A proteína capsídica do vírus da imunodeficiência humano do tipo 1 (HIV-1) Juliana Reis Cortines, PhD
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- Maria Júlia Castanho Lemos
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1 A proteína capsídica do vírus da imunodeficiência humano do tipo 1 (HIV-1) Juliana Reis Cortines, PhD Rio de Janeiro 2012
2 1. Introdução 2. Objetivos 3. Resultados 4. CypA auxilia na montagem viral 5. Inibição da montagem in vitro de VLPs formadas pela CA 6. Papel do grampo β na montagem do capsídeo maduro do HIV-1 7. Aplicações gerais 8. Conclusão
3 Introduçã
4 Jardim do Éden Paraíso Terreno Inferno O Jardim das Delícias, Hyeronomus Bosch ( )
5 O Triunfo da Morte, 1562, por Pieter Brueghel ( )
6 Principais causas de óbito da Era Moderna % morte Fonte: The World Health Report
7 Epidemiologia da AIDS UNAIDS, 2010
8 AIDS no Brasil Total de brasileiros soropositivos: ~ ; 65% homens e 35% mulheres (dst.gov.br) Taxas de infecção e mortalidade têm diminuído ao longo dos anos; Brasil é um dos pioneiros no tratamento gratuito de pacientes HIV positivos. Dia Internacional da Luta Contra AIDS 1 o de dezembro de 2003 Brasília, D.F.
9
10 Histórico da AIDS casos de pneumonia provocada pelo fungo Pneumocystis carinii foram reportados pelo CDC em homossexuais da cidade de Los Angeles (CDC) Montagnier e colaboradores isolaram o Vírus Associado a Linfoadenopatia (LAV) de células de linfonodos de um paciente com linfoadenopatia e o caracterizaram como o agente etiológico da AIDS Gallo e colaboradores relacionaram HTLV-III à AIDS. Mais tarde, LAV e HTLV-III foram renomeados: passaram a ser chamados de Vírus da Imunodeficiência Humano (do tipo 1, HIV-1). De onde surgiu o HIV? Foi mostrado que, no caso do HIV-1 do tipo M, o reservatório natural de seu progenitor são os chimpanzés da subespécie Pan troglodytes troglodytes (Hahn et al., 2006).
11 Ciclo replicativo do HIV-1 último acesso: Dezembro,
12 Maturação do capsídeo viral VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANO Adamson & Jones, 2003 vonschwedler et al., Figura adaptada de Retroviruses, 1ª ed.,
13 O capsídeo maduro do HIV-1 Li et al., 2000
14 A proteína capsídica do HIV-1 (CA) N-terminal N-terminal C-terminal - C-terminal Região conectora Gamble et al., 1996
15 Formação do complexo CA:CypA Fase Recente Fase Tardia
16 Formação do complexo CA:CypA
17 Estrutura e Funções da Ciclofilina A (CypA) Funções fisiológicas descritas: Proteína ligadora de Ciclosporina A (CsA); Chaperone celular; Peptidil-prolil isomerase; Clivagem de ADN durante apoptose. Ciclosporina A
18 Objetivos
19 Objetivos Objetivo geral: Compreender o mecanismo de montagem viral do HIV-1. Objetivos específicos: Investigar a estabilidade do domínio C-terminal; Estudar o enovelamento da proteína capsídica e de seu mutante Δ 87-97; Determinar a estrutura em baixa resolução da proteína capsídica e de seu mutante; Estudar a estabilidade dos capsídeos formados in vitro; Investigar a função da CypA durante o ciclo replicativo do HIV-1; Estudar o papel do grampo β na montagem viral
20 Resultado
21 CypA auxilia na montagem viral
22 O mutante Δ87-97: indícios para a função da ciclofilina A?
23 O mutante Δ87-97: indícios para a função da ciclofilina A?
24 Inibição da agregação da proteína capsídica: ciclofilina A atuaria como chaperone? CA + CypA (~10:2) CA CA + CypA (~10:1)
25 O mutante Δ87-97: indícios para a função da ciclofilina A? Selvagem Mutante Selvagem Mutante
26 A CypA auxilia no controle da polimerização Selvagem Mutante Ganser-Pornillos et al., 2004
27 Inibição da montagem in vitro de VLPs formadas pela
28 Ensaios in vitro de formação de VLPs do HIV µm CA 1 M NaCl ph 8,0 25 o C Adaptado de Lanman e cols., 2001 Adaptado de Ganser et al., 1997
29 Efeito do bis-ans sobre as VLPs formadas in vitro Controle 5 µm 10 µm [Bis-ANS]
30 Efeito do bis-ans sobre as VLPs formadas in vitro 2 µm 5 µm 7,5 µm 10 µm
31 Estudos prévios utilizando bis-ans Proteína Razão [bis]/[ptn] Referências Bacteriófago P22 9,5 Teschke et al., 1993 VSV 0,025 Bonafe et al., 2000 Hepatite B 1 Zlotnick et al., 2002 Prion 5 Cordeiro et al., 2004 Peptídeo β-amilóide 8 Ferrão-Gonzales et al., 2005 HIV VLPs 0,025 Cortines et al.
32 Modelo de inibição da montagem viral Lanman e cols., 2003
33 Modelo de inibição da montagem viral Lys70 Trp184
34 Papel do grampo β na montagem do capsídeo maduro do
35
36 A proteína casídica do HIV e o vírus Cortines et al., 2011
37 Perguntas e formas de encntrar respostas Estratégia utilizada = gerar mutações na região do grampo beta no domínio N-terminal de CA Substituição do grampo por uma sequencia de aminoácidos distintas mas com estrutura de tridimensional de grampo beta (N-MLV); Deleção da Pro1 para romper a ponte salina. I2V para clivagem de metionina. Mutação do grampo por resíduos sequências de Gly-Ser;
38 Modelo do capsídeo do HIV Cortines et al., 2011
39 História da espectrometria de massas Big Bang Theory
40 Íons Um íon é um átomo ou molécula em que o número total de elétrons não é igual ao número total de prótons, dando origem a uma carga líquida positiva ou negativa.
41 Íons são cruciais para a espectrometria de massas O espectrômetro de massas mede m/z, onde m=massa e z=carga. Como a carga do íon é conhecida, fica fácil calcular a massa da molécula sendo analisada. O espectrômetro de massas é a menor balança do mundo devido aos compostos aos quais é capaz de determinar a massa molecular.
42 As proteínas são capazes de formar hetero-oligômeros Cortines et al.,
43 Troca de hidrogênio deutério (HDX) Images/BMC/ LARGE_ jpg
44 HDX de partículas montadas in vitro e digeridas com tripsina
45 Aplicaçõe s
46 Desenho racional de drogas Os alvos normalmente escolhidos devem ser essenciais APENAS para o patógeno. Proteínas estruturais; Enzimas. Rinovírus tipo 16 ligado à uma droga da classe WIN Protease do HIV-1 ligado ao Ritonavir
47 CA e a nanotecnologia
48 Conclusã
49 Conclusão A ciclofilina pode atuar como um guardião de polimerização do capsídeo do HIV-1; A polimerização das VLPs pode ser completamente inibida pelo composto hidrofóbico bis-ans, provavelmente devido a ruptura de uma estrutura extremamente organizada ou a inibição de formação das subunidades formadoras das VLPs. O grampo β é essencial para a manutenção da conformação madura do capsídeo do HIV-1, como observado por troca de hidrgênio/ deutério e espectrometria de massas. A proteína capsídica possui similaridade com proteínas desenhadas sinteticamente para produção de biosensores e vetores genéticos. Suas características de polimerização em macrocomplexos simétricos podem ser utilizados para os mesmos fins em um futuro próximo.
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