UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

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1 UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS LUCIANA MARIA CORTEZ MARCOLINO AVALIAÇÃO DE FTALOCIANINA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA POR TERAPIA FOTODINÂMICA: ESTUDO IN VITRO São José dos Campos SP 2012

2 LUCIANA MARIA CORTEZ MARCOLINO AVALIAÇÃO DE FTALOCIANINA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA POR TERAPIA FOTODINÂMICA: ESTUDO IN VITRO Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Orientadora: Profa. Dra. Josane Mittmann São José dos Campos, SP 2012

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4 LUCIANA MARIA CORTEZ MARCOLINO AVALIAÇÃO DE FTALOCIANINA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA POR TERAPIA FOTODINÂMICA ESTUDO IN VITRO Dissertação de Mestrado aprovada como requisito parcial à obtenção de grau de Mestre em Ciências Biológicas, do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora: Presidente: Profa. Dra. Juliana Ferreira (UNIVAP) Orientadora: Profa. Dra. Josane Mittmann (UNIVAP) Membro Externo: Profa. Dra. Claudia Barbosa Ladeira de Campos (UNIFESP) Professora Dra Sandra Maria Fonseca da Costa Diretora do IP&D- UNIVAP São José dos Campos, 20 de Dezembro de 2012.

5 Dedico esse trabalho: A minha família: Minha Mãe, Bene, pelo apoio em todos os momentos; Meu Pai, José (in memorian), que tanto me incentivou. A meu esposo, pelo incentivo, compreensão e apoio. A meus filhos, Raphael, Lucas e Felipe, que muitas vezes nem entendiam o que estava acontecendo.

6 Agradecimentos Agradeço a Deus pelo dom da vida e pela oportunidade de realizar essa etapa da minha vida. A minha orientadora, Profa. Dra. Josane Mittmann, por toda atenção, paciência, incentivo, cuidado e créditos concedidos, me fazendo mergulhar um novo mundo de conhecimentos e descobertas. Obrigada pela amizade, compreensão e apoio nas horas mais difíceis. Ao Prof. Dr. Marco Antônio de Oliveira, pela paciência e amizade. A Profa. Juliana Ferreira, que disponibilizou seus equipamentos para o desenvolvimento desse trabalho. Ao Professor Dr. Milton Beltrame Junior por disponibilizar a ftalocianina utilizada no desenvolvimento do trabalho.. A Professora Dra. Cristina Pacheco Soares e Professor Dr. Newton Soares da Silva pela contribuição e parceria durante o desenvolvimento desse trabalho. Aos amigos que fiz durante essa etapa, a tantos que enfrentaram os mesmos desafios. A toda conversa, sorrisos e silêncios. Agradecimento especial àqueles que me ajudaram no trabalho e que souberam me ouvir quando precisei: Mariana, Juliana, Emanoel, Paulo Cesar (PC). A todos aqueles que de certa forma contribuíram para a confecção deste trabalho e de mais uma etapa importante da minha vida. A todos os funcionários da UNIVAP, pelo comprometimento e dedicação. D. Ivone, D. Neusa, Valeria, Rubia. A Universidade do Vale do Paraíba pela bolsa de fomento, sem a qual não conseguiria iniciar e concluir esse projeto.

7 AVALIAÇÃO DE FTALOCIANINA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA POR TERAPIA FOTODINÂMICA ESTUDO IN VITRO RESUMO A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença infecciosa, não contagiosa e endêmica no Brasil, causada por protozoários do gênero Leishmania. A LTA é caracterizada por lesões cutâneas ou mucocutâneas ulcerosas, indolores, únicas ou múltiplas. A infecção é caracterizada pelo parasitismo de células do sistema fagocítico mononuclear, como monócitos e macrófagos. Entre os diversos tratamentos empregados destaca-se a Quimioterapia Fotodinâmica (QTFD) que vem sendo estudada como uma alternativa para o tratamento de LTA. O objetivo deste trabalho foi testar in vitro o efeito da QTFD na viabilidade de promastigotas de Leishmania amazonensis (M2269) e nas células J774 não infectadas, utilizando a silício bis(dimetilaminopropanoxi)-ftalocianina (PcSi) como fotossensibilizador (FS). Foram realizados testes isolados com as duas células citadas para determinar a concentração ideal para o tratamento de QFTD na infecção de células J774 com Leishmania amazonensis. Nos ensaios de citotoxicidade promastigotas metacíclicos e as células J774 foram incubadas com FS nas concentrações de 0,1 µm; 0,5 µm; 1,0 µm; 1,5 µm; 5,0 µm; 10,0 µm; 20,0 µm por uma hora ao abrigo de luz. Em seguida irradiados a 10 J/cm 2 no comprimento de onda de 660 nm. Os experimentos foram realizados em triplicata em três experimentos independentes. Os grupos teste foram divididos em: Grupo Controle: que não recebeu nenhum tratamento; Grupo Luz: foi irradiado, sem receber o fotossensibilizador; Grupo fotossensibilizador (FS): grupo que recebeu apenas o fotossensibilizador; Grupo QTFD: grupo que foi incubado com o fotossensibilizador e posteriormente irradiado. A viabilidade foi avaliada após 18 horas da aplicação da QTFD através do teste de MTT. Podese observar nos resultados que a PcSi foi tóxica para os promastigotas, mesmo sem a aplicação da luz, mas não para as J774. Após os testes foram determinadas as concentrações de 0,1 µm e 1,5 µm para a avaliação morfométrica das Leishmanias e a viabilidade das células J774 infectadas com L. amazonensis, por apresentarem uma diferença significativa. No teste de infecção, utilizando a concentração de 0,1 µm e tratadas com QFTD observou-se que as células J774 infectadas com as Leishmanias apresentaram a viabilidade maior em torno de 80%, já as células J774 não infectadas a viabilidade foi de 57%. Na concentração 1,5 µm a viabilidade foi menor, mas também apresentou essa diferença entre as J774 não infectadas, em torno de 5% de viabilidade enquanto as J774 infectadas com os parasitos apresentaram viabilidade de 22%. Essa característica pode estar relacionada com a ativação do mecanismo de defesa que as Leishmanias exercem quando em contato com as células fagocíticas. Na avaliação morfométrica das Leishmanias pode-se verificar alterações significativas nas células tratadas com FS e com QFTD quando comparados com os seus respectivos controles. Esses resultados sugerem que a PcSi é um fotossensibilizador em potencial para o tratamento de LTA por QFTD, pois não foi tóxica para as células do sistema fagocítico quando administradas na ausência de luz. Palavras-chaves: Leishmania, ftalocianina, QFDT, interação, viabilidade

8 PHTHALOCYANINE EVALUATION FOR TREATMENT BY CUTANEOUS LEISHMANIASIS PHOTODYNAMIC THERAPY - STUDY IN VITRO ABSTRACT The American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) is an infectious and no contagious disease endemic in Brazil caused by protozoa of the Leishmanias genus. The LTA is characterized by single or multiple painless skin lesions, ulceratives or mucocutaneous. The infection is characterized by parasitism of mononuclear phagocytic cells, such as monocytes and macrophages. Among the various treatments employed the photodynamic chemotherapy (PDTC) has been studied as an alternative for the treatment of ACL. The aim of this study was to test in vitro effect of the PDTC in Leishmania amazonensis (M2269) and uninfected J774 cells viability using silicon bis (dimetilaminoetanoxi)-phthalocyanine (PCSI) as a photosensitizer (PS). Tests were conducted with both mentioned cells isolated to determine the optimal concentration for PDTC treatment of infected J774. In cytotoxicity assays metacyclic promastigotes and J774 cells were incubated with FS at concentrations of 0.1 µm, 0.5 µm, 1.0 µm, 1.5 µm, 5.0 µm, 10.0 µm, 20.0 µm for an hour at dark. Then irradiated with 10 J/cm2 at a wavelength of 660 nm. The experiments were performed in triplicate in three independent experiments. The study groups were divided into: control group: received no treatment; Light Group: was irradiated without receiving the photosensitizer; Group photosensitizer (PS): a group that received only the photosensitizer; PDTC Group: a group that was incubated with the photosensitizer and thereafter irradiated. Viability was assessed by MTT assay 18 hours after application of PDTC. Was possible determine by the results that PcSi was toxic to promastigotes even when treated at dark but the same was not observed with the macrophages. After the tests was chosen the concentrations of 0,1 and 1,5 to perform morphometric evaluation and viability of J774 cells infected with L. amazonensis because they present significant difference compared with other concentrations. In the infection test using 0,1uM and treated with PDTC was observed that J774 cells infected with Leismania presented viability around 80% while in uninfected J774 cells viability was 57%. To the 1,5 um concentration viability was 5% to uninfected cells and 22% to infected cells. This caracteristic could be related with defense mechanisms triggered by Leishmania when infected phagocytic cells. In morphometric evaluation was possible to see significative alterations in cells that received treatment with PS and PDTC when compared with control groups. These results suggest thas PcSi is a promissing photosensitizer to PDTC treatment for ACL because was no toxic to phagocitic cells when tested at dark. Keywords: Leishmania, phthalocyanine, PDT, interaction, viability

9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Formas de desenvolvimento de Leishmania. N- núcleo, K - cinetoplasto MT mitocôndria única, F flagelo, FP - bolsa flagelar Figura 2. Ciclo Biológico de protozoário do gênero Leishmania Figura 3. Distribuição da Leishmaniose Tegumentar Americana nos últimos anos no Brasil: densidade de casos de LT por município (média de e casos em 2007) Figura 4. Número de casos de Leishmaniose Tegumentar Americana no Brasil entre os anos de 1991 a Figura 5. Lesões causadas por Leishmania; A - Forma cutânea localizada; B Forma mucocutânea; C- Forma cutânea difusa Figura 6. Rota de formação das espécies reativas de Oxigênio. Diagrama de Jablonski simplificado Figura 7. Estrutura molecular (A) e espectro de aborção (B) da Silício bis(dimetilaminopropanoxi)-ftalocianina PsCi Figura 8. Equação para avaliar a viabilidade celular Figura 9. Atividade mitocondrial de L. amazonensis após QFTD avaliada através do método de MTT. Os símbolos indicam as diferenças estatísticas significativas entre os grupos para p<0, Figura 10. Atividade mitocondrial de J774 após QFTD avaliada através do método de MTT. Os símbolos indicam as diferenças estatísticas significativas entre os grupos para p<0, Figura 11. Atividade mitocondrial após QFTD avaliada através do método de MTT de J774 não infectada e J774 infectada com L. amazonensis, utilizando FS na concentração de 0,1 µm. Os símbolos indicam as diferenças estatísticas significativas entre os grupos para p<0, Figura 12. Atividade mitocondrial após QFTD avaliada através do método de MTT de J774 não infectadas e J774 infectada com L. amazonensis, utilizando FS na concentração de 1,5 µm. Os símbolos indicam as diferenças estatísticas significativas entre os grupos para p< Figura 13. Análise morfológica de promastigotas pós-tratamento. As células, coradas com May Grunwald e Giemsa, observadas e fotografadas utilizando câmera LEICA DFC425 acoplada ao Microscópio DM2500 LEICA. A controle; B FS a 0,1 µm; C FS a 1,5 µm; D luz a 1,5 µm Figura 14. Células J774 não infetadas e infectadas com L. amazonensis coradas com May Grunwald e Giemsa, foram observadas e fotografadas utilizando câmera LEICA DFC425 acoplada ao Microscópio DM2500 LEICA. A- CONTROLE; B- FS 0,1 µm; C- FS 1,5 µm; D- 10 J/cm²; E- QF... 46

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Relação das espécies descritas no Brasil e o local de ocorrência Tabela 2 Análise morfométrica de L. amazonensis. As medidas foram realizadas através do programa ImageJ 7. Os símbolos indicam as diferenças estatísticas significativas entre os grupos para p<0,05 (ANOVA test.). L.C comprimento do corpo; LF comprimento flagelo; IN distância entre a inserção do flagelo ao núcleo; IK distância entre a inserção do flagelo ao cinetoplasto; distância entre o cinetoplasto e o núcleo; largura do corpo

11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO OBJETIVO GERAL Objetivos Específicos REVISÃO BIBLIOGRÁFICA LEISHMANIA CICLO DE VIDA MECANISMO DE INFECÇÃO LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA (LTA) TRATAMENTOS QUIMIOTERAPIA FOTODINÂMICA E FOTOSSENSIBILIZADOR MATERIAIS E MÉTODOS PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL CULTIVO DOS PARASITOS CULTURA DAS LINHAGENS J FOTOSENSIBILIZADOR - SILÍCIO BIS(DIMETILAMINOPROPANOXI)-FTALOCIANINA ENSAIO DE FOTOTOXICIDADE ANÁLISE DA TOXICIDADE APÓS APLICAÇÃO DA QUIMIOTERAPIA FOTODINÂMICA (QFTD) ANÁLISE MORFOMÉTRICA DOS PROMASTIGOTAS APÓS APLICAÇÃO DA QUIMIOTERAPIA FOTODINÂMICA (QFTD) AVALIAÇÃO DA FOTOTOXICIDADE CONTRA FORMAS AMASTIGOTAS INTRACELULARES DE LEISHMANIA AMAZONENSIS ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS VIABILIDADE CELULAR DE PROMASTIGOTAS DE LEISHMANIA AMAZONENSIS VIABILIDADE CELULAR DA LINHAGEM J ATIVIDADE FOTOTÓXICA DA PSCI EM CÉLULAS J744 NÃO INFECTADAS E INFECTADAS COM L. AMAZONENSIS Viabilidade de J744 infectadas com L. amazonensis tratadas com fotossensibilizador nas concentrações 0,1 µm e 1,5 µm ANÁLISE MORFOMÉTRICA DE L. AMAZONENSIS APÓS TRATAMENTO COM PCSI ANÁLISE MORFOLÓGICA DA LINHAGEM CELULAR J774 NÃO INFECTADA E INFECTADA APÓS TRATAMENTO COM PCSI

12 5 DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCENCIAS... 52

13 13 1 INTRODUÇÃO O gênero Leishmania pertence à ordem Kinetoplastida, família Trypanossomatidae e agrupa protozoários unicelulares, digenéticos. Esses protozoários apresentam duas formas durante o seu ciclo evolutivo: as promastigotas que são as formas extracelulares encontradas no tubo digestivo dos insetos vetores e as formas amastigotas que são obrigatoriamente intracelulares, que são encontradas, principalmente nos macrófagos da pele dos hospedeiros mamíferos. A fêmea do flebotomíneo, inseto vetor, é responsável pela transmissão para o vertebrado, que ao se alimentar introduz as formas promastigotas no local da picada sendo interiorizadas pelos macrófagos. A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é conhecida popularmente como Úlcera de Bauru, Ferida Brava ou Nariz de Tapir. As lesões se apresentam ulcerosas, indolores, únicas ou múltiplas. Há duas espécies, no Brasil, associadas à LTA e que representam maior gravidade no espectro clínico-imunológico são L. (V.) braziliensis responsável pela leishmaniose mucocutânea e a L. (L.) amazonensis responsável pela leishmaniose cutânea difusa. Foram relatados, segundo dados do Ministério da Saúde, casos de LTA em A LTA distribuí-se em todo território nacional devido a presença do vetor susceptível e do hospedeiro que são fatores determinantes para que haja ocorrência em uma determinada área. O tratamento da LTA preconizado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) é o uso do antimonial tártaro emético para. Porém, a droga apresenta algumas restrições para seu uso como, por exemplo, não deve ser utilizada em pacientes cardíacos e nem em mulheres grávidas, pois o antimônio pode provocar alterações eletrocardiográficas e também é abortivo. Não havendo resposta satisfatória com o tratamento pelo antimonial pentavalente, as drogas de segunda escolha são a anfotericina B e o isotionato de pentamidina. No entanto há alguns esquemas alternativos, preconizados pela Vigilância da Saúde, que podem ser citadas: - doses baixas ou elevadas de antimoniais pentavalentes, a associação do antimonial pentavalente a outros antileishmanicidas (como pentoxifilina, alopurinol, sulfato de aminosidina, sulfato de paramomicina).

14 14 Considerando as questões relacionadas aos efeitos colaterais e resistência de alguns isolados de Leishmania aos tratamentos convencionais novas terapias são necessárias. Dentre as novas possibilidades terapêuticas destaca-se a Terapia Fotodinâmica que envolve a administração de uma droga fotossensibilizante e sua ativação pela luz de comprimento de onda correspondente ao espectro de absorção do fotossensibilizador. Ela é frequentemente aplicada em tratamentos dermatológicos, (tumores cutâneos, acne, rejuvenescimento) e vem sendo proposta como uma alternativa promissora no tratamento da LTA. Os avanços alcançados nessa modalidade podem ser mais uma frente auxiliar de tratamento à leishmaniose tegumentar, com a vantagem de não ser agressiva como o tratamento convencional., de agir localmente, ser um procedimento não invasivo e capaz de tratamento de campo. O período de recuperação pode ser mais rápido e com excelentes resultados estéticos.. Esse trabalho possui o objetivo verificar o potencial de silício bis(dimetilaminopropanoxi)-ftalocianina como fotosensibilizante para uso em Quimioterapia Fotodinâmica, aplicada ao tratamento da Leishmaniose Tegumentar Americana.

15 Objetivo Geral O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito fototóxico in vitro da silício bis(dimetilaminopropanoxi)-ftalocianina como fotosensibilizador a fim de verificar o seu potencial para uso em Quimioterapia Fotodinâmica, aplicada ao tratamento da Leishmaniose Tegumentar Americana Objetivos Específicos Avaliar os efeitos fototóxicos silício bis(dimetilaminopropanoxi)-ftalocianina como fotosensibilizador em promastigotas de Leishmania amazonensis. Avaliar os efeitos fototóxicos silício bis(dimetilaminopropanoxi)-ftalocianina como fotosensibilizador em células J774. Avaliar os efeitos fototóxicos e a viabilidade celular de células infectadas com amastigotas, após QTFD.

16 16 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Leishmania O gênero Leishmania pertence à ordem Kinetoplastida, à família Trypanossomatidae e agrupam protozoários unicelulares, digenéticos, apresentando as formas promastigosta e amastigota (TANANKA et al., 2007; KÜCKELHAUS,. 2011). Podemos visualizar na figura 1 que em ambas as formas, há presença de uma mitocôndria, que possui um arranjo complexo de DNA, e é denominada cinetoplasto, característica da classe Kinetoplastida. Sua localização próxima à bolsa flagelar e as relativas posições destas duas estruturas é o principal modo de classificação dos diferentes estágios de ciclo de vida dos tripanossomatídeos (SOUZA et al., 1997; CAVALCANTI et al., 2008). Figura 1. Formas de desenvolvimento de Leishmania. N- núcleo, K - cinetoplasto MT mitocôndria única, F flagelo, FP - bolsa flagelar. Fonte: Adaptado de: Bastes (2006)

17 17 As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias que acometem o homem, causadas por várias espécies de protozoários do gênero Leishmania, transmitidos através da picada de flebótomos infectados (ROBBINS, et. al. 2000). Dependendo da espécie envolvida e da relação do parasita com seu hospedeiro, a doença pode apresentar diferentes formas clínicas, como forma crônica da pele, mucosas ou vísceras (GONTIJO, et. al. 2003; GRENFELL, et al., 2010). Nas Américas, atualmente são reconhecidas onze espécies de Leishmania que causam doença na pele ou mucosa humana. No Brasil, foram identificadas sete espécies, sendo seis do subgênero Viannia e uma do subgênero Leishmania (Tabela. 1) Tabela 1. Relação das espécies descritas no Brasil e o local de ocorrência Fonte: Brasil. Mistério da Saúde(2009)

18 Ciclo de Vida Protozoários do gênero Leishmania são organismos digenéticos, pois sofrem transições de desenvolvimento durante o seu ciclo infeccioso (SPATH, 2001), apresentando duas formas distintas em seu ciclo biológico (Figura 2): as promastigotas que são formas extracelulares móveis, alongadas, com flagelo superior ao comprimento do corpo. Estas são encontradas no tubo digestivo dos insetos vetores, que são os hospedeiros intermediários. As formas amastigotas que são obrigatoriamente intracelulares, sem flagelo livre, imóveis são encontradas, principalmente nos macrófagos da pele dos hospedeiros mamíferos (RODRIGUES et al., 2010). A infecção no inseto ocorre quando a fêmea do flebotomíneo realiza o repasto sanguíneo picando o vertebrado e juntamente com o sangue ingere macrófagos parasitados e amastigotas livres. Durante o trajeto pelo trato digestivo as amastigotas sofrem divisão binária e se transformam rapidamente em promastigotas, que continuam se multiplicando no sangue ingerido, que é envolvido em uma membrana peritrófica secretada pelas células do estômago do inseto. Após a digestão do sangue essa membrana se rompe e as formas promastigotas ficam livres (NEVES, 2005; SILVA-LOPES, 2010). Nessa etapa do ciclo há dois caminhos para o desenvolvimento, dependo da espécie. As formas promastigotas das espécies pertencentes ao subgênero Leishmania multiplicam-se livremente ou aderentes às paredes do estômago. Em seguida, ocorre migração dos flagelados para a região anterior do estômago onde se transformam em paramastigotas, colonizando no esôfago e na faringe. O tempo necessário para que o ciclo se complete varia entre três e cinco dias para diferentes espécies (NEVES, 2005) Com as Leishmanias bloqueando a probóscide do inseto, este tem dificuldade de se alimentar e, quando pica a pele do hospedeiro vertebrado regurgita os as promastigotas metacíclicos para o interior, inoculando-os no local da picada, ocorrendo assim a transmissão (SILVA-LÓPEZ, 2010). No homem a forma a flagelada encontra-se nos vacúolos digestivos de macrófagos. Dentro de quatro a oito horas dentro do vacúolo fagocitário, os parasitos se adaptam ao novo meio fisiológico e resistem à ação destruidora dos lisossomos e as formas promastigotas se transformam em amastigotas. Transição leva a mudanças bioquímicas, moleculares e morfológicas, as formas amastigotas multiplicam-se por divisão binária até ocupar todo o citoplasma e romper a membrana do macrófago, sendo assim liberadas no

19 19 tecido e fagocitadas novamente, iniciando uma reação inflamatória local (GONTIJO, CARVALHO, 2003). Figura 2. Ciclo Biológico de protozoário do gênero Leishmania. Fonte: Adaptado de: Laboratory (2009). 2.3 Mecanismo de Infecção Além de se multiplicarem até destruírem a célula hospedeira, as Leishmanias provocam um aumento considerável dos histiócitos, que, assim, passam a endocitar mais e mais parasitos, ampliando a extensão das células infectadas e das lesões leishmanióticas (REY, 2008; NEVES, 2005).

20 20 Os mecanismos de virulência da Leishmania ainda são estudados, entretanto Cortez et al. (2011) mostra em seus estudos que a L. amazonenses induz a expressão de CD200 que inibe a ativação de macrófagos locais. Outros estudos citam que a resposta contra uma infecção por Leishmania depende do sucesso que as células do sistema imunológico do hospedeiro exercem na ativação das células T, macrófagos mediadas por citocinas (BRACHELENTE et al., 2005). Se o individuo não tiver capacidade de produzir INF-γ e ativar os macr ófagos a Leishmania irá se disseminar e assumir uma das diferentes manifestações clínicas dependendo da espécie envolvida (ALEXANDER; BRYSON, 2005; MACHADO et al., 2004). Costa et al. (2011) defendem avanços nas pesquisas em imunologia para priorizar a investigação de uma abordagem mais eficiente frente a gravidade apresentada pelas doenças negligeniadas, como a leishmaniose. Em seus estudos apresentam várias situações onde a ação de anticorpos protegem os hospedeiros da infecção por Leishmania. Esse fato também é confirmado nos trabalhos de Bourdoiseau et al. (2009), que realizou testes com soro de cães vacinado contra L. infantum com antigeno LiESAp e inibiu a infecção in vitro em macrófagos por promastigotas e amastigotas. Como forma de previnir a infecção Albuquerque (2006) realizou estudos com culturas de macrófagos humanos expostos a hipóxia antes da infecção com L. amazonensis e pode demostrar a redução na porcentagem de células infectadas. Como frente a novas formas de controle de infecção os resultados de Cyrino (2011) indicam que a autofagia apresenta um papel importante na infecção causada por L. amazonensis e abre novas perspectivas para o estudo desse processo biológico durante a infecção de outras espécies de Leishmanias. 2.4 Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) representa um importante problema de saúde pública em muitas áreas tropicais e subtropicais do mundo. As estimativas são de que há 12 milhões de pessoas infectadas no mundo com casos notificados por ano (COMMITTEE WHO, 2010). Nos países da América Latina sua incidência é elevada, sendo o

21 21 Brasil o país de maior número de ocorrência notificada, com cerca de casos relatados entre 2003 a 2007 (ALVAR et al., 2012). Como o vetor está presente em todos os estados a LTA distribuí-se em todas as Unidades Federadas (Figura 3). Atualmente na região Norte representa 40% dos casos, seguida pelas regiões Nordeste com 31%, Centro-Oeste com 16%, Sudeste com 10% e Sul com 3% (MINISTERIO DA SAUDE, 2007). Figura 3. Distribuição da Leishmaniose Tegumentar Americana nos últimos anos no Brasil: densidade de casos de LT por município (média de e casos em 2007) Fonte: Brasil. Ministério da Saúde (2007) Segundo dados mais recentes do Ministério da Saúde em 2010 (Figura 4), foram relatados cerca de casos de LTA. A ocorrência dessa nosologia depende da presença do vetor e do hospedeiro susceptíveis (GONTIJO et al., 2004).

22 22 Figura 4. Número de casos de Leishmaniose Tegumentar Americana no Brasil entre os anos de 1991 a 2010 Número de casos Anos Fonte: adaptado de: Brasil. Ministério da Saúde (2011) A LTA é uma infecção é caracterizada pelo parasitismo das células do sistema fagocítico mononuclear (SFM) da derme e das mucosas do hospedeiro vertebrado (monócitos e macrófagos). As formas responsáveis pelas manifestações clínicas são as amastigotas, por isso este estágio do ciclo de vida do parasita são alvos de tratamentos quimioterápicos (GUPTA; GOYAL; RASTOGI, 2001). A manifestação da LTA é variada e está relacionada com a espécie envolvida e na reação do hospedeiro (LINDOSO et al., 2012). A LTA distingue-se por lesões ulcerosas, indolores, únicas ou múltiplas, forma cutâneo-mucosa que se caracterizada por lesões agressivas nas mucosas que afetam as regiões nasofaríngeas (Figura. 5). As principais lesões histopatológicas são infiltrados inflamatórios com predominância de células mononucleares, áreas de necrose, vasculites, reação granulomatosa e células gigantes tipo corpo estranho ou de Langhans, acantose e papilomatose nas margens da úlcera (PEREIRA et al., 2007). Além de possuir uma alta incidência e grande distribuição geográfica, é capaz de assumir formas que caracterizam diferentes tipos de lesões, como por exemplo, destrutivas, desfigurantes e isso causa grande repercussão no campo psicossocial do individuo afetado (CARVALHO, 2000; GONTIJO et al., 2003).

23 23 Figura 5. Lesões causadas por Leishmania; A - Forma cutânea localizada; B Forma mucocutânea; C- Forma cutânea difusa. Fonte: Brasil. Ministério da Saúde (2006) As duas espécies associadas a LTA e que representam maior gravidade no espectro clínico-imunológico no Brasil são L. (V.) braziliensis responsável pela leishmaniose mucocutânea e a L. (L.) amazonensis responsável pela leishmaniose cutânea difusa (SILVEIRA et al., 2008; 2009). Embora nesses casos possa haver poucos parasitas no tecido, há o desenvolvimento de lesão. Isto se deve ao fato da forte produção de resposta Th1 que leva a ocorrência de reação inflamatória intensa e danos ao tecido (MACHADO et al., 2004).

24 Tratamentos O espectro das lesões causadas pela LTA é amplo, isso faz com que o diagnóstico clínico para o tratamento não seja simples e imediato (GUEDES et al., 2008). Destaca-se a importância de se atualizar a base de dados epidemiológicos a fim de planejar estratégias apropriadas para o controle da leishmaniose (ALVAR et al., 2012). Para o tratamento da LTA é preconizado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) o uso do antimonial tártaro emético que foi introduzido pelo médico brasileiro Gaspar Viana, em 1912 e foi durante muito tempo a única forma de tratamento. É realizado com injeção de 17mg Sb 5+/kg peso/dia, durante dez dias, seguido de intervalo de dez dias e novamente uma série de 10 dias de tratamento. O número de séries varia de acordo com o processo de cura da lesão. A droga não deve ser utilizada em pacientes cardíacos e nem em mulheres grávidas, pois o antimônio pode provocar alterações eletrocardiográficas e também é abortivo. (RATH et. al. 2003). Segundo orientações do Ministério da Saúde (M.S.) há dois tipos de antimoniais pentavalentes que podem ser utilizados: o antimoniato de N-metil glucamina e o stibogluconato de sódio (esse último não comercializado no Brasil). Deve-se um cuidado maior para infecções nas mucosas, pois estas podem apresentar respostas mais lentas e com maior possibilidade de recidivas. Quando o sistema imunológico não apresenta resposta satisfatória com o tratamento por antimonial pentavalente, há necessidade de uso das drogas de segunda escolha, que são a anfotericina B e o isotionato de pentamidina. As lesões ulceradas podem sofrer contaminação secundária, razão pela qual devem ser prescritos cuidados locais, como limpeza com água e sabão e, se possível, compressas com permanganato de potássio (KMNO 4 ), com diluição de 1/5.000 ml de água morna (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009). No entanto há alguns esquemas alternativos, preconizados pelo Ministério da Saúde, que podem ser citadas: - doses baixas ou elevadas de antimoniais pentavalentes, a associação do antimonial pentavalente à outros antileishmanicidas (como pentoxifilina, alopurinol, sulfato de aminosidina, sulfato de paramomicina). Para que seja definido a cura do paciente o Ministerio da Saúde estabelece alguns critérios:

25 25 Forma cutânea o critério de cura é definido pela epitelização das lesões ulceradas, regressão total da infiltração e eritema, até 3 meses após a conclusão do esquema terapêutico. Entretanto, nos casos com evidência de cicatrização progressiva das lesões sem cumprir completamente com os critérios acima, sugere-se o prolongamento da observação até completar 6 meses. Forma mucosa o critério de cura é definido pela regressão de todos os sinais e comprovado pelo exame otorrinolaringológico, até 6 meses após a conclusão do esquema terapêutico. Na ausência do especialista, o clínico deve ser treinado para realizar, pelo menos, rinoscopia anterior e oroscopia. Nos locais onde não há clínico, o paciente deve ser encaminhado ao serviço de referência para avaliação de cura. (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009). O objetivo do Programa de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana (PV- LTA) é diagnosticar e tratar precocemente os casos detectados, visando reduzir as deformidades provocadas pela doença. 2.6 Quimioterapia Fotodinâmica e Fotossensibilizador A Terapia Fotodinâmica, usualmente aplicada em tratamentos dermatológicos, (tumores cutâneos, acne, rejuvenescimento) e também no tratamento de diversas doenças, vem sendo proposta como uma terapia alternativa promissora no tratamento da Leishmaniose Tegumentar Americana (SOHL et al., 2007). Em seus estudos Akilov e colaboradores (2007) sugerem que a aplicação de Terapia fotodinâmica no tratamento da Leishmaniose é uma terapia promissora, podendo ser utilizado como uma alternativa indireta de tratamento. A Quimioterapia Fotodinâmica (QTFD) parte do princípio de que a interação da luz de comprimento de onda adequado com um composto fotossensibilizante (FS). O FS é excitado pela luz, do estado fundamental para o estado singleto. Quando nesse estado excitado podo ocorrer um cruzamento intersistema, levando o FS ao estado tripleto, que apresenta menor energia que o singleto, mas apresenta maior tempo de vida. Quando volta ao estado fundamental o FS transfere sua energia para o Oxigênio singleto, gerando as espécies reativas de oxigênio por dois mecanismos distintos: reação Tipo I (quando ocorre transferência de elétron) ou Tipo II (Quando ocorre transferência de energia) (Figura 6). Estas espécies

26 26 reativas de oxigênio são capazes de produzir a inviabilidade das células (MACHADO, 2000; de ALBUQUERQUE, 2008; ISSA et al., 2010 ). Figura 6. Rota de formação das espécies reativas de Oxigênio. Diagrama de Jablonski simplificado Fonte: Castano, Demidova e Hamblin (2004) Os efeitos da QTFD in vitro têm sido alvo de muitos estudos, com diversos fotossensibilizantes em variadas concentrações e com a aplicação de diferentes parâmetros de luz, como intensidade da luz, comprimento de onda, potência (AKILOV et al., 2007a; 2007b). Os estudos realizados em pacientes voluntários demonstraram que a QFTD pode ser utilizada como uma alternativa altamente efetiva no tratamento da Leishmaniose Cutânea (ASILIAN et al., 2006). Os avanços alcançados indicam que a QTFD pode ser mais uma frente auxiliar de tratamento à leishmaniose tegumentar, com a vantagem de não ser agressiva como o tratamento convencional., de agir localmente, ser um procedimento não invasivo e capaz de tratamento de campo. O período de recuperação pode ser mais rápido e com excelentes resultados estéticos (LEE et al., 2011). O uso de QTFD e sua ação em dermatoses proliferativas têm sido estudados bem como os mecanismos de ação dos fotossensibilizadores. Ensaios em cultura de células permitem tentar entender os possíveis mecanismos envolvidos no processo de cicatrização e diminuição da lesão in vivo observando as alterações ocorridas em células submetidas à QTFD. Quanto melhor se conhecer os microrganismos

27 27 alvo, maiores as chances de se escolher um fotossensibilizador adequado (AKILOV et al., 2008). Algumas características são importantes para se escolher um agente fotossensibilizador (FS) a ser utilizado na QTFD: seletividade, afinidade, substância com estrutura química definida, solubilidade e estabilidade em água, fotossensibilidade, baixa toxicidade no escuro, metabolização rápida. Piette et al. (2003) cita que o FS precisa apresentar uma absorção espectral dentro da chamada janela terapêutica, (de 600 nm a 1100 nm), em que há maior penetração e ativação dos componentes cromóforos dos tecidos. As porfirinas identificadas há mais de 150 anos, foram durante muito tempo o fotossensibilizador bem estudado (NOWIS et al., 2005). Elas são compostos cíclicos formados por quatro unidades pirrol ligados por átomos de carbono, possui a característica de formar complexos com os íons metálicos ligados aos átomos de nitrogênio das unidades pirrol. As duplas ligações dos anéis pirrol nas porfirinas são responsáveis pela absorção e fluorescência características desses compostos (MURRAY et al., 1998). A partir da década de 60 um novo composto FS começou a ser empregado, o derivado de hematoporfirina obtido a partir da purificação da hematoporfirina (ISSA et al., 2010), tendo como primeiro FS para uso clínico o Photofrin (NOWIS et al., 2005). Outros FS vem sendo estudados, como por exemplo o o ácido 5-aminolevulínico (ALA), precursor da precursor da protoporfirina. Foi relatado nos estudos de Evangelou et al. (2011) o sucesso no tratamento com ALA em um paciente de 69 anos no tratamento de leishmaniose tegumentar. Também é apresentada na literatura a utilização do azul de metileno (AM). O AM é uma molécula que tem desempenhado importante papel em microbiologia e farmacologia. É muito conhecido como corante histológico e usado há muitos anos. Dentre as pesquisas sobre o seu uso inclui-se a malária e a esquisofrenia, sendo que já em 1891 o AM foi empregado com sucesso no tratamento da malária (WAINWRIGHT, 2005). Possui uma afinidade pela mitocôndria e esta seletividade pode ser determinada pela lipofílicidade e pela carga, que se for positiva é atraída devido ao ambiente eletroquímico negativo da matriz mitocondrial (GABRIELLI et al., 2004). O AM possui a vantagem de ser barato e absorver na região de luz vermelha dentro da janela terapêutica também produz espécies reativas de oxigênio, sendo utilizado na terapia fotodinâmica. (STERNBERG et al., 1996; STERNBERG et al.,1998).

28 28 Peloi et al. (2011) e Sbeghen et al mostraram em seus estudos a ação fotodinâmica do AM obtendo bons resultados para tratamento de LTA. Entre os novos fotossensibilizadores estudados atualmente estão as ftalocianinas que são moléculas análogas às porfirinas. São corantes sintéticos, conhecidas como fotossensibilizadores de segunda geração e são lipofílicas, o que influencia em sua localização em membranas plasmáticas, microssomos e mitocôndrias (ALEXANDRATOU; YOVA; LOUKAS, 2005; TOMAZINI, 2007). As moléculas ftalocianinas possuem uma forte absorção na faixa de espectro de luz no vermelho entre nm (HOPPER, 2000; MARGARONE et al., 1996), isso confere a elas elevada ação fototerapêutica, favorecendo a utilização de doses menores, demonstrando um agente fotossensível em potencial (MACHADO, 2000). Uma das desvantagens da utilização das ftalocianinas consiste na sua tendência em participar da agregação de processos dependentes de um íon metal central o que faz com esta droga tenha baixa solubilidade em meios biológicos aquosos, entretanto as ftalocianinas hidrossolúveis têm se mostrado mais eficientes que os derivados de porfirinas (JUZENAS et al., 2004; NUNES et al., 2004). As ftalocianinas, que são moléculas cuja sua estrutura molecular pode ser modificada, permitindo ampla manipulação (MAREE, et al., 2001) a partir de ligantes periféricos e /ou centrais, permitem que sua síntese apresente características desejadas (COOK et al., 1994; JORI, 1996), compensando a desvantagem apresentada acima. Há algumas organelas que possuem carga de elétrons e locus que permitem a ligação do FS, como a membrana plasmática e membrana mitocondrial., constituindo alvos para o FS. Alterações produzidas nas mitrocôndrias comprometem a viabilidade celular o que é desejado em terapia fotodinâmica (ALBUQUERQUE, 2008). Estudos realizados in vitro e in vivo confirmam a eficácia da quimioterapia fotodinâmica e sugerem que é uma possível terapia a ser utilizada no tratamento da leishmaniose tegumentar (DUTTA et al., 2005; AKILOV et al., 2006a, 2006b; ENK et al., 2003). Devido à facilidade de cultivo, as formas promastigotas são largamente utilizadas para a avaliação de compostos in vitro. Por se tratar de um parasito intracelular a avaliação do potencial leishmanicida in vitro contra a forma intracelular é o modelo mais próximo do animal sem requerer a utilização do mesmo (DUTTA et al., 2005; AKILOV et al., 2006a, 2006b; ENK et al., 2003).

29 29 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Procedimento Experimental Os experimentos para a aplicação da terapia fotodinâmica foram realizados em modelo in vitro no Laboratório de Parasitologia e Biotecnologia e em parceria com o Laboratório de Imunologia da Universidade do Vale do Paraíba. Os procedimentos foram realizados de maneira asséptica em fluxo laminar. 3.2 Cultivo dos parasitos Os parasitos Leishmania amazonensis cepa M2269, gentilmente cedidos pela Dra. Ângela Cruz (FMRP-USP) foram cultivados e mantidos em meio LIT ph 7,4 suplementado com 5% de Soro Bovino Fetal., 2,5 μg/ml de hemina 2% de urina contendo 10 U/mL de penicilina e 10μg/mL estreptomicina e mantidas a 26 o C. Os repiques para a manutenção dos promastigotas foram realizados semanalmente durante a fase logarítmica de crescimento. 3.3 Cultura das linhagens J774 Os macrófagos da linhagem J774, gentilmente cedidos pela Profa. Dra. Cristina Pacheco (Laboratório de Cultura de Células-UNIVAP), foram descongelados e cultivados em garrafas de cultura de 25 cm 2 em meio RPMI (GIBCO), suplementado com 5% Soro Fetal Bovino, e

30 30 10 U/mL de penicilina e 10 μg/ml estreptomicina, mantido em estufa de crescimento à 36ºC em atmosfera com 5% de CO 2, trocando o meio sempre que necessário. Quando o número de células atingia quase todo o fundo da garrafa de cultura, as células eram raspadas com espalhador de células (scraper), em seguida adicionadas em tubo tipo falcon e centrifugadas a 25ºC a 5000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante era descartado e o sedimento ressuspendido em 10 ml de meio completo e distribuído em duas garrafas de cultura estéreis. 3.4 Fotosensibilizador - Silício bis(dimetilaminopropanoxi)-ftalocianina A Silício bis(dimetilaminopropanoxi)-ftalocianina PsCi proposta para esse estudo foi sintetizada pelo grupo de Biomoléculas e Catálise do Laboratório de Síntese Orgânica coordenado pelo Dr. Milton Beltrame Junior. A PcSi previamente preparada foi dissolvida em DMSO em soluções estoque de 1 mm e 0,1 mm e armazenadas a 4º C protegida da luz em tubo de ensaio de vidro. O Espectro de absorção foi obtido através de Espectrofotômetro UV (CARY 50 BIO), apresentada na figura 7.

31 31 Figura 7. Estrutura molecular (A) e espectro de aborção (B) da Silício bis(dimetilaminopropanoxi)-ftalocianina PsCi Fonte: Dados fornecidos pelo Laboratório de Síntese Orgânica, IP&D Prof. Milton Beltrame Jr. 3.5 Ensaio de fototoxicidade A toxicidade da PcSi foi testada, nas formas promastigotas e nas células J774, em concentrações de 0,1 μm; 0,5 μm; 1,0 μm ; 1,5 μm ;5,0 μm ; 10,0 μm e 20,0 μm a fim de determinar a concentração ideal da substância para os testes em amastigotas intracelulares.

32 32 Para o teste utilizou-se o fotossensibilizador nas concentrações acima, diluídas em meio de cultura, próprio de cada cultura celular, sem Soro Fetal Bovino. As células foram incubadas com o FS por um período de 1 hora, na ausência da luz, conforme padronizado nos trabalhos de Pinto (2011a). Os experimentos foram realizados em triplicata e repetidos três vezes. Os grupos teste foram divididos em: Grupo Controle: que não recebeu nenhum tratamento Grupo Luz: foi irradiado, sem receber o fotossensibilizador. Grupo fotossensibilizador (FS): grupo que recebeu apenas o fotossensibilizador. Grupo QTFD: grupo que foi incubado com o fotossensibilizador e posteriormente irradiado. Após o tratamento, segundo a divisão dos grupos, as placas com as células foram centrifugadas, o sobrenadante desprezado e adicionados meio completo para incubação por 18 horas. Em seguida seguiu-se o procedimento de análise de viabilidade, com o teste de MTT. Para o grupo QTFD utilizou-se solução incolor (Tyrode) e o equipamento para a irradição foi BioTable, que consiste de Equipamento para Iluminação LEDs 660 nm (Vermelho) - produzido pela empresa Biopdi - Industria e Comércio de Equipamentos Médicos e Odontológicos LTDA. O aparelho possui uma placa com 54 LEDs que emitem luz vermelha específica para a ativação do fotossensibilizador na Terapia Fotodinâmica. As células foram irradiadas no comprimento de onda visível de 660 nm nas densidades de energia de 10 J/cm 2, na potência de 25mW/cm 2 por um tempo de sete minutos. O tempo de incubação como o FS e de irradiação foi previamente devidos conforme trabalho de Pinto (2011a). 3.6 Análise da toxicidade após aplicação da Quimioterapia Fotodinâmica (QFTD) A viabilidade celular dos promastigotas, da linhagens J774 infectadas e não infectadas foram avaliados através da atividade mitocondrial pelo teste de MTT. O teste do MTT (HANSEN et al., 1989), é uma analise colorimétrica baseada na conversão do sal de tetrazolium (sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium) em cristais de formazan, pelas desidrogenases (enzimas oxirredudases) presentes

33 33 nas mitocondrias de células vivas. Os cristais de formazan acumulam-se dentro da célula e após solubilização no solvente dimetilsulfóxido (DMSO) pode ser quantificado em espectrofotômetro do tipo ELISA λ ( = 490 nm), pois poss íveis alterações na atividade mitocondrial das células resultam em mudanças na quantidade de cristais de formazam produzido e sua absorbância. Para determinação dos parâmetros do MTT para as células promastigotas foram testadas variações de tempo de incubação, diluição do MTT em diferentes soluções como PBS, meio de cultura LIT (Liver Infusion Triptose), solução Tyrode (para 1,0 L composto de NaCl 20%, KCl 10%, CaCl 2 10%, MgCl 2 10%, NaH 2 PO 4 10%, 2 g de Bicarbonato e 2 g de Glicose) e diferentes concentrações e volumes: o primeiro teste utilizou-se 20 µl de MTT na concentração de 5 mg/ml diluído em 180 µl de LIT e também em 180 µl de PBS (solução tampão de fosfato); o segundo teste diluiu-se 40 µl do MTT na concentração de 5 mg/ml em 160 µl de LIT, em 160 µl de Tyrode e 160 µl de PBS. Nos dois testes acima citado, as células foram incubados em estufa a 26 o C por 4 horas. No terceiro teste utilizou-se 200 µl do MTT na concentração de 0,5 mg/ml diluído em PBS e as células foram incubadas em estufas a 26 o C por mais 2 horas. Depois de determinado os melhores parâmetros iniciaram-se os testes. Após 18 horas da aplicação da luz, as placas contendo as culturas foram centrifugadas a rpm por 10 minutos, o sobrenadante removido e adicionado 200 μl de MTT, na concentra ção de 0,5 mg/ml, em cada poço. As células foram incubadas em estufas a 26 o C por 2 horas no escuro. Após a incubação, as placas com as culturas foram centrifugadas a rpm por 10 minutos o sobrenadante foi removido e adicionado 100 μl de DMSO. Foi realizada a leitura em leitor de ELISA - SpectraCount, modelo BS10001 da Packard, com o filtro de 540 nm. A porcentagem de atividade mitocondrial foi determinada pela utilização da equação (Figura 8), onde o grupo controle corresponde às células que não receberam nenhum tratamento e equivalem a 100% de viabilidade, e o valor do branco corresponde à absorbância apenas do DMSO utilizado para diluir as outras amostras. Figura 8. Equação para avaliar a viabilidade celular Células tratadas - branco X 100 Controle - branco

34 Análise morfométrica dos promastigotas após aplicação da Quimioterapia Fotodinâmica (QFTD) Após a aplicação da QTFD, foi realizado um esfregaço, deixou-se secar e a preparação foi corada com May Grunwald (Sigma-Aldrich) e Giemsa (NewProv Produtos para Laboratório). As células foram observadas e fotografadas utilizando câmera LEICA DFC425 acoplada ao Microscópio DM2500 LEICA. O ensaio foi realizado em triplicata a análise biométrica dos parasitas foi realizada através do programa ImageJ 7, onde foram medidos os parâmetros: comprimento do corpo (CC), comprimento do flagelo (CF), distância entre a inserção do flagelo e núcleo (IFN), distância entre a inserção do flagelo e cinetoplasto (IFK), distância entre cinetoplasto e núcleo (KN) e largura do corpo (LC). 3.8 Avaliação da fototoxicidade contra formas amastigotas intracelulares de Leishmania amazonensis Para esse teste foram utilizadas as concentrações selecionadas anteriormente de 0,1 µm e 1,5 µm, sendo duas placas com células, uma tratada apenas com FS e outra onde foi realizada a QFTD. As células J774 foram aderidas em lamínulas dentro de placas de 24 poços a uma concentração final de 1x 10 5 células por poço, 24 horas após a adesão e crescimento nas lamínulas as células foram infectadas com promastigotas em fase metacíclica infectante usando a proporção de 10 parasitas por células. As células foram incubadas em estufa a 37ºC com 5 % de CO 2 segundo os protocolos de Souza (2006) e Silva (2008). Após o período de incubação as células receberam o tratamento de QFTD. As lamínulas com as células infectadas e não infectadas foram removidas após 18 horas de incubação. A preparação fixada com metanol e corada com Giemsa de acordo com as instruções do fabricante NewProv Produtos para Laboratório. As células foram observadas e fotografadas utilizando câmera LEICA DFC425 acoplada ao Microscópio DM2500 LEICA. O ensaio foi realizado em triplicata com 2 repetições.

35 Análise estatística As diferenças das médias entre os tratamentos foram analisadas através da análise de variância (ANOVA). Valores de P<0,05- considerados indicativos de significância, no programa GraphPad Prism 5.

36 36 4 RESULTADOS 4.1 Viabilidade celular de promastigotas de Leishmania amazonensis Os ensaios de viabilidade celular de promastigotas de Leishmania amazonensis após a aplicação da QTFDA demonstraram que houve redução da viabilidade celular dos parasitos nas concentrações testadas quando comparados os grupos tratados com o controle conforme verificado na figura 9. Os dados apresentados sugerem que a PcSi no escuro é tóxica para os promastigotas, pois a viabilidade das células foi reduzida em 70%; na concentração de 0,1 µm, em 81% na concentração de 0,5 µm em49% na concentração de 1,0 µm, em 74% na concentração de 5,0 µm em 76%na concentração de 10 µm, em 84% na concentração de 20 µm. Pode-se observar uma diferença estatisticamente significativa (p<0,05) na viabilidade nos promastigotas nessas concentrações em relação ao grupo controle. Os grupos que receberam o FS na concentração de 1,5 µm não apresentaram diferença estatística significativa em relação ao controle, sua viabilidade foi de 62%. Porém pode-se notar uma diferença estatística significativa entre este grupo e todos os grupos que receberem a irradiação após serem incubados com FS. O grupo exposto apenas à luz apresentou aumento significativo da viabilidade celular, sugerindo um aumento na atividade mitocondrial., mostrando que a luz exerceu estímulo sobre a célula. Em todos os grupos que receberam a QTFD a viabilidade celular foi reduzida e apresentaram diferença estatisticamente significativa (p<0,05) em relação ao controle, sendo os seguintes valores de redução para cada uma das concentrações: 0,1 µm reduziu em 88%; 0,5 µm reduziu em 93%; 1,0 µm reduziu em 90%; 1,5 µm reduziu em 88%; 5,0 µm reduziu em 89%, 10 µm reduziu em 88% e 20 µm reduziu em 91%.

37 37 Figura 9Atividade mitocondrial de L. amazonensis após QFTD avaliada através do método de MTT. Os símbolos indicam as diferenças estatísticas significativas entre os grupos para p<0, Viabilidade celular da linhagem J744 Foi necessário avaliar a citotoxicidade em macrófagos não infectados a fim de determinar quais as concentrações de fotossensibilizador seriam mais adequadas para os ensaios de interação entre J774 e leishmania, uma vez que são células alvos destes parasitos em vertebrados. Os testes de citotoxicidade do fotossensibilizador e os efeitos da QFTD, foram realizados utilizando os mesmos parâmetros utilizados para as formas promastigotas e os resultados podem ser verificados na figura 10. Diferente dos resultados apresentados nos testes realizados com as formas promastigotas, os resultados obtidos com a linhagem celular J774 demostraram que a toxicidade da fatalocianina é baixa para este tipo de célula, pois não houveram diferenças estatísticas