))'- %#$)+,# ')N0$'* $1#)#63% '%)') % #)')!%',' '% )')*#%$,)..).)#.. ))?-) <

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36 #+,)63, )$P+,#)))%%'&)'%% #)' $) Amidas fluorescentes (produtos finais) de análogos da cadeia lateral dos ácidos biliares N-conjugados (2º passo da reacção global) ) ) $,)%') E/F/\ /F/\.') # %63% 2)' #'%$$ %#.,'&% 0\1 )',)$-'%'%''$>FN+,)*;0 > *-P-1)'),) ) 3")' % %$ ' )#&-)#$ +,'- +,) )',)#') )',)%%) +, )''5) ))$,6K),'$5)#%%'563#)#%' ' )) )'),) ) ##)!,)', %%'63 $' µp *9')#%'? ' )) Produtos secundários da reacção global descrita )#,'))%,)*#'%$$ 0*,#.',!'1%#.,'&%0\N1*")' % %$ ')#&-) 0 /$%:: %$1% &-)#,5),#);=#'' %$% #)),))#%') ))+,#,).)%*% ))#%').')#$)) )',)%%) 2)''&$%\N'% -) )',)%%) +, -#) # ' 9)%,* 9' #',.' %' 5' ))$-) '$# " 5 )$,.$ E/F\ $5 ' 3 )' )#&-$% %$ '* ) )) $%,$.)-2% #'&-$% ),'%63 ) )',)%%)))$,6K)#3 ##)!,)', %%'63 $' µp 9 ' )#%'? ' )) SEGUIMENTO DA FORMAÇÃO DOS PRODUTOS FINAIS DA REACÇÃO GLOBAL POR ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA ) %6K) )&') E/F\:.',$ '"%,'), )%$Eµ-$, ''$%%$)%)), -$, %% µ#%:'+,'5'2&-$ & #

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

40 4.4. DERIVADOS N-PIRENIL DE ÁCIDOS BILIARES N-CONJUGADOS SÍNTESE O primeiro passo da reacção global ))$,6K)#3 %).$) ##) '$ %%'63µ $P )%).$)F/%!,),'$5) +,)9 : %$*',)*)),*40%',$ /$%: : %$ 1 )') #,5- ';;; = $,) )') % #)')#)'- /) %,') )?% ) %).$) )2 β%!,)% % $% %. E ) ),')> $%%?$% 0U1* $%,))"%?$% 0U41* $%+,)"%?$% 0U1* $%)"%?$% 0U1 $%$'%?$%0U1 ) %).$) )2 β%!,)% %', %. E ) ),')> ',%?$% 01* ',,))"%?$% 041* ',+,)"%?$% 01* ',)"%?$% 01 ',$'%?$%01 C,'$5, %.$,#$ '%!, (/),$'/ $%$'%?$% +, 2%!,% % $% %. E ),$':"$ #)63(α 0U1 #3 ','$5, %.$ )2 β +, 3 #% ) )').$?%):, )*)''5 % %$5#$ $.%: 0H$$*$*41'/), #'#?" % %?$% +, 3 #)':"$ #)63(α*)' )' $2%,$"%' ',$")'% %$5 %.$$-*,%!,% ', )# % α*eαq:"/ β/ %$M% )')') %) # #)) %63 $.$ -$- ')S% )$,63%.$F/%!,*##% )%,% *#)%)%63-$, )') *- %%)':*% ' #% ' '$ 0,#$%* E/41

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