ÍNDICE. Resumo... Símbolos e Abreviaturas...

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1 xi ÍNDICE Pág. Agradecimentos... Resumo... Abstract... Símbolos e Abreviaturas... Índice... i iv vi viii xi PARTE I - INTRODUÇÃO 1- Considerações Teóricas 1.1- A Parede Celular das Plantas Definição e Importância Estrutura Composição da Parede Celular das Plantas Principais Componentes da Parede Celular Substâncias Pécticas Hemiceluloses Celulose Proteínas e Glicoproteínas Compostos Fenólicos Polímeros da Parede Celular de Tecidos Lenhificados a) Glucuronoxilanas b) Lenhina... 15

2 xii 1.3- Metodologia Aplicada ao Estudo das Paredes Celulares Preparação do Material das Paredes Celulares Extracção e Isolamento dos Componentes das Paredes Celulares a) Solubilização de Substâncias Pécticas b) Purificação de Substâncias Pécticas c) Solubilização de Hemiceluloses d) Purificação de Hemiceluloses A Azeitona Considerações Gerais Tipos de Estrutura Celular Métodos de Processamento Variações de Textura Durante o Amadurecimento Sumário e Âmbito do Trabalho PARTE II - MATERIAL E MÉTODOS 2- Procedimento Experimental 2.1- Azeitonas Utilizadas na Presente Investigação Equipamento... 33

3 xiii 2.3- Ensaios com Resíduos Insolúveis em Álcool Preparação do AIR Preparação de AIR's de Diferentes Camadas da Polpa Preparação do CWM a partir do AIR (AIR/PAW) Extracção Sequencial do AIR/PAW Preparação do CWM da Polpa Azeitonas em Fresco Azeitonas Processadas a) Verdes b) Pretas Extracção Sequencial do CWM Azeitonas em Fresco Azeitonas Processadas Tratamento de RC2 com Clorito / Ácido Acético Extracção do CWM com Água Quente Preparação dos Tecidos Lenhificados do Caroço Preparação do CWM (CWMst) Deslenhificação do CWMst Extracção Sequencial da Holocelulose Extracção de Lenhina do CWMst com 1,4-dioxano... 50

4 xiv Precipitação Gradual com Etanol Amostras Solúveis em Água Amostras Insolúveis em Água Cromatografia em Coluna Cromatografia de Troca Aniónica a) DEAE-Trisacryl M b) DEAE-Sephacel Cromatografia de Filtração em Gel a) Sephacryl b) Bio-Gel Fraccionamento de Glucuronoxilanas Utilização de Soluções de Cu (II) Variação do ph Hidrólise Ácida Parcial da Glucuronoxilana Tratamento de Complexos Xilana-Xiloglucana com Xilanase Determinação de Açúcares Método Colorimétrico Utilizando Fenol/Ácido Sulfúrico a) Adaptação do Método Colorimétrico às Fracções da Cromatografia em Coluna b) Amostras Ricas em Compostos Fenólicos Método Colorimétrico para Determinação de Ácido Urónico Acetatos de Alditol Adaptação do Método de Selvendran et al. (1979) Adaptação do Método de Blakeney et al. (1983)... 65

5 xv Análise por Metilação Adaptação do Método de Hakomori (1964) a) Preparação do Anião b) Formação de Alcóxidos e Reacção de Metilação c) Hidrólise, Redução e Acetilação Adaptação do Método de Ciucanu e Kerek (1984) a) Reacção de Metilação b) Hidrólise, Redução e Acetilação Redução de Grupos Carboxílicos Quantificação de Hidroxiprolina Análise da Proteína Total Espectroscopia de RMN Espectros de Absorção da Lenhina no Ultra-violeta PARTE III - RESULTADOS E DISCUSSÃO 3 - Isolamento e Análise dos Polímeros da Parede Celular da Polpa da Azeitona 3.1- Experiências Preliminares com o AIR, AIR/PAW e CWM Preparação do AIR Análise de Diferentes Camadas da Polpa Preparação do CWM a partir do AIR... 77

6 xvi Estudos Comparativos do CWM com o AIR/PAW Preparação do CWM Extracção Sequencial do CWM Extracções com CDTA e Na 2 CO Extracções com Soluções de KOH Extracções a partir de RC Fraccionamento dos Extractos Fraccionamento dos Extractos de CDTA e Na 2 CO Fraccionamento dos Extractos de KOH e Clorito Análise das Ligações Glicosídicas Metilação do CWM, AIR-1 e AIR Fracções Extraídas com CDTA e Na 2 CO a) Espectroscopia de RMN de 13 C das Fracções NC1 e NC Fracções Extraídas com 1M KOH a) Espectroscopia de RMN de 13 C da Xilana da Fracção K Fracções Extraídas com 4M KOH Fracções do Resíduo Rico em Celulose (RC1) Discussão Geral Estudo de Complexos da Parede Celular 4.1- Caracterização dos Polímeros do Extracto de SDS 0,5% Precipitação com Etanol Fraccionamento dos Polímeros Precipitados em 65% de Etanol

7 xvii Fraccionamento dos Polímeros Precipitados em 80% de Etanol Análise das Ligações Glicosídicas por Metilação Investigação Detalhada de Complexos Xilana-Xiloglucana Fraccionamento do Extracto de 1M KOH 1 C (Hemicelulose B) a) Precipitação com Etanol b) Fraccionamento por Cromatografia de Troca Aniónica c) Fraccionamento por Cromatografia de Exclusão em Gel Análise das Ligações Glicosídicas por Metilação Tratamentos com Xilanase a) Cromatografia de Exclusão em Gel de Sephacryl S b) Análise das Ligações Glicosídicas Discussão Geral Efeito do Processamento na Parede Celular da Azeitona 5.1- Preparação do CWM Azeitonas Processadas em Verde Azeitonas Processadas em Preto Efeito do Processamento na Preparação do CWM Extração Sequencial do CWM Azeitonas Processadas a) Azeitonas Processadas em Verde b) Azeitonas Processadas em Preto c) Efeito do Processamento na Extracção Sequencial do CWM Extracção do CWM de Azeitonas Frescas com Água Quente

8 xviii 5.3- Fraccionamento dos Extractos Fraccionamento de Extractos Ricos em Substâncias Pécticas a) Extractos de CDTA b) Extracto Obtido com Água Quente c) Extractos de 0,5% SDS Fraccionamento dos Extractos Ricos em Glucuronoxilanas Fraccionamento dos Extractos Ricos em Xiloglucanas a) Azeitonas Processadas em Verde b) Azeitonas Processadas em Preto Análise das Ligações Glicosídicas Substâncias Pécticas Glucuronoxilanas Discussão Geral Isolamento e Caracterização dos Polímeros das Paredes Celulares dos Tecidos Lenhificados do Caroço da Azeitona 6.1- Preparação do CWM Deslenhificação do CWMst Tratamento do CWMst com Clorito / Ácido Acético Tratamento do CWM com Dioxano:H 2 O:HCl Espectros de Absorção de Lenhina no Ultra-Violeta Extracção Sequencial da Holocelulose

9 xix 6.4- Fraccionamento dos Extractos Polímeros Solubilizados pelo Clorito Polímeros Solubilizados com 1,4-Dioxano Hemicelulose B da Fracção Extraída com 0,5M KOH Hemicelulose A das Fracções Extraídas com 0,5M e 1M KOH Análise das Ligações Glicosídicas Metilação do CWM e da Holocelulose Complexos Xilanas-Polissacarídeos Pécticos Glucuronoxilanas a) Hidrólise Ácida Parcial Fracções da α-celulose Discussão Geral Conclusões PARTE IV - BIBLIOGRAFIA