UNIVERSIDADE DE SANTO AMARO MESTRADO EM IMPLANTODONTIA

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1 UNIVERSIDADE DE SANTO AMARO MESTRADO EM IMPLANTODONTIA LEANDRO DE LUCCA ESTUDO HISTOLÓGICO DA REGENERAÇÃO ÓSSEA GUIADA COM MEMBRANA DE POLIPROPILENO EM CALVÁRIA DE COELHOS SÃO PAULO 2010

2 LEANDRO DE LUCCA ESTUDO HISTOLÓGICO DA REGENERAÇÃO ÓSSEA GUIADA COM MEMBRANA DE POLIPROPILENO EM CALVÁRIA DE COELHOS Dissertação apresentada ao Curso de Pós- Graduação da Faculdade de Odontologia da Universidade de Santo Amaro, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Odontologia, área de concentração em Implantodontia, sob a orientação do Prof. Dr. Ilan Weinfeld. SÃO PAULO 2010

3 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Milton Soldani Afonso Campus I De Lucca, Leandro D439e Estudo histológico da regeneração óssea guiada com membrana de polipropileno em calvária de coelhos / Leandro De Lucca. Orientação do Prof. Dr. Ilan Weinfeld -- São Paulo: p. Dissertação (Mestrado). Área de Concentração em Implantodontia. Curso de Odontologia. Universidade de Santo Amaro. 1. Coelhos 2. Membranas 3. Polipropilenos 4.Regeneração Óssea I. Título II. Orientador

4 ESTUDO HISTOLÓGICO DA REGENERAÇÃO ÓSSEA GUIADA COM MEMBRANA DE POLIPROPILENO EM CALVÁRIA DE COELHOS LEANDRO DE LUCCA Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia da Universidade de Santo Amaro, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Odontologia, área de concentração em Implantodontia, sob a orientação do Prof. Dr. Ilan Weinfeld. Aprovado em: / / Banca examinadora Prof. Dr. Ilan Weinfeld Universidade de Santo Amaro Prof. Dr. João Ferreira Santos Jr. Universidade de Santo Amaro Prof. Dr. Cláudio Luiz Sendyk Universidade de São Paulo

5 Ao meu pai, Plinio, pelo exemplo de vida, em quem sempre me espelhei, e que me possibilitou ser o que sou hoje, minha eterna gratidão. A minha mãe, Sonia, por todos os cuidados dispensados em toda minha vida, intra e extra-uterina. Obrigado pela dedicação, carinho e esforço na minha educação. A minha esposa Carla, pelo amor, ajuda, compreensão e paciência nos momentos de ausência durantes esses dois anos. A Manuela, minha linda filha, que chegou bem no meio dessa jornada, sendo mais um motivo para eu melhorar cada vez mais. Ao meu tio Antonio, por me mostrar, mesmo agora que sua presença física não é sentida, que tudo que estudamos não é em vão. Dedico este trabalho.

6 Agradeço a Deus, por ter me dado sabedoria, uma família maravilhosa e força para superar este obstáculo. Aos meus sogros, Manoel e Idalina, por toda a ajuda dispensada durante esse caminho. Ao meu amigo e compadre Márcio, por ter colocado mais este desafio na minha frente. Ao prof. Dr. Ilan Weinfeld, pela orientação segura no desenvolvimento deste trabalho, por acreditar na minha capacidade e abrir novos caminhos para minha formação intelectual e científica. Ao Prof. Dr. Wilson Roberto Sendyk, pelo conhecimento proporcionado na especialidade da Implantodontia. Ao Prof. Me. Guilherme Durante, pela excelente e indispensável colaboração nas análises histológicas. Ao prof. Dr. Neil Ferreira, pela colaboração na análise estatística. Aos colegas de curso e agora amigos, Cristiane, Cristiano e Julio, pela colaboração nas cirurgias dos coelhos; e a todos os colegas de curso: Alex, Carlos Eduardo, Luciano, Marcelo, Marcio, Mario, Robson e Ulisses, pelos conhecimentos compartilhados e ótimo ambiente de trabalho. Ao prof. Munir Salomão, por me mostrar algo novo, e, principalmente, pelo conhecimento compartilhado.

7 Ao prof. Dr. José Tadeu Tesseroli de Siqueira, por sempre responder meus s com ótimas orientações. À Empresa INP, São Paulo, Brasil, pelo material cedido nas cirurgias dos coelhos.

8 O sucesso normalmente contempla aqueles que estão ocupados demais para procurar por ele. Henry David Thoreau.

9 RESUMO Um dos grandes desafios da Implantodontia é o tratamento de reabsorções alveolares e a manutenção do rebordo alveolar pós-exodontia para instalação de implantes e posterior reabilitação funcional e estética dos pacientes. Várias técnicas cirúrgicas e biomateriais têm sido desenvolvidos para auxiliar na reparação do tecido ósseo danificado, bem como a utilização de membranas, que servem como barreiras biológicas. A barreira de polipropileno (PP), conhecida comercialmente como Bone Heal, é uma membrana não-reabsorvível, que foi introduzida há pouco tempo no mercado, como uma alternativa à membrana de politetrafluoretileno (PTFE). A ausência de um trabalho científico que pudesse elucidar o processo de reparação óssea frente à utilização deste novo produto motivou-nos a essa pesquisa. Estudamos histologicamente o processo de reparação em defeitos confeccionados em calvária de 16 coelhos, recobertos (grupo teste) ou não (grupo controle) com membrana de polipropileno, usada como barreira, sendo a lesão preenchida apenas com coágulo sanguíneo do próprio animal, avaliados aos 21 e 42 dias. Os resultados evidenciaram em ambos os grupos o mesmo padrão de resposta inflamatória, contudo o grupo teste apresentou menor invasão de tecido conjuntivo fibroso e precoce processo de osteogênese comparado ao grupo controle. Assim a membrana de polipropileno apresentou-se como um material biocompatível e capaz de promover regeneração óssea guiada (ROG). Palavras-chave: Coelhos. Membranas. Polipropilenos (PP). Regeneração Óssea.

10 ABSTRACT One of the great challenges of dental implants is the alveolar resorption treatment and the maintenance of the alveolar ridge after tooth extractions for implant placement and subsequent aesthetic and functional patients` rehabilitation. Several surgical techniques and biomaterials have been developed to assist in the regeneration of damaged bone tissue, and the use of membranes that serve as biological barriers. The barrier polypropylene (PP), commercially known as Bone Heal is a non-resorbable membrane, which was introduced recently in the market as an alternative to the polytetrafluoertilene (PTFE) membrane. The absence of a scientific work that could elucidate the process of bone repair forward to using this new product led us to this research. Therefore, we studied histologically the repair process in calvarial defects prepared in 16 rabbits, covered (test group) or not (control group) with polypropylene membrane, used as a barrier, estimated at 21 and 42 days. The results in both groups showed the same pattern of inflammatory response, yet the test group showed lower invasion of fibrous connective tissue and faster osteogenesis. Thus, the polypropylene membrane appeared as a biocompatible material able to promote guided bone regeneration (GBR). Key words: Rabbits. Membranes. Polypropylene (PP). Bone Regeneration.

11 LISTA DE SIGLAS BMPs - CAF - COBEA - DFDBA - d-ptfe - e-ptfe - GBR - PEG - PLLA - PP - PTFE - ROG - RTG - Proteínas morfogenéticas óssea Alginato de cálcio Colégio Brasileiro de Experimentação Animal Enxerto ósseo desmineralizado liofilizado Politetrafluoretileno denso Politetrafluoretileno expandido Guided Bone Regeneration Polietileno glicol Poli (L-ácido láctico) Polipropileno Politetrafluoertileno Regeneração Óssea Guiada Regeneração Tecidual Guiada

12 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Grupo Teste (21 dias). Análise semiquantitativa do defeito ósseo recoberto com membrana de polipropileno em calvária de coelhos...49 Tabela 2. Grupo Teste (42 dias). Análise semiquantitativa do defeito ósseo recoberto com membrana de polipropileno em calvária de coelhos...49 Tabela 3. Grupo Controle (21 dias). Análise semiquantitativa do defeito ósseo sem recobrimento com membrana em calvária de coelhos Tabela 4. Grupo Controle (42 dias). Análise semiquantitativa do defeito ósseo sem recobrimento com membrana em calvária de coelhos Tabela 5. Grupo Controle subdividido em dois grupos: grupo Controle de 21 dias de reparação (C21) e grupo Controle de 42 dias de reparação (C42) Tabela 6. Grupo Teste subdividido em dois grupos: grupo Teste de 21 dias de reparação (T21) e grupo Teste de 42 dias de reparação (T42)...69 Tabela 7. Análise da reação inflamatória nos grupos controle e teste com 21 e 42 dias...70 Tabela 8. Análise da intensidade da reação inflamatória nos grupos controle e teste com 21 dias...70 Tabela 9. Análise da intensidade da reação inflamatória nos grupos controle e teste com 42 dias...70 Tabela 10. Análise da linha cimentante nos grupos controle e teste com 21 e 42 dias Tabela 11. Análise da intensidade da linha cimentante nos grupos controle e teste com 21 dias...71 Tabela 12. Análise da intensidade da linha cimentante nos grupos controle e teste com 42 dias...71 Tabela 13. Análise do tecido fibroso nos grupos controle e teste com 21 e 42 dias. 72 Tabela 14. Análise da intensidade do tecido fibroso nos grupos controle e teste com 21 dias...72 Tabela 15. Análise da intensidade do tecido fibroso nos grupos controle e teste com 42 dias...72 Tabela 16. Análise do tecido osteóide nos grupos controle e teste com 21 e 42 dias Tabela 17. Análise da intensidade do tecido osteóide nos grupos controle e teste com 21 dias...73

13 Tabela 18. Análise da intensidade do tecido osteóide nos grupos controle e teste com 42 dias...73 Tabela 19. Análise do tecido hematopoiético nos grupos controle e teste com 21 e 42 dias...74 Tabela 20. Análise da intensidade do tecido hematopoiético nos grupos controle e teste com 21 dias Tabela 21. Análise da intensidade do tecido hematopoiético nos grupos controle e teste com 42 dias Tabela 22. Análise do tecido ósseo trabecular nos grupos controle e teste com 21 e 42 dias...75 Tabela 23. Análise da intensidade do tecido ósseo trabecular nos grupos controle e teste com 21 dias Tabela 24. Análise da intensidade do tecido trabecular nos grupos controle e teste com 42 dias...75 Tabela 25. Análise do tecido osso cortical nos grupos controle e teste com 21 e 42 dias...76 Tabela 26. Análise da intensidade do tecido osso cortical nos grupos controle e teste com 21 dias...76 Tabela 27. Análise da intensidade do tecido osso cortical nos grupos controle e teste com 42 dias...76

14 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Ilustração 1. Especificações da membrana regenerativa Bone Heal...27 Ilustração 2. Forma de apresentação da membrana de polipropileno acondicionada num tubo estéril...27 Ilustração 3. Membrana Bone Heal Ilustração 4. Tricotomia na região da calvária, onde será feita a intervenção...29 Ilustração 5. Incisão do plano cutâneo para acesso à calvária Ilustração 6. Divulsão dos tecidos da pele, muscular e subcutâneo e descolamento periosteal até exposição dos ossos parietais direito e esquerdo...30 Ilustração 7. Osteotomia com trefina para demarcação da região da confecção do defeito ósseo Ilustração 8. Cavidades defeito e teste devidamente demarcadas em largura Ilustração 9. Ostectomia com broca diamantada esférica n 8 em profundidade, dentro da largura demarcada com trefina, sem expor a dura-mater Ilustração 10. Cavidades confeccionadas e utilizadas como defeito teste e controle preparadas através de osteotomia parietal bilateral...32 Ilustração 11. Defeito teste recoberto com membrana de polipropileno afixada com tachinhas e defeito controle descoberto...32 Ilustração 12. Sutura contínua do plano cutâneo com fio de nylon Ilustração 13. Momento da reabertura após 42 dias e início da remoção da membrana Ilustração 14. Aspecto do defeito teste no momento de remoção da membrana...34 Ilustração 15. Osteotomia com trefina de 13mm para remoção da área do defeito..35 Ilustração 16. Remoção cuidadosa da região da amostra Ilustração 17. Aspecto macroscópico da amostra removida para estudo histológico Ilustração 18. Observação da pequena espessura da calvária na amostra removida Ilustração 19. Aspecto macroscópico da calvária após a eutanásia: a membrana estava bem colocada em todas as amostras sem interposição de tecido entre a barreira e a área do defeito....39

15 Ilustração 20. Diferença macroscópica da reparação óssea nas regiões dos defeitos teste (T) e controle (C), evidenciada principalmente com 42 dias de reparação...40 Ilustração 21. Grupo Controle 21 dias: HE 50x Ilustração 22. Grupo Controle 21 dias: Tricômico de Mallory 200x. Osso cortical...41 Ilustração 23. Grupo Controle 42 dias: Tricômico de Mallory - 200x. Osso Esponjoso Ilustração 24. Grupo Controle 42 dias: Tricômico de Mallory 200x. Osso Cortical..43 Ilustração 25. Grupo Controle 42 dias: HE 100x. Osso Cortical e Esponjoso Ilustração 26. Grupo Controle 42 dias: Tricômico de Mallory 100x Ilustração 27. Grupo Teste 21 dias: HE 100x...45 Ilustração 28. Grupo Teste 21 dias: Tricômico de Mallory 200x. Osso cortical Ilustração 29. Grupo Teste 42 dias: Tricômico de Mallory 200x. Osso Esponjoso..47 Ilustração 30. Grupo Teste 42 dias: Tricômico de Mallory 400x. Osso Cortical Ilustração 31. Grupo Teste 42 dias: HE 100x. Osso Cortical e Esponjoso...48 Ilustração 32. Grupo Tese 42 dias: Tricômico de Mallory 100x...48

16 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA PROPOSIÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS Membrana de polipropileno (BONE HEAL, Sistema INP, São Paulo, Brasil) Procedimento Cirúrgico Eutanásia Remoção das Amostras Análise histológica Análise Estatística Avaliação histológica Análise Estatística Resultados DISCUSSÃO CONCLUSÕES...59 REFERÊNCIAS...60 ANEXOS...66

17 13 1 INTRODUÇÃO A regeneração é uma das áreas de grande importância na Medicina e na Odontologia e com grandes perspectivas para a humanidade. Toda a estrutura da vida está baseada na capacidade do organismo de se regenerar, e o processo de senilidade nada mais é do que a redução lenta e gradual dessa capacidade. Apesar dos avanços tecnológicos alcançados, ainda há muito para conhecer nessa área. A ortopedia na Medicina bem como a periodontia, a cirurgia buco-maxilofacial e a implantodontia na Odontologia são ciências que, além de suas particularidades, preocupam-se com o tratamento de diversos tipos de defeitos ósseos que acometem os indivíduos. Nesse contexto, a reabilitação de pacientes com reabsorção óssea alveolar severa é um dos principais desafios da moderna implantodontia. Esta, empregando implantes osseointegrados, vem utilizando com sucesso os princípios da regeneração óssea guiada (ROG), que, baseada na técnica de regeneração tecidual guiada (RTG), implica na exclusão dos tecidos não desejáveis localizados na região onde se quer formar um tecido específico. Para tanto, faz-se uso de uma barreira física que impede a proliferação de fibroblastos nos defeitos ósseos, os quais poderiam dificultar a osteogênese. Entende-se por regeneração, a substituição do tecido perdido por um tecido igual morfológica e funcionalmente. Na Odontologia, quando se esgota a possibilidade de manutenção do elemento dental e esse deve ser extraído, surge uma preocupação quanto à manutenção do rebordo alveolar, tanto em altura como em espessura, pois esse é um fator crucial na excelência do tratamento com implante. No esteio dessas possibilidades e novidades tecnológicas, o politetrafluoretileno (PTFE), conhecido comercialmente como Teflon, tem sido tradicionalmente utilizado como barreira na RTG, em especial devido às suas características de excelência, como a neutralidade química e a biocompatibilidade. Entretanto, não se trata da única possibilidade, uma vez que outros materiais têm mostrado êxito para a ROG, como o polipropileno (PP), com o qual se produz uma

18 14 membrana não-reabsorvível, há pouco tempo lançada no mercado e que poderia permanecer exposta ao meio bucal. Assim, tem sido proposta a utilização com uma técnica específica nas exodontias para a manutenção do rebordo alveolar em sítios que irão receber implantes, sem, necessariamente, a combinação de enxertia óssea. A ausência de um trabalho científico que pudesse elucidar o processo de reparação óssea frente à utilização deste novo produto motivou essa pesquisa.

19 15 2 REVISÃO DA LITERATURA No início da história da osseointegração, a prioridade era instalar os implantes onde houvesse osso disponível. A técnica visava, em primeiro lugar, a estabilidade primária do implante para uma reabilitação primordialmente funcional. Estudos subsequentes preocuparam-se com uma reabilitação oral mais ampla, a fim de reconstituir não apenas os dentes ausentes, mas também a estrutura óssea perdida, necessária tanto como suporte na colocação dos implantes como para a sustentação de tecidos moles, restaurando a dimensão vertical perdida e permitindo um posicionamento ideal dos implantes, com reabilitação tanto estética como funcional (ANDRADE-ACEVEDO et al, 2004). O bom desempenho dos implantes osseointegrados propiciou o desenvolvimento de técnicas que possibilitassem a colocação destes nas áreas consideradas inapropriadas, ou seja, técnicas para aumentar a largura e a altura óssea. Entre essas técnicas, pode-se mencionar a utilização de biomateriais (enxertos e membranas para Regeneração Tecidual Guiada e Regeneração Óssea Guiada), elevação do seio maxilar, enxertos tipo onlay e inlay, uso de fatores de crescimento e proteínas morfogenéticas do osso (BMPs) e distração osteogênica. (ANDRADE-ACEVEDO et al, 2004). Os trabalhos pioneiros de RTG que utilizaram o princípio do isolamento anatômico de um determinado tecido para favorecer o crescimento de outro tiveram início nos anos 50. Em 1956, Cambbell e Bassett, descreveram a aplicação clínica de barreiras físicas, utilizando filtros laboratoriais no tratamento cirúrgico de lesões em nervos periféricos, isolando as extremidades lesadas e formando um túnel para se evitar a formação de neuromas. Murray et al (1957) criaram defeitos ósseos em osso ilíaco de cães e protegeram o coágulo com uma membrana plástica perfurada; constataram que houve o preenchimento ósseo no fêmur, ílio e coluna espinhal, sem a utilização de enxerto, concluindo que há a necessidade da presença de coágulo sanguíneo, de osteoblastos hígidos e de contato com o tecido vital para promover o crescimento ósseo dentro de cavidades isoladas no organismo.

20 16 Em 1959, Hurley et al realizaram cirurgias de fusão espinhal utilizando barreiras de celulose tomadas de um filtro (Millipore) para excluir o epitélio da participação na reparação dos sítios ósseos e concluíram que tal membrana funcionou não apenas como uma membrana semipermeável, mas também impediu a invasão dos tecidos moles na área de formação de novo osso. Melcher e Dreyer, em 1962, destacaram a importância da preservação do coágulo para a regeneração tecidual. Os autores utilizaram uma membrana de acetato de celulose em defeitos no fêmur de ratos e estabeleceram nessa oportunidade algumas vantagens no uso das mesmas, que seriam: proteção, conformação e estabilização do coágulo e proteção contra invasão de células indesejáveis. Boyne, em 1964, também utilizou filtros de acetato de celulose para corrigir defeitos alveolares em cães, e obteve melhores índices de regeneração óssea frente à não utilização. Um dos primeiros relatos de utilização de membrana de teflon (politetrafluoretileno), conhecida como PTFE, ocorre no estudo de Kahnberg (1979), usada em coelhos para corrigir defeitos na mandíbula. Como resultado, constatou-se que a mesma impedia a invasão do tecido conjuntivo fibroso, facilitando a regeneração óssea. Para Melcher e Dreyer (1962), a cicatrização do periodonto era motivada pelo tipo celular que repopulava a superfície da ferida. Este conceito de seleção de população celular influenciou Nyman et al (1982) a usarem barreiras oclusivas em estudos de regeneração periodontal, que formaram as bases para uma técnica depois conhecida como Regeneração Tecidual Guiada (RTG). Foi então que estes autores utilizaram uma barreira do biomaterial acetato de celulose (Millipore) microporoso em humanos para isolar o tecido periodontal do tecido epitelial, posicionando-a sobre a raiz desnuda do dente, impedindo a migração de fibroblastos da gengiva e células epiteliais sobre a raiz desnuda, permitindo o repovoamento seletivo pelas células do ligamento periodontal restante. Os pesquisadores basearam-se no princípio de que as células provenientes do ligamento periodontal são as únicas com potencial de se diferenciarem em cementoblastos e instalaram as membranas entre o retalho mucogengival e a superfície radicular dos dentes,

21 17 permitindo assim, a migração sobre a superfície radicular, no sentido coronário, de células do ligamento periodontal, inibindo simultaneamente o crescimento de células do epitélio gengival, do tecido conjuntivo e do tecido ósseo para a região. Os autores salientaram as vantagens da técnica de regeneração tecidual guiada, através das membranas, para tratamento de defeitos periodontais. Gottlow et al, em 1984, em estudo realizado em macacos, obtiveram nova inserção periodontal, com formação de cemento e ligamento periodontal, sobre raízes previamente expostas, desnudadas e sujeitas ao biofilme dental. A reparação foi controlada através do isolamento com membranas de acetato de celulose (Millipore filter). Estudos posteriores valeram-se de membranas para a regeneração apenas de tecido ósseo, procedimento denominado regeneração óssea guiada (ROG). O primeiro estudo em animais, com o objetivo de avaliar a possibilidade da aplicação do princípio da regeneração tecidual guiada na regeneração óssea foi conduzido por Dahlin e Linde al (1988). Defeitos ósseos do tipo "lado a lado" com 5 mm de diâmetro, no ângulo da mandíbula de ratos, recobertos na cortical interna e cortical externa, com uma membrana de politetrafluoretileno expandido (PTFE-e) tiveram completo preenchimento ósseo no lado teste após seis semanas. Nenhum preenchimento ósseo foi observado durante o experimento, no lado controle. Segundo Buser (2010), a ROG é o método mais amplamente usado para aumento ósseo na prática odontológica. Já que o osso é um tecido de crescimento relativamente lento, tanto fibroblastos como células epiteliais têm a oportunidade de ocupar o espaço disponível com mais eficiência e construir um tecido conjuntivo mole muito mais rápido do que o osso é capaz de crescer. Assim, o mecanismo biológico da ROG é a exclusão das células indesejáveis no espaço preenchido pelo coágulo sob a membrana. Nesse contexto existem condições para as células-tronco e células osteoprogenitoras se diferenciarem em osteoblastos, que depositam matriz óssea. Resumindo, a membrana cria um espaço solitário que permite ao osso usar sua grande capacidade natural de modo seguro e protegido. A ROG é a técnica que usa a osteopromoção como princípio biológico. Está indicada para a regeneração óssea em alvéolos frescos; defeitos ósseos que tenham paredes ósseas remanescentes; para promover a neoformação óssea ao

22 18 redor de implantes instalados imediatamente após a exodontia ou para corrigir perda óssea (periimplantar) que ocorre após a osseointegração. Nesse contexto, são classificadas como osteopromotores, quanto à característica física, ou seja, são meios físicos que promovem o isolamento anatômico de um local, permitindo a seleção e proliferação de um grupo de células, predominantemente osteoblastos, a partir do leito receptor e simultaneamente impedem a ação de fatores concorrentes inibitórios ao processo de regeneração. Nesta técnica é imperioso que haja um espaço biológico entre a barreira ou membrana e o defeito ósseo (CARVALHO et al, 2004). Buser (2010), divide os objetivos da ROG em primários e secundários. Os objetivos primários representam a obtenção de uma regeneração óssea bemsucedida na área do defeito com alta previsibilidade e baixo risco de complicações. Os objetivos secundários visam obter um resultado bem-sucedido com menos intervenções cirúrgicas, baixa morbidade para o paciente e período de cicatrização diminuído. Estes objetivos secundários têm sido muito importantes nos últimos 10 a 15 anos, porque os clínicos de todo o mundo têm tentado melhorar esse aspectos na tentativa de tornar os procedimentos de ROG menos estressantes e/ou mais atrativos aos pacientes na prática diária; contudo não devem comprometer os objetivos primários, que representam a prioridade. Para a neoformação óssea ser completa pela ROG, devem existir as seguintes condições: a) fontes de células osteogênicas osso viável adjacente ao defeito; b) fonte adequada de vascularização; c) o local da ferida deve permanecer mecanicamente estável durante a reparação; d) deve existir um espaço apropriado entre a membrana e a superfície óssea (ANDRADE-ACEVEDO et al, 2004). Membranas são colocadas sobre defeitos ósseos estreitamente adaptadas à superfície do osso circundante, criando assim uma proteção no defeito. A membrana atua como uma barreira, que inibe as células não osteogênicas dos tecidos moles de participarem na regeneração dos defeitos e permite que as células osteogênicas e angiogênicas originárias da medula óssea adjacente participem da regeneração dos defeitos ósseos (BUSER et al, 1998). As membranas devem ser biocompatíveis, ou seja, capazes de serem utilizadas em um sistema biológico, sem provocar reações adversas e nem impedir a

23 19 diferenciação tecidual característica do local da implantação (CARVALHO et al, 2004). O emprego de membranas biológicas evita que as células do epitélio bucal e do tecido conjuntivo participem da reparação do defeito ósseo, deixando que as células osteoblásticas tenham a prioridade de se conduzirem para a área. Estas membranas criam um meio propício para melhorar a regeneração funcional através do potencial biológico natural, proporcionando a estabilidade mecânica do coágulo e a manutenção do espaço preenchido pelo mesmo através do isolamento de tecidos indesejáveis no local da regeneração (CONSOLARO et al, 1997). Schropp et al (2003), avaliaram as alterações teciduais após a remoção de pré-molar ou molar em 46 pacientes e concluíram haver uma redução de até 50% da largura da crista óssea alveolar no primeiro ano após a exodontia, sendo que dois terços desta perda óssea acontecem nos primeiros três meses. A preservação do volume do osso alveolar após a exodontia facilita a posterior colocação de implantes dentários e leva a uma melhoria estética e funcional no resultado protético. Durante a exodontia, a própria condição anatômica do elemento dental removido pode levar o rebordo a grandes reabsorções, ainda que se tenha tomado cuidado para o menor dano possível ao tecido ósseo, resultando em defeitos ósseos que necessitam enxertos ósseos com diferentes técnicas e abordagens cirúrgicas complexas (BARTEE, 2001). Muitos desses problemas poderiam ser eliminados caso o alvéolo dental fosse preservado após a exodontia, empregando materiais de enxerto junto com as membranas utilizadas como barreiras (ZUBILLAGA et al, 2003). Tais membranas biológicas dividem-se em dois grandes grupos: nãoabsorvíveis e absorvíveis. Estas últimas subdividem-se em bioabsorvíveis degradadas por hidrólise, e biodegradáveis, em que há uma ação enzimática (CRUZ, 2006; BUSER, 2010). Dentre as membranas não-absorvíveis estão as de e-ptfe; nestas, a molécula de flúor carbono, politetrafluoretileno expandido, não pode ser quebrada quimicamente em condições fisiológicas o que, do ponto de vista de segurança e compatibilidade, é muito favorável. Já outros materiais, como membranas

24 20 biodegradáveis (ácido poliláctico e poliglicólico), degradam-se pela hidrólise, sendo o produto final, caracterizado por substâncias químicas comuns para os processos metabólicos normais. Durante a degradação hidrolítica, estes materiais quebram-se em fragmentos que podem ter um efeito significativo na resposta tecidual local, podendo produzir reabsorção óssea (ANDRADE-ACEVEDO, 2004). O reparo dos defeitos ósseos é um bom modelo para o estudo da regeneração óssea. Contrário às fraturas, os defeitos estão menos sujeitos aos fatores mecânicos e às obstruções no suprimento sanguíneo. Assim, a reparação do defeito tem sido usada em muitos experimentos clássicos com a influência das medidas cirúrgicas e farmacológicas na regeneração óssea (BUSER, 2010). Vários estudos em coelhos foram desenvolvidos com o intuito de eleger a membrana ideal para os enxertos (LUNDGREN et al, 1997; AABOE et al, 1998; ITO, NANBA e MURAI, 1998; MAROUF e El- GUINDI, 2000; LEE et al, 2001; STAL et al, 2001; ASLAN, SIMSEK e GAYI, 2004; MACEDO et al, 2004; MIYAMOTO et al, 2004; NISCHIMURA, SHIMIZU e OOYA, 2004; KIM et al, 2005; OKASAKI et al, 2005; JUNG et al, 2006; QUEIROZ et al, 2006; LAUREANO FILHO et al, 2007; MOURA, 2007; MONTEIRO et al, 2008). O coelho tem sido utilizado como modelo biológico de reparo ósseo devido às semelhanças fisiológicas e metabólicas entre o tecido ósseo desse animal e o de humanos. Possui um sistema harversiano ósseo parecido com o humano, sendo a reparação óssea pós-trauma semelhante nessas espécies A calvária, região cirúrgica escolhida, oferece baixa morbidade, acessibilidade e reduzida interferência de forças musculares (HARKNESS; WAGNER, 1993). Segundo Roberts e Garetto (2000), a remodelagem do osso cortical é definida como uma modificação ou reestruturação interna do osso previamente existente, que compreende as fase de ativação das células precursoras, reabsorção ativa, quiescência ou reversão e formação. Os autores estudaram o ciclo de remodelagem (também denominado de sigma ) e observaram que sua duração é de seis semanas para os coelhos, 12 semanas para cães e 17 semanas para humanos. Usando o coelho (x) como base, os fatores dos eventos fisiológicos similares nos cães e nos humanos são de 2x e 3x respectivamente. A remodelagem resulta na formação de ósteons secundários, que são estruturas lamelares concêntricas com uma margem periférica festonada, as margens festonadas dos ósteons secundários por sua vez

25 21 são as linhas de cimento, pois uma fina camada de uma substância rica em polissacarídeo, que serve como cimento, é evidente entre o osso velho e o novo. Os autores também observaram que o osso trabecular remodela-se de maneira essencialmente idêntica ao osso cortical. Schmid et al (1994), investigaram a hipótese da necessidade de permeabilização da membrana na formação do osso usando o princípio da RTG em calvária de coelhos. Em um grupo foram implantados cilindros de titânio cobertos por uma membrana de e-ptfe formando um local para a formação do osso e outro grupo recebeu uma camada de titânio. Após oito meses, ambos os grupos apresentaram nova formação óssea, independente do selamento da região. Baseado nesses resultados, concluiu-se que a permeabilidade da membrana não é necessária na RTG de novo osso. Lundgren et al (1997), compararam o uso de enxerto ósseo particulado com e sem cobertura por membrana biorreabsorvível para aumento ósseo na calvária de coelhos. Para esse propósito, prepararam defeitos bilaterais, circulares, com 8 mm de largura e 1 mm de profundidade e preencheram com enxerto ósseo particulado e recobriram o grupo teste com uma membrana biorreabsorvível (Guidor Matrix Barrier). Os enxertos colocados nos defeitos controles foram cobertos somente pela reposição do retalho cutâneo. Após 12 semanas foram encontradas diferenças estatísticas significantes a favor da cobertura de enxerto ósseo com membrana, tanto no que diz respeito à altura como em volume do osso aumentado. Aaboe et al (1998), estudaram ROG em calvária de coelhos através do uso de membranas degradáveis e não degradáveis. Confeccionaram defeitos bicorticais de 15mm de diâmetro e utilizaram placas de titânio para prevenir o colapso da membrana. Dividiu-se o estudo em cinco grupos: dois grupos usaram membrana externa de e-ptfe e membrana de Polyglactin 910; dois outros grupos receberam membrana bicortical de e-ptfe e Polyglactin 910; o quinto grupo foi o controle, onde não se promoveu o recobrimento dos defeitos. Após oito semanas o grupo da membrana de Polyglactin 910 apresentou colapso da mesma e hérnia de tecido encefálico. O grupo da membrana e-ptfe bicortical apresentou a maior quantidade de osso formado. O grupo controle apresentou hérnia do tecido encefálico, presença de tecido conjuntivo fibroso e dura-máter fundida com o tecido conjuntivo fibroso no

26 22 defeito, concluindo-se, então, que quanto maior a proteção da região do defeito com membranas, melhor e mais rápido será o processo de reparação óssea. Marouf e El-Guindi (2000), estudaram ROG em calvária de coelhos idosos, onde confeccionaram dois defeitos com 7 mm de diâmetro. Recobriu-se um defeito com membrana de e-ptfe (Gore-Tex) e o outro com membrana de d-ptfe (TefGen). Uma fina camada de tecido ósseo recoberta por tecido fibroso foi encontrada na superfície abaixo da membrana e-ptfe; em compensação, observou-se nesse grupo, uma relativa maior velocidade e quantidade de regeneração óssea quando comparado com o grupo da membrana de d-ptfe. Stal et al (2001), estudaram ROG em calvária de coelhos, realizando defeitos bicorticais de 8mm de diâmetro. Utilizaram membrana absorvível (LACTSORB), composta de 82% de ácido poliláctico e 18% de ácido poliglicólico. Dividiram-se os animais em três grupos: 1) no Grupo A não houve recobrimento por membrana (controle); 2) no Grupo B foi realizado recobrimento do defeito com membrana Lactosorb unilaminar, ou seja, apenas uma membrana entre o periósteo e o defeito e 3) no Grupo C foi realizado recobrimento do defeito com membrana Lactosorb bilaminar, ou seja, duas membranas foram colocadas, uma entre o periósteo e o defeito e outro entre a dura-máter e o defeito. Após 16 semanas, observou-se que no Grupo A houve incompleta ossificação e presença de tecido fibroso, no Grupo B presença de remanescentes da membrana no periósteo do osso que recobria o defeito e no Grupo C, presença de remanescente de membrana acima e abaixo da díploe, guiando a regeneração óssea. Concluiu-se que o uso desta membrana beneficia o processo da osteogênese isolando a região do defeito ósseo. Queiroz et al (2006), analisaram histologicamente ROG em defeitos ósseos criados no crânio de coelhos que foram divididos em quatro grupos: o Grupo 1 não recebeu qualquer tratamento (controle); o Grupo 2 recebeu osso liofilizado bovino (Biograft); no Grupo 3 o defeito foi preenchido por osso bovino e coberto com uma manta de osso (Bioplate); o Grupo 4 teve o defeito recoberto por uma membrana de osso. Após 60 dias, observou-se que a formação de novo osso no grupo 2 não era satisfatória quando comparada ao grupo 3. Este, mostrou uma quantidade grande de formação de novo osso em maturação. Concluiu-se que o uso de uma membrana cobrindo todo o defeito age como uma barreira contra a migração das células do

27 23 tecido conjuntivo adjacente, criando um microespaço favorável para a angiogênese e neoformação óssea. Moura (2007), avaliou, através de estudo in vivo, a resposta inflamatória e a manutenção de um espaço vital para a regeneração óssea sob membranas de PLLA/tri-etil-citrato, em três diferentes proporções polímero/plastificante, implantadas na calota craniana de coelhos, analisando, assim, a capacidade destas membranas em se adaptarem aos critérios da RTG periodontal. Classificou a regeneração óssea de acordo com o fechamento do defeito e observou que no grupo controle, onde não recobriu o defeito com nenhum tipo de membrana, não houve fechamento total do defeito em nenhum dos tempos estudados. He et al (2008), estudaram o uso de uma membrana de material bioabsorvível, o filtro de alginato de cálcio (CAF), usada no processo de RTG e ROG. Defeitos circulares foram criados na calvária de coelhos e cobertos com o CAF no grupo teste. Os animais do grupo controle receberam uma membrana de colágeno. O grupo teste mostrou mais rapidamente os fatores osteoindutores levando à melhor regeneração óssea. O grupo controle apresentou maior número de macrófagos e menos fatores osteoindutores na fase inicial. Monteiro et al (2008), estudaram ROG em defeitos cirúrgicos confeccionados em osso parietal de coelhos divididos em dois grupos: teste, onde se utilizou barreiras de poliuretana (PUr) e de politetrafluoretileno (PTFE) e grupo controle, onde não foi utilizado nenhum tipo de barreira para recobrimento do defeito valendose apenas do coágulo sanguíneo. Não houve diferença significante entre os grupos experimentais; contudo, o recobrimento dos defeitos com barreiras demonstrou superioridade quantitativa e qualitativa do preenchimento ósseo e reparação mais rápida em relação ao grupo de controle, confirmando os benefícios do uso das membranas para ROG. D Acampora et al (2006), compararam o uso de tela de e-ptfe e polipropileno no tratamento de hérnias incisionais produzidas experimentalmente em ratos distribuídos em três grupos: ressecção de segmento da parede abdominal(c- A), ressecção e colocação de tela de e-ptfe (E-A) e ressecção e colocação de tela de polipropileno (E-B). Após 28 dias, verificou-se que houve ocorrência mínima de

28 24 polimorfonucleares nos grupos E-A e E-B, indicando assim uma baixa reatividade tecidual de ambos materiais nesses animais. Salomão e Siqueira (2009), apresentaram três casos clínicos de regeneração óssea alveolar pós-exodontia, em que se usou o artifício de barreira de polipropileno. Mostrou-se que o uso desta membrana impermeável contribuiu para a retenção do coágulo ósseo e formação de osso primário, mantendo a forma e dimensões do rebordo alveolar, apresentando-se como um material biocompatível e sem efeitos inflamatórios deletérios ao organismo. Em trabalho subsequente (Salomão e Siqueira, 2010), relataram um caso clínico em que houve extenso defeito ósseo pós-exodontia dentária. Tal defeito foi protegido por uma barreira de polipropileno (Bone Heal ), deixada intencionalmente exposta ao meio bucal, e que foi removida uma semana após a cirurgia. Nenhum tipo de biomaterial foi usado para preencher o defeito a ser reparado, apenas sangue. Acompanhou-se o caso por 90 dias e verificou-se que o uso da barreira Bone Heal contribuiu para a manutenção do rebordo alveolar, o que veio a favorecer a instalação de um implante osteointegrável e reabilitação provisória. Tal membrana é um material novo no mercado que, segundo o fabricante, age como uma barreira mecânica impermeável, não reabsorvível, impedindo que a rápida proliferação do tecido conjuntivo frouxo perturbe ou impeça a osteogênese em um defeito ou área a ser reparada, garantindo assim, a vascularização da área a ser reparada e favorecendo a organização do coágulo, de tal modo que após sua remoção, este permaneça mecanicamente estável durante o período de reparação, permitindo que sejam mantidas as condições necessárias para que a neoformação óssea seja completa. Face à inexistência de um trabalho científico que viesse esclarecer o processo de reparação frente ao uso desta membrana, interessou-nos seu estudo, motivo deste trabalho.

29 25 3 PROPOSIÇÃO A presente pesquisa tem como finalidade o estudo histológico da regeneração óssea guiada com a utilização de uma membrana de polipropileno em defeitos confeccionados em calvária de coelhos.

30 26 4 MATERIAIS E MÉTODOS O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Santo Amaro (parecer nº 118/2009, Anexo 1), de acordo com os Princípios Éticos de Experimentação Animal, elaborados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), segundo normas internacionais para a utilizaçãao de animais em pesquisa embasadas na tríade sensibilidade, bom senso e boa ciência. Os animais selecionados para a pesquisa foram 16 coelhos da raça New Zealand, fêmeas, pesando entre 3,5 a 4 kg e idade entre 11 e 15 meses. Foram mantidos em observação por um período de sete dias após a chegada, para que fossem descartadas quaisquer anomalias no estado geral de saúde. Todos os coelhos foram provenientes de criadouro particular e mantidos no Biotério da Universidade de Santo Amaro (UNISA), assistidos e medicados por médicos veterinários. As cirurgias foram realizadas nas dependências do laboratório de técnica cirúrgica multidisciplinar da UNISA. Os coelhos foram mantidos em local apropriado com ventilação e temperaturas controladas (22 ± 2 C) e alimentados com ração Nutríara (Paulinia, São Paulo- Brasil) e água administrada ad libitum. As gaiolas foram marcadas com etiquetas, nas quais constava o grupo ao qual pertenciam os animais e seu respectivo número, facilitando a identificação. 4.1 Membrana de polipropileno (BONE HEAL, Sistema INP, São Paulo, Brasil) Selecionou-se uma membrana de polipropileno para a regeneração óssea guiada. O material utilizado para a fabricação da mesma está em conformidade à norma ASTM série D, com peso específico de 0,91 g/cm3, tensão de escoamento a tração de 35 MPa, elasticidade a flexão de 1300 MPa, ponto de fusão de 165 ºC e fórmula molecular:-[ch(ch3)-ch2]-n, possuindo como características principais, de acordo com o fabricante: boa resistência química, atoxidade, boa estabilidade térmica (ILUSTRAÇÕES 1, 2 e 3).

31 27 Ilustração 1. Especificações da membrana regenerativa Bone Heal. Ilustração 2. Forma de apresentação da membrana de polipropileno acondicionada num tubo estéril. Ilustração 3. Membrana Bone Heal.

32 28 O produto é de uso único, de acordo com os termos da RDC 156/2006 e seu descarte deve atender às exigências da RDC 306/2004 e as demais legislações vigentes em nível estadual e municipal. 4.2 Procedimento Cirúrgico Os procedimentos cirúrgicos foram realizados nas dependências do Laboratório de Técnica Cirúrgica Experimental da Universidade de Santo Amaro (UNISA, São Paulo). O procedimento anestésico foi realizado pela equipe veterinária do biotério conforme o seguinte protocolo: Cetamina (30-50 mg/kg/ via intramuscular); Xilasina (5 10 mg/kg, via intramuscular); Meperidina (5 10 mg/kg, via intramuscular). Os coelhos receberam oxigenoterapia por máscara durante todo procedimento. A frequência respiratória e cardíaca foi monitorada por um oxímetro e acompanhada por veterinário responsável. Após a anestesia, a tricotomia foi realizada na área a ser operada, a calvária, com o uso de um aparelho elétrico de barbear (ILUSTRAÇÃO 4). Procedeu-se à antissepsia de campo com auxílio de uma escova embebida em solução degermante de clorexidina a 2% (Rioquímica, São José do Rio Preto- Brasil). Em vista à manutenção da assepsia durante a cirurgia, foram colocados campos estéreis sobre cada coelho, expondo apenas a área de interesse (calvária).

33 29 Ilustração 4. Tricotomia na região da calvária, onde será feita a intervenção. Após indução anestésica, preparo dos animais e infiltração com anestésico local, a incisão foi realizada com lâmina de bisturi nº 15 na porção medial da calvária através de um retalho de espessura total, conforme Ilustração 5. Com auxílio de descoladores promoveu-se o deslocamento de todo periósteo expondo os ossos parietal esquerdo e direito e o frontal (ILUSTRAÇÃO 6). Ilustração 5. Incisão do plano cutâneo para acesso à calvária.

34 30 Ilustração 6. Divulsão dos tecidos da pele, muscular e subcutâneo e descolamento periosteal até exposição dos ossos parietais direito e esquerdo. Dois defeitos ósseos bilaterais foram preparados em cada animal, com o auxílio de uma fresa trefina com 6, 25 mm de diâmetro e broca esférica diamantada esférica n 8 de baixa rotação, montadas em motor odontológico de implantes em contra-ângulo, sob irrigação constante com solução fisiológica estéril (ILUSTRAÇÕES 7 e 8). Ilustração 7. Osteotomia com trefina para demarcação da região da confecção do defeito ósseo.

35 31 Ilustração 8. Cavidades defeito e teste devidamente demarcadas em largura. Após a penetração de 1mm com a broca trefina e demarcação da largura do defeito, foi utilizada a broca esférica em profundidade tomando o cuidado para não romper a cortical interna da calvária e expor a dura-máter (ILUSTRAÇÃO 9). Desta forma, conseguiu-se dois defeitos monocorticais bilaterais, conforme apresentado na Ilustração 10. Ilustração 9. Ostectomia com broca diamantada esférica n 8 em profundidade, dentro da largura demarcada com trefina, sem expor a dura-mater.

36 32 Ilustração 10. Cavidades confeccionadas e utilizadas como defeito teste e controle preparadas através de osteotomia parietal bilateral. Concluída a execução dos defeitos, recobriu-se o grupo com a membrana de polipropileno, que foi afixada por intermédio de tachinhas, enquanto o defeito controle não foi recoberto (ILUSTRAÇÃO 11). Ilustração 11. Defeito teste recoberto com membrana de polipropileno afixada com tachinhas e defeito controle descoberto.

37 33 A pele foi reposicionada e suturada com fio de sutura nylon 3-0, seguida de antissepsia com solução de iodo-polvedine na região do ferimento conforme ilustração 12. Ilustração 12. Sutura contínua do plano cutâneo com fio de nylon 3-0. Após as cirurgias, os animais foram medicados com antibiótico Enrofloxacina 5-10mg/kg/IM e antiinflamatório Meloxican 0,2mg/kg/IM e acompanhados até a sua total recuperação. 4.3 Eutanásia Decorridos os períodos experimentais de 21 e 42 dias, os coelhos foram submetidos à eutanásia, sob responsabilidade dos médicos veterinários do biotério, utilizando o seguinte protocolo: Cetamina- 30 mg/kg/im; Xilasina mg/kg/im; Tiopental- 20 mg/kg/ev e Cloreto de potássio 19,1% - 1 ampola /animal.

38 Remoção das Amostras Após os procedimentos de eutanásia,a região da calvária foi exposta e a membrana de polipropileno removida (ILUSTRAÇÕES 13 E 14). Ilustração 13. Momento da reabertura após 42 dias e início da remoção da membrana. Ilustração 14. Aspecto do defeito teste no momento de remoção da membrana.

39 35 Após a remoção da membrana e exposição dos defeitos ósseos, a coleta das amostras foi realizada através de osteotomia com o uso de broca trefina de 13mm (ILUSTRAÇÃO 15). Ilustração 15. Osteotomia com trefina de 13mm para remoção da área do defeito. Depois da osteotomia de espessura total foi realizada a remoção da amostra com cuidado sempre com o apoio em osso hígido para preservação do osso em reparação a ser estudado (ILUSTRAÇÃO 16).

40 36 Ilustração 16. Remoção cuidadosa da região da amostra. Logo após a remoção, as amostras dissecadas foram analisadas macroscopicamente e as observações registradas e fotografadas (ILUSTRAÇÕES 17 e 18). Em seguida, foram fixadas em paraformoldeido 10%, para análise histológica. Ilustração 17. Aspecto macroscópico da amostra removida para estudo histológico.

41 37 Ilustração 18. Observação da pequena espessura da calvária na amostra removida. 4.5 Análise histológica Em vistas à análise microscópica, as amostras foram imediatamente fixadas em formol 10% por cinco dias e descalcificadas durante quatro dias em solução aquosa 20% de citrato de sódio e solução aquosa 12,5% de ácido fórmico antes de incluir em parafina. Após os protocolos histotécnicos de descalcificação, inclusão, diafanização, clarificação, coloração (hematoxilina Eoasina e Tricômico de Mallory) e montagem, as lâminas agora confeccionadas foram divididas em dois grupos (ANEXO 3) a saber: Grupo Controle amostras do defeito em calvária sem recobrimento com membrana de polipropileno, subdivididos em controle com 21 dias de reparação e controle com 42 dias de reparação após a realização do defeito em calvária. Grupo Teste amostras do defeito recoberto com membrana de polipropileno, subdivididos em teste com 21 dias de reparação e teste com 42 dias após a realização do defeito em calvária.

42 38 Avaliou-se, histologicamente, as seguintes características, baseadas em Kierszenbaum (2008): 1 - Presença de Processo Inflamatório: infiltrado inflamatório, hemorragia, edema e formação de tecido de granulação. 2 Fase de Reparação Óssea: angiogênese, presença de fibroblastos ativos, reação periosteal e endosteal. 3 Fase de Remodelação Óssea: 3.1 Tecido Ósseo Compacto: fases de ativação, reabsorção osteoclástica, reversão osteoblástica e formação de osso lamelar (ósteons). 3.2 Tecido Ósseo Trabecular (Esponjoso): fases de ativação, reabsorção osteoclástica, reversão osteoblástica e formação de trabéculas. 4 Presença de matriz osteóide e mineralização. 5 Formação de tecido hematopoiético. Cada característica acima citada foi analisada semiquantitativamente de acordo com os graus de intensidade a saber: ausente (-), discreto (+), moderado (++) e acentuado (+++). 4.6 Análise Estatística Para a análise estatística dos resultados aplicou-se o teste exato de Fisher (Siegel, 2006) com a finalidade de comparar os grupos controle e teste em relação às porcentagens de casos com intensidades de reações diferentes. Em todos os testes fixou-se o nível de significância em 0,05 ou 5%.

43 39 5 RESULTADOS Os procedimentos cirúrgicos não implicaram em nenhuma intercorrência com boa recuperação e disponibilidade para alimentação. Não ocorreu deiscência da pele, sinais de infecção local ou sistêmica, nem mesmo extrusão do biomaterial implantado. Macroscopicamente, no momento de coleta das amostras, observou-se ausência de interposição de tecido mole entre a barreira e a área de defeito (ILUSTRAÇÃO 19). Ilustração 19. Aspecto macroscópico da calvária após a eutanásia: a membrana estava bem colocada em todas as amostras sem interposição de tecido entre a barreira e a área do defeito. Os defeitos do grupo teste apresentavam uma consistência mais rígida, com um tecido mais organizado, endurecido e menos fibroso, quando comparados com os defeitos do grupo controle, tanto aos 21, como aos 42 dias de reparação. Comparado com o tecido ósseo vizinho, o tecido do defeito teste apresentava-se menos compacto, típico de tecido osteóide (ILUSTRAÇÃO 20).

44 40 T C Ilustração 20. Diferença macroscópica da reparação óssea nas regiões dos defeitos teste (T) e controle (C), evidenciada principalmente com 42 dias de reparação. 5.1 Avaliação histológica Nas amostras do Grupo Controle com 21 dias de reparação, notaram-se predominantemente as seguintes características histológicas, que são observadas nas ilustrações 21 e 22: Ausência de infiltrado celular inflamatório. Angiogênese, edema e hemorragia difusos. Presença de periósteo altamente fibroso e tecido fibroso infiltrante. Presença de fibras colágenas em alta quantidade. Presença multifocal de matriz osteóide não mineralizada (calcificada). Presença de tecido hematopoiético mal formado com tecido adiposo predominante. Presença de alto depósito de fibras colagenosas fibrosas. Tecido ósseo cortical focalmente ausente em algumas regiões. Alguns ósteons irregulares. Osso lamelar em formação.