EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM UMA DIETA HIPERLIPÍDICA E COM RESTRIÇÃO DE CARBOIDRATOS NO METABOLISMO DE RATAS GESTANTES E SUAS NINHADAS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM UMA DIETA HIPERLIPÍDICA E COM RESTRIÇÃO DE CARBOIDRATOS NO METABOLISMO DE RATAS GESTANTES E SUAS NINHADAS TÂNIA MARA SARRAFF SOUZA MOREIRA UBERABA, MG 2012

2 TÂNIA MARA SARRAFF SOUZA MOREIRA EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM UMA DIETA HIPERLIPÍDICA E COM RESTRIÇÃO DE CARBOIDRATOS NO METABOLISMO DE RATAS GESTANTES E SUAS NINHADAS Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Patologia, área de concentração em "Patologia Geral", da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre. Orientador: Prof. Dr. Geraldo Thedei Júnior UBERABA, MG 2012

3 "A grandeza não consiste em receber honras, mas sim, em merecê-las". Aristóteles

4 À minha mãe, Jamile Sarraff Souza, pelo amor e apoio incondicional. À Minha irmã, Déborah Sarraff Souza Delfino, amiga e companheira de todas as horas. À Minha madrinha e Minha avó, Nadime Sadala Sarraff e Alice Abdala Sarraff, que sempre me apoiaram e me incentivaram nos estudos. Obrigado por acreditarem em mim. Ao meu filho, Pedro Souza Moreira, que carreguei durante a execução deste trabalho e sacrifiquei alguns momentos ao seu lado, mas me fez acreditar e ter forças nos momentos mais difíceis. Foi por você que é o maior amor da minha vida que hoje consegui mais essa vitória. Não tenho palavras para agradecer o amor e dedicação que recebi de vocês. Nenhuma palavra será suficiente para demonstrar a minha gratidão por isso.

5 AGRADECIMENTOS À Deus, por todas as coisas maravilhosas que me foram concedidas, por estar presente todos os dias na minha vida. Ao Prof., Dr. Geraldo Thedei Júnior pela oportunidade de realizar este trabalho sob vossa orientação e pela credibilidade. Ao meu esposo, Cleiton Pinto Moreira, que sempre acreditou em mim e apoiou meus sonhos. Aos meus familiares, que acreditaram na minha conquista e sempre me apoiaram. Às alunas de Iniciação Científica, Bárbara L. Medeiros, Venina Barbosa Arantes, Fernanda Lima Silva, Gislaine Aparecida de Sousa, Kisian Costa Guimarães e Francieli Pereira Bianchini pela colaboração na execução deste projeto e pela convivência, amizade e alegrias compartilhadas. Aos meus amigos, professores e demais funcionários da Universidade Federal do Triângulo Mineiro e da Universidade de Uberaba, nos quais encontrei compreensão, estímulo e cooperação. À Profª. Maria Thereza Cerávolo Laguna Abreu, pela ajuda nas dosagens bioquímicas e por contribuir com meu crescimento profissional.

6 Aos Profs. Benito André Silveira Miranzi (UNIUBE) e Gilberto de Araújo Pereira (UFTM) pelo auxílio nas análises estatísticas e pela disponibilidade em ensinar. À Profª. Sanívia Aparecida de Lima Pereira, pelo conhecimento e disponibilidade em colaborar com a análise histológica de fígado e tecido adiposo de ratos, os quais foram de extrema relevância para esta tese. Ao Técnico do Biotério Central da UNIUBE, Luiz Fernando Vaz Oliveira pela ajuda no tratamento dos animais. À Rayane Bernardes Estevam (UNIUBE), pelo auxílio no processamento dos cortes histológicos. Às secretárias do Curso de Pós-graduação em Patologia da UFTM, Nelma Aparecida Ferreira e Denise Teresinha Cardoso pela atenção, e às secretárias da Pró-reitoria de Pesquisa e Extensão da UNIUBE, Alessandra e Rubiana. Às minhas colegas de trabalho Liliane Barreto Teixeira, e Márcia Gabriela Margato Rocha pelo companheirismo e conhecimentos transmitidos. Ao meu primo, Dr. (PhD) Elias Abdalla Filho, pelo conhecimento compartilhado, pela força, atenção, e pela amizade. Aos docentes do Curso de Pós-graduação em Patologia da UFTM pelos conhecimentos diversos na área da educação que contribuíram para minha formação profissional.

7 A todos, agradeço por acreditarem no meu potencial, na minha profissão, nas minhas ideias. Muito obrigada pelo conhecimento e pelo apoio.

8 APOIO FINANCEIRO Este trabalho recebeu auxílio financeiro da Universidade de Uberaba (PAPE/UNIUBE), da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG - Processo nº CDS 1282/05 e Processo APQ /07) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(CNPq).

9 LISTA DE QUADROS Quadro 01 - Composição centesimal da dieta controle Quadro 02 - Composição da dieta experimental I Quadro 03 - Composição da dieta experimental II Quadro 04 - Nomenclatura das ratas fêmeas de acordo com dieta recebida nos períodos de gestação/ lactação Quadro 05 - Nomenclatura dos Filhotes... 37

10 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Distribuição das ratas fêmeas ao longo dos períodos de gestação/ lactação Figura 2 - Rata do grupo Experimental II anestesiada. Biotério Central, Universidade de Uberaba Figura 3 - Peso da rata do grupo Controle durante a gestação. Biotério Central, Universidade de Uberaba Figura 4 - Peso ao nascer do filhote do grupo Experimental II. Biotério Central, Universidade de Uberaba Figura 5 - Peso do órgão (fígado) do filhote do grupo Experimental II. Biotério Central, Universidade de Uberaba Figura 6 - Mensuração da área das células adiposas através do sistema analisador de imagens Image J de ratas wistar submetidos a diferentes dietas (HE 400X) Figura 7 - Efeito da dieta hiperlipídica normoprotéica (EI) e hipoprotéica (EII) na evolução do peso das ratas ao longo da gestação, até o pós-parto. C = Dieta controle balanceada. Foi utilizado o Teste ONE-WAY ANOVA e Pós Teste de Bonferroni. Letras maiúsculas iguais indicam que não houve diferença estatística entre os tratamentos ao nível de significância de p 0, Figura 8 Efeito da dieta hiperlipídica normoprotéica (EI) e hipoprotéica (EII) no ganho de peso absoluto pelas ratas durante o período de gestação. C = Dieta controle balanceada. Foi utilizado o Teste ONE-WAY ANOVA e Pós Teste de Bonferroni, sendo valores expressos em média ± desvio padrão. p>0, Figura 9 Efeito da dieta hiperlipídica normoprotéica (EI) e hipoprotéica (EII) no ganho de peso relativo das ratas durante o período de gestação. C = Dieta controle balanceada. Foi utilizado o Teste ONE-WAY ANOVA e Pós Teste de Bonferroni, sendo valores expressos em média ± desvio padrão. Letras maiúsculas iguais indicam que não houve diferença estatística entre os tratamentos ao nível de significância de p 0, Figura 10 - Evolução do peso das ratas ao longo da lactação, em função das dietas ingeridas ao longo do período de gestação (primeira letra da identificação dos grupos) e lactação (segunda letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica. Foi utilizado o Teste ONE-WAY ANOVA e Pós Teste de Bonferroni. Letras maiúsculas iguais indicam que não houve diferença estatística entre os tratamentos ao nível de significância de p 0,

11 Figura 11 Ganho de peso absoluto (gramas) das ratas ao final da lactação, em função das dietas ingeridas ao longo do período de gestação (primeira letra da identificação dos grupos) e lactação (segunda letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica. Foi utilizado o Teste ONE-WAY ANOVA e Pós Teste de Bonferroni.. Letras maiúsculas iguais indicam que não houve diferença estatística entre os tratamentos ao nível de significância de p 0, Figura 12 Ganho de peso relativo (gramas/100 gramas) das ratas ao final da lactação, em função das dietas ingeridas ao longo do período de gestação (primeira letra da identificação dos grupos) e lactação (segunda letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica. Foi utilizado o Teste ONE-WAY ANOVA e Pós Teste de Bonferroni. Letras maiúsculas iguais indicam que não houve diferença estatística entre os tratamentos ao nível de significância de p 0, Figura 13 - Porcentagem de ocorrência de esteatose hepática nas ratas ao final da lactação, em função das dietas ingeridas ao longo do período de gestação (primeira letra da identificação dos grupos) e lactação (segunda letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica Figura 14 - Cortes histológicos de fígados de ratas após gestação e lactação, submetidas a diferentes dietas, mostrando o aspecto de um fígado normal (A) (x800), com esteatose (B) (x800) Figura 15 - Área dos adipócitos das ratas ao final da lactação, em função das dietas ingeridas ao longo do período de gestação (primeira letra da identificação dos grupos) e lactação (segunda letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica. Foi utilizado o Teste Kruskal-Wallis e Pós teste de comparação múltipla de Dunn, sendo valores expressos em mediana com valores mínimo e máximo. Letras maiúsculas iguais indicam que não houve diferença estatística entre os tratamentos ao nível de significância de p 0, Figura 16 - Efeito da dieta hiperlipídica normoprotéica (EI) e hipoprotéica (EII) no número de filhotes nascidos vivos. C = Dieta controle balanceada. Foi utilizado o Teste ONE-WAY ANOVA e Pós Teste de Bonferroni, sendo valores expressos em média ± desvio padrão. p > 0, Figura 17 - Efeito da dieta hiperlipídica normoprotéica (EI) e hipoprotéica (EII) na ocorrência de mortalidade ao nascer. C = Dieta controle balanceada. Foi utilizado Teste Qui-quadrado de partição. Quando apresentou significância, foi utilizado análise dos resíduos para determinar onde estaria a diferença significativa. Letras maiúsculas iguais indicam que não houve diferença estatística entre os tratamentos ao nível de significância de p 0,05. Observa-se que houve diferença entre o grupo C e os grupos EI e EII (p<0,05)... 68

12 Figura 18 - Evolução do peso dos filhotes durante lactação, em função das dietas ingeridas pelas ratas ao longo do período de lactação (primeira letra da identificação dos grupos) e lactação (segunda letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica. Foi utilizado o Teste ONE-WAY ANOVA e Pós Teste de Bonferroni Figura 19 - Porcentagem de ocorrência de esteatose hepática em filhotes recém nascidos (RN), em função das dietas ingeridas pelas ratas ao longo do período de gestação (segunda letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica Figura 20 - Porcentagem de esteatose hepática em filhotes (f) ao final da lactação, em função das dietas ingeridas pelas ratas ao longo do período de gestação (segunda letra da identificação dos grupos) e lactação (terceira letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica Figura 21 - Área dos adipócitos dos filhotes (f) ao final da lactação, em função das dietas ingeridas pelas ratas ao longo do período de gestação (segunda letra da identificação dos grupos) e lactação (terceira letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica. Foi utilizado o Teste Kruskal-Wallis e Pós teste de comparação múltipla de Dunn, sendo valores expressos em mediana com valores mínimo e máximo. Letras maiúsculas iguais indicam que não houve diferença estatística entre os tratamentos ao nível de significância de p 0,

13 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Efeito da dieta hiperlipídica normoprotéica (EI) e hipoprotéica (EII) na taxa de prenhez Tabela 2 - Efeito da dieta hiperlipídica normoprotéica (EI) e hipoprotéica (EII) na ocorrência de ratas que pariram filhotes vivos em comparação com o grupo Controle (C) Tabela 3 - Efeito da dieta hiperlipídica normoprotéica (EI) e hipoprotéica (EII) no peso das ratas ao longo da gestação. C = Dieta controle balanceada Tabela 4 - Peso das ratas ao longo da lactação, em função das dietas ingeridas ao longo do período de gestação (primeira letra da identificação dos grupos) e lactação (segunda letra da identificação dos grupos). C= Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica Tabela 5 - Ganho de peso absoluto (gramas) das ratas ao final da lactação, em função das dietas ingeridas ao longo do período de gestação (primeira letra da identificação dos grupos) e lactação (segunda letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica Tabela 6 - Ganho de peso relativo (gramas/100 gramas) das ratas ao final da lactação, em função das dietas ingeridas ao longo do período de gestação (primeira letra da identificação dos grupos) e lactação (segunda letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII= dieta hiperlipídica hipoprotéica Tabela 7 - Peso dos órgãos das ratas (gramas/100 gramas de peso corporal) ao final da lactação, em função das dietas ingeridas ao longo do período de gestação (primeira letra da identificação dos grupos) e lactação (segunda letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica Tabela 8 - Parâmetros bioquímicos das ratas ao final da lactação, em função das dietas ingeridas ao longo do período de gestação (primeira letra da identificação dos grupos) e lactação (segunda letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica Tabela 9 - Ocorrência de esteatose hepática nas ratas ao final da lactação, em função das dietas ingeridas ao longo do período de gestação (primeira letra da identificação dos grupos) e lactação (segunda letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica... 64

14 Tabela 10 - Número e porcentagem de óbitos dos filhotes durante lactação, em função das dietas ingeridas pelas ratas ao longo do período de gestação (primeira letra da identificação dos grupos) e lactação (segunda letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII= dieta hiperlipídica hipoprotéica Tabela 11 - Peso dos filhotes (f) ao nascer e durante a lactação, em função das dietas ingeridas pelas ratas ao longo do período de gestação (segunda letra da identificação dos grupos) e lactação (terceira letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica Tabela 12 - Peso dos órgãos dos filhotes (f) (gramas/100gramas) ao final da lactação, em função das dietas ingeridas pelas ratas ao longo do período de gestação (segunda letra da identificação dos grupos) e lactação (terceira letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica Tabela 13 - Parâmetros bioquímicos de Glicose e Triglicérides dos filhotes ao final da lactação, em função das dietas ingeridas pelas ratas ao longo do período de gestação (segunda letra da identificação dos grupos) e lactação (terceira letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica Tabela 14 - Parâmetros bioquímicos de Colesterol total e frações dos filhotes (f) ao final da lactação, em função das dietas ingeridas pelas ratas ao longo do período de gestação (segunda letra da identificação dos grupos) e lactação (terceira letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica Tabela 15 - Ocorrência de esteatose hepática nos filhotes recém-nascidos (RN), em função das dietas ingeridas pelas ratas ao longo do período de gestação. C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII = dieta hiperlipídica hipoprotéica Tabela 16 - Ocorrência de esteatose hepática nos filhotes (f) ao final da lactação, em função das dietas ingeridas pelas ratas ao longo do período de gestação (segunda letra da identificação dos grupos) e lactação (terceira letra da identificação dos grupos). C = Dieta controle balanceada; EI = dieta hiperlipídica normoprotéica; EII= dieta hiperlipídica hipoprotéica... 80

15 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CEEA IBGE Comitê de Ética em Experimentação Animal Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística DM2 Diabetes mellitus tipo 2 HLP DHNA Dieta C Dieta EI Dieta EII HDL LDL VLDL HF rpm C EI EII CC CEI CEII EIC EIEI EIIC EIIEII RNC RNEI RNEII fcc Dieta Hiperlipídica-proteica Doença hepática não-alcoólica Dieta comercial para ratos Dieta hiperlipídica normoprotéica restrita em carboidratos Dieta hiperlipídica hipoprotéica restrita em carboidratos Lipoproteína de Alta Densidade Lipoproteína de Baixa Densidade Lipoproteína de Densidade Muito Baixa Dieta com alto teor de gordura Rotações por minuto Ratas alimentadas com dieta controle durante a gestação Ratas alimentadas com dieta experimental I durante a gestação Ratas alimentadas com dieta experimental II durante a gestação Ratas alimentadas com dieta controle durante a gestação e lactação Ratas alimentadas com dieta controle durante a gestação e dieta experimental I durante a lactação Ratas alimentadas com dieta controle durante a gestação e dieta experimental II durante a lactação Ratas alimentadas com dieta experimental I durante a gestação e dieta controle durante a lactação Ratas alimentadas com dieta experimental I durante a gestação e lactação Ratas alimentadas com dieta experimental II durante a gestação e dieta controle durante a lactação Ratas alimentadas com dieta experimental II durante a gestação e lactação Filhotes recém nascidos provenientes de ratas alimentadas com dieta controle durante a gestação Filhotes recém nascidos provenientes de ratas alimentadas com dieta experimental I durante a gestação Filhotes recém nascidos provenientes de ratas alimentadas com dieta experimental II durante a gestação Filhotes de 21 dias provenientes de ratas alimentadas com dieta controle durante a gestação e lactação

16 fcei fceii feic feiei feiic feiieii Filhotes de 21 dias provenientes de ratas alimentadas com dieta controle durante a gestação e dieta experimental I durante a lactação Filhotes de 21 dias provenientes de ratas alimentadas com dieta controle durante a gestação e dieta experimental II durante a lactação Filhotes de 21 dias provenientes de ratas alimentadas com dieta experimental I durante a gestação e dieta controle durante a lactação Filhotes de 21 dias provenientes de ratas alimentadas com dieta experimental I durante a gestação e lactação Filhotes de 21 dias provenientes de ratas alimentadas com dieta experimental II durante a gestação e dieta controle durante a lactação Filhotes de 21 dias provenientes de ratas alimentadas com dieta experimental II durante a gestação e lactação

17 RESUMO Nas últimas décadas ocorreram mudanças substanciais no estilo de vida do homem, incluindo o aumento da ingestão calórica e redução da atividade física. A obesidade tornou-se uma epidemia mundial, atingindo pessoas em todas as fases da vida. Hábitos alimentares não saudáveis estão presentes em todas as fases do ciclo vital e podem prejudicar ainda mais grupos populacionais mais vulneráveis, como mulheres no período da gestação. A falta de carboidratos na dieta materna durante a gestação está associado com o retardo de crescimento intra-uterino e uma alta incidência de mortalidade pós-natal. A restrição de proteína materna durante esse período está associada a alterações no crescimento pós-natal, no comportamento alimentar, no metabolismo da glicose. A alimentação disponível na gestação e lactação desempenha um papel importante na determinação do fenótipo metabólico da prole. Objetivo: Estudar o efeito da concentração de proteínas presente em uma dieta hiperlipídica e com restrição de carboidratos no metabolismo de ratas Wistar adultas e suas ninhadas. Metodologia: O protocolo experimental foi aprovado pelo CEEA da UNIUBE (nº 0015/2010). Foram utilizadas 56 Ratas Wistar adultas, mantidas com ração ad libitum. Utilizou-se dieta comercial para ratos (C) e duas dietas experimentais restritas em carboidrato (±3,5%): EI - Dieta hiperlipídica (77%) normoprotéica (20%) e EII Dieta hiperlipídica (87%) hipoprotéica (10%). A paridade de filhotes vivos e a mortalidade ao nascer foram contabilizadas no dia do nascimento. O peso dos animais (mães e filhotes) e a ocorrência de óbitos na lactação foram monitorados semanalmente. Órgãos e tecidos foram analisados após procedimento histológico de rotina, com coloração pela Hematoxilina-Eosina. Os dados foram analisados no Programa GraphPad (Prism 4,0), com significância de p<0,05. Resultados e Discussão: A falta de carboidrato dietético compromete a capacidade reprodutiva de ratas, traduzindo a importância desse nutriente no atendimento às demandas metabólicas de energia para o desenvolvimento do feto. O peso pós-parto das ratas que receberam dieta EII diminui, indicando reservas energéticas menores. A evolução do peso das ratas durante a lactação comprova que a dieta EII não é suficiente para atender às demandas energéticas do período lactacional, o que sugere a utilização das reservas corporais como a fonte energética. O desenvolvimento de esteatose nas ratas EI e EII está relacionado com a oferta da dieta experimental na lactação. A área dos adipócitos dos grupos que receberam dieta EI ou EII na gestação e/ou lactação foi aumentada, sugerindo maior depósito de gordura nesses grupos. A dieta EII induziu a mortalidade dos filhotes, sugerindo que a restrição de carboidratos e proteínas afeta de modo significativo o desenvolvimento dos animais. A oferta da dieta experimental no período gestacional levou a um aumento do peso do fígado dos filhotes, sugerindo que a exposição do feto à dieta restrita em proteínas e carboidratos no período intra-uterino pode levar à esteatose hepática. A análise histológica do fígado dos filhotes de 21 dias confirma a indução de esteatose frente ao consumo da dieta EII. Conclusão: A alimentação de ratas com uma dieta hiperlipídica e restrita em carboidratos não atendeu às necessidades para o adequado desenvolvimento da gestação/lactação em ratos Wistar, mesmo quando adequada em relação ao nível de proteínas, alterando o seu metabolismo. Palavras chave: dieta hiperlipídica, concentração de proteínas, gestação/lactação, metabolismo, ratas.

18 ABSTRACT In the last decades there have been substantial changes in the lifestyle of man, including the increased caloric intake and reduction of physical activity. Obesity has become a worldwide epidemic, reaching people at all stages of life. Unhealthy eating habits are present at all stages of life cycle and may cause further harm to the most vulnerable population groups, such as pregnant women. The lack of carbohydrates in the diet during pregnancy is associated with intrauterine growth retardation and a high incidence of postnatal mortality. Maternal protein restriction during this period is associated with changes in postnatal growth, feeding behavior, and in the metabolism of glucose. The nourishment available during pregnancy and lactation periods plays an important role in the determination of metabolic phenotype of the baby. Objective: to study the effect of the concentration of proteins present in a high-fat diet with restriction of carbohydrates on the metabolism of adult Wistar rats and their offspring. Methodology: the experimental protocol was approved by the CEEA of UNIUBE (No. 0015/2010). 56 adult Wistar rats were used, being fed ad libitum. It was used a commercial diet for rats (C) and two experimental diets restricted in carbohydrates (± 3.5%): EI-High-Fat Diet (77%) normoproteic (20%) and EII High-Fat Diet (87%) hypoproteic (10%). The average of living offspring and birth mortality was recorded on the day of birth. The weight of the animals (mothers and offspring) and the occurrence of deaths during lactation were monitored weekly. Organs and tissues were analyzed after routine histological procedure, with staining by hematoxylin-eosin. The data were analyzed in the program GraphPad (Prism 4.0), with significance of p<0.05. Results and discussion: the lack of dietary carbohydrate endangers the reproductive capacity of rats, reflecting the importance of this nutrient in complying with the metabolic demands of energy for the developing fetus. The postpartum weight of rats that received diet EII decreased, indicating smaller energy reserves. The evolution of the weight of rats during lactation proves that diet EII is not enough to meet the energy demands of the lactation period, suggesting the use of body reserves as the energy source. The development of steatosis in EI and EII rats is related to the experimental diet offered during lactation. The area of adipocytes of groups that received diet EI or EII during pregnancy and/or lactation was increased, suggesting higher deposit of fat in those groups. The diet EII induced the mortality of offspring, suggesting that the restriction of carbohydrates and proteins significantly affects the development of animals. The experimental diet offered during the pregnancy period led to an increase in liver weight of the offspring, suggesting that exposure of the fetus to a protein and carbohydrate restricted diet during intrauterine period can lead to hepatic steatosis. Histological analysis of the livers of the 21-day-old offspring confirms the induction of steatosis caused by the consumption of the diet EII. Conclusion: feeding the Wistar rats with a high-fat diet restricted in carbohydrates does not meet needs for the proper development of their offspring during pregnancy and lactation, even when adequate in relation to the level of protein, as it changes their metabolism. Keywords: high-fat, protein concentration, pregnant/lactation, metabolism, rats.

19 SUMÁRIO I INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA HIPÓTESE II OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS III. MATERIAL E MÉTODOS LINHAGEM DE RATOS COMPOSIÇÃO DA DIETA Dieta Padrão (Balanceada) Dietas Experimentais DESENHO EXPERIMENTAL TRATAMENTO DOS ANIMAIS E CRUZAMENTO EUTANASIA DOS ANIMAIS DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DA DIETA Número de componentes da ninhada Peso dos animais Dosagens Bioquímicas Dosagem de Glicose Dosagem de Triglicérides Dosagem de Colesterol Dosagem de HDL Dosagem de LDL e VLDL Peso Relativo dos órgãos Desenvolvimento de Alterações Histopatológicas ANÁLISE ESTATÍSTICA NORMAS PARA REDAÇÃO DA DISSERTAÇÃO IV RESULTADOS RESULTADOS DO EFEITO DAS DIETAS NO METABOLISMO DAS RATAS NO PERÍODO GESTACIONAL E LACTACIONAL Taxa de Prenhez Ocorrência de ratas que pariram filhotes vivos Evolução do peso das ratas durante a gestação Ganho de peso absoluto e ganho de peso relativo das ratas na gestação Evolução do peso das ratas durante a lactação Ganho de peso absoluto e ganho de peso relativo das ratas na lactação... 56

20 4.1.7 Peso relativo dos órgãos das ratas ao final da lactação Fígado Rins Coração Tecido Adiposo Parâmetros bioquímicos das ratas Parâmetros plasmáticos de Glicose Parâmetros plasmáticos de Triglicérides Parâmetros plasmáticos de Colesterol total Parâmetros plasmáticos de Lipoproteína de Alta Densidade (HDL) Parâmetros plasmáticos de Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL) Parâmetros plasmáticos de Lipoproteína de Densidade Muito Baixa (VLDL) Parâmetros histológicos das ratas Parâmetros histológicos do Fígado Parâmetros histológicos do Tecido Adiposo RESULTADOS DO EFEITO DA DIETA NA NINHADA Nascidos Vivos Mortalidade ao nascer Mortalidade na lactação Peso ao nascer e evolução peso filhotes na lactação Peso relativo dos órgãos dos filhotes após lactação Fígado Rins Coração Tecido Adiposo Parâmetros bioquímicos dos filhotes após lactação Parâmetros plasmáticos de Glicose Parâmetros plasmáticos de Triglicérides Parâmetros plasmáticos de Colesterol total Parâmetros plasmáticos de Lipoproteína de Alta Densidade (HDL) Parâmetros plasmáticos de Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL) Parâmetros plasmáticos de Lipoproteína de Densidade Muito Baixa (VLDL) Parâmetros histológicos de filhotes Recém Nascidos e de 21 dias Parâmetros histológicos do fígado de filhotes Recém Nascidos Parâmetros histológicos do fígado de filhotes de 21 dias Parâmetros histológicos do tecido adiposo de filhotes 21 dias V DISCUSSÃO RESULTADOS DO EFEITO DA DIETA NAS RATAS Taxa de prenhez e Ocorrência de ratas que pariram filhotes vivos Evolução do peso das ratas durante gestação e ganho de peso absoluto e

21 relativo das ratas na gestação Evolução do peso e ganho de peso absoluto e relativo das ratas na lactação Peso Relativo dos órgãos das ratas Parâmetros bioquímicos das ratas Parâmetros histológicos das ratas RESULTADOS DO EFEITO DA DIETA NA NINHADA Filhotes nascidos vivos e Mortalidade ao nascer Peso ao nascer e Evolução do peso dos filhotes na lactação Peso relativo dos órgãos dos filhotes após lactação Parâmetros bioquímicos dos filhotes após lactação Parâmetros histológicos dos filhotes recém nascidos e de 21 dias VI CONCLUSÃO REFERÊNCIAS ANEXO

22 I. INTRODUÇÃO 1.1 REVISÃO DE LITERATURA Nas últimas décadas, ocorreram mudanças substanciais no estilo de vida do homem, entre as quais o aumento da ingestão calórica e redução da atividade física. Nesse sentido, este novo estilo de vida ultrapassou a capacidade de adaptação ao ambiente pelo genoma, tornando a obesidade uma epidemia mundial, atingindo pessoas de diferentes níveis socioeconômicos e em todas as fases da vida (HEBER, 2010). A incidência de obesidade (índice de massa corporal > 30 kg/m2) no Reino Unido e em todo o mundo aumentou acentuadamente na última década (SÉBERT et al, 2009). No Brasil, segundo dados divulgados pelo IBGE (2010), a incidência da obesidade é de 12,4% e 16,9% em homens e mulheres, respectivamente. O sobrepeso, por sua vez, atinge metade dos adultos em todas as regiões do país, com destaque para o Sul (56,8% dos homens, 51,6% das mulheres) e Sudeste (52,4 e 48,5% para homens e mulheres, respectivamente). O aumento exponencial na prevalência da obesidade e o consequente interesse dos pesquisadores em estudar essa doença permitiram a ampliação do seu conceito. Hoje, essa enfermidade pode ser definida como de origem multifatorial, resultante de fatores genéticos, fisiológicos, ambientais e psicológicos, proporcionando o acúmulo excessivo de energia sob forma de gordura no organismo (PEREIRA, FRANCISCHI e LANCHA JR, 2003). Recentes investigações associam a obesidade a outras doenças crônicodegenerativas, tais como: dislipidemia, hiperinsulinemia, diabetes mellitus tipo 2 (DM2), hipertensão, aterosclerose e mais recentemente a esteatose hepática não alcoólica e alguns

23 tipos de câncer que, em conjunto, contribuem para o aumento da morbimortalidade em todo o mundo (DÂMASO, 2009). A não aceitação do corpo leva muitas mulheres a cair na armadilha das dietas, e essa alienação quanto aos seus corpos é apoiada pela indústria do emagrecimento que perpetua os mitos acerca das dietas. Ao longo dos séculos, os padrões de beleza feminina mudaram. Na década de 60, já se sugeria que o culto à magreza seria um fator precipitante da anorexia nervosa e, nos anos 80, ocorreu um crescimento considerável do mercado relacionado à manutenção do corpo. Fazem parte desse arsenal industrial da sociedade de consumo: aparelhos de musculação, suplementos nutricionais, revistas sobre boa forma e saúde, regimes alimentares e cirurgias plásticas (SOUTO, FERRO-BUCHER, 2006). Propagandas televisivas, bem como as veiculadas em outdoors e nas inúmeras revistas femininas evidenciam a imposição de um padrão corporal que ignora os aspectos genéticos. Faz-se necessária, portanto, a remodelação desses valores, visto que muitas mulheres têm adoecido e algumas chegam à morte em busca da vida numa sociedade que defende a magreza a qualquer custo. Com isso, uma prática impositiva, como as dietas restritivas, não contribui para as mudanças necessárias, que devem ocorrer com a alteração do comportamento alimentar (SOUTO, FERRO-BUCHER, 2006). Hábitos alimentares não saudáveis estão presentes em todas as fases do ciclo vital e podem prejudicar ainda mais grupos populacionais mais vulneráveis, como mulheres no período da gestação. Entre os hábitos que promovem o ganho excessivo de peso está a ingestão de alimentos com alta densidade energética, os quais, em geral, são alimentos pobres em fibras, micronutrientes e água, e com alto teor de gordura, açúcar ou amido (MARTINS, BENICIO, 2011). O ganho de peso excessivo durante a gestação predispõe à obesidade pós-parto e às suas complicações. Segundo Martins, Benicio (2011), estudos evidenciam a associação

24 positiva entre o ganho ponderal excessivo na gestação e a retenção de peso por até três anos após o parto. A relação entre o maior consumo de calorias e a elevação do ganho ponderal na gestação já foi demonstrada na literatura desde a década de Atualmente, estudos buscam relacionar características e padrões alimentares durante a gestação com o ganho ponderal nesse período e a retenção de peso pós-parto. Segundo Oken et al (2007), hábitos alimentares não saudáveis, como maior freqüência de lanches (do tipo snacks) e menor número de refeições principais (almoço), estão associados à maior retenção de peso até um ano após o parto. A dieta materna durante a gravidez pode influenciar os resultados da gravidez e da infância, tais como: duração da gestação, crescimento fetal, defeitos de nascimento, préeclâmpsia, diabetes gestacional. A dieta, no primeiro trimestre gestacional, pode ser mais importante para o desenvolvimento e diferenciação de vários órgãos. A dieta também deve ser aquela ideal no momento da concepção, e as mulheres podem ser mais abertas a mudanças na dieta durante a gravidez do que em outras ocasiões. Qualidade da alimentação no primeiro trimestre também pode ser um prenúncio de qualidade da dieta ao longo da gravidez. Mudanças benéficas na dieta, se continuarem após a gravidez, podem trazer resultados positivos de longo prazo (RIFAS-SHIMAN et al, 2009). Ratos alimentados com uma dieta hiperproteica e hiperlipídica (55% de proteínas e 45% de lipídeos), e isenta de carboidratos, apresentaram menor ganho de peso corporal que os ratos alimentados com dieta apenas com baixo teor de carboidratos ou normoglicídica. A explicação é que dietas pobres em carboidratos levam a um menor peso corporal em decorrência de menor deposição de gordura, bem como de menor consumo de energia (PICHON et al, 2006; BORBA et al, 2011). Além disso, BORBA et al, (2011) apontam que a dieta HLP hiperlipidico-proteica com baixo teor de carboidratos, que em seres humanos é utilizada para perda de peso,

25 induz a um significativo ganho de massa corporal, com aumento do tecido adiposo em ratos, quando comparada a uma dieta balanceada. A dieta HLP causa esteatose hepática e alterações em parâmetros bioquímicos, que representam uma piora da condição de saúde dos animais. Portanto, as dietas hiperlipídico-proteicas, com objetivo de redução de peso corporal, embora eficazes segundo seus proponentes, podem levar a resultados contrários ao esperado. Muitos estudos epidemiológicos e clínicos prospectivos em humanos, associados a achados experimentais em animais, têm demonstrado que modificações na alimentação durante o desenvolvimento fetal podem ter um impacto substancial na saúde e podem causar doenças, incluindo o aparecimento da obesidade, diabetes e doença cardiovascular (SÉBERT et al, 2009). Vale destacar, ainda, que uma melhor compreensão da dieta materna e do meio nutricional intra-uterino pode proporcionar estratégias dirigidas para a redução da carga de doença renal posterior (SHARKEY et al, 2009). Tudo isso ocorre, porque as dietas alimentares produzem efeitos que atuam na bioquímica corporal e acúmulo de reservas, modificando morfologicamente vários órgãos, o que aparece não só em indivíduos adultos, mas também em recém-nascidos em que as mães tiveram suas dietas modificadas. Os estudos indicam, inclusive, que a dieta materna pode causar um imprinting metabólico nos fetos, ou seja, modificar a expressão de genes, contribuindo para que o metabolismo desse indivíduo seja modificado. Além disso, dietas de alto teor de lipídeos causam alterações metabólicas como hiperglicemia, resistência à insulina e esteatose hepática não alcoólica (BORBA et al, 2011). Um maior peso da mãe no início da gestação está associado com muitos resultados adversos na gravidez, inclusive maiores taxas de macrossomia fetal e diabetes gestacional (RIFAS-SHIMAN et al, 2009).

26 Os resultados do estudo de Tamashiro et al (2009) mostraram que tanto a qualidade quanto a quantidade da gordura da dieta materna, durante a última semana gestacional e durante a lactação, afetaram de forma diferencial o crescimento da prole e o perfil metabólico basal, bem como a produção e função endocanabinóide na prole neonatal. Além disso, os dados desses autores demonstraram que o estresse pré-natal e/ou uma dieta com alto teor de gordura, durante o período intra-uterino ou pós-natal, afeta a prole de maneira que aumenta a sua suscetibilidade à obesidade induzida por dieta e leva a consequências metabólicas adversas de forma secundária. A restrição energética tipicamente recomendada para redução de peso caracterizase por ter grande quantidade de carboidratos, limitada quantidade de gordura e moderada quantidade de proteína, o que significa, em termos percentuais, 15% de proteína, 55% de carboidrato e 30% ou menos de gordura. Todavia, a proporção ideal dos macronutrientes em dietas de emagrecimento é, atualmente, bastante discutida. Existem evidências de que as dietas com maior proporção de proteína e menor de carboidrato promovem maior perda de peso, maior redução de gordura corporal e menor perda de massa magra, quando comparadas às dietas convencionais. Nestas dietas a proporção de proteína recomendada pode variar entre 22% a 45% do valor energético total (PEDROSA, DONATO JÚNIOR, TIRAPEGUI, 2009). O aumento do conteúdo proteico na dieta geralmente reduz o consumo de energia e deposição de gordura. Diferentes estudos mostraram também a importância do carboidrato para a proporção de gordura, mais do que o conteúdo de gordura por si só na dieta para o desenvolvimento de adiposidade (PEDROSA, DONATO JÚNIOR, TIRAPEGUI, 2009). No estudo de Pichon et al (2006), ratos alimentados com uma dieta hiperproteica, normoglicídica e hipolipídica (55% proteína, 35% carboidrato e 10% de lipídeos) tiveram um ganho de peso menor e menos adiposidade do que o grupo com dieta normoproteica,

27 hiperglicídica e hiperlipídica. Este estudo confirma o efeito supressor de apetite da proteína e reforça a ideia do papel crucial da relação com o carboidrato/gordura no controle do metabolismo lipídico. Aumentando-se a quantidade de proteína na dieta, no contexto de um alto ou baixo teor lipídico, diminuiu-se a ingestão energética mais do que com uma dieta hiperglicídica e normoproteica. Além disso, uma dieta com altos teores de proteína e gordura e isenta de carboidratos não altera a ingestão energética. Como consequência, a redução da ingestão de alimentos é um efeito específico da proteína. O menor ganho de peso no grupo alimentado com uma dieta hiperproteica e hiperlipídica isenta de carboidratos (55% proteínas e 45% lipídeos), comparado com o do grupo que recebeu dieta hiperproteica, normoglicídica e hipolipídica, apesar de ingestão de alimento similar, poderia também ter ocorrido por um aumento subsequente da atividade gluconeogênica para compensar a ausência de carboidrato da dieta. Os resultados de Marsset-Baglieri et al (2004) sustentam o conceito de que um elevado teor lipídico da dieta não aumenta, necessariamente, a ingestão de energia e a adiposidade do corpo se a dieta é desprovida de carboidratos. Esses resultados também mostraram que 50% do teor de proteínas podem ajudar a preservar a massa corporal magra, em detrimento da adiposidade nos ratos que consomem alimentos ad libitum ou quando a restrição de energia não é drástica, mas nem o peso nem a composição corporal são afetados pela dieta quando é severa a restrição de energia. Ratos alimentados ad libitum, com apenas 30% de lipídeos em uma dieta que continha 56% de carboidratos, aumentaram a ingestão de energia e adiposidade mais do que animais que receberam dietas contendo até 50% ou 70% de lipídios, mas desprovidas de carboidratos. Isto demonstrou que o elevado teor lipídico de uma dieta, por si só, não é suficiente para promover a hiperfagia e obesidade. Assim, neste estudo, os autores sugerem

28 que carboidratos são necessários para estimular o efeito das gorduras alimentares na ingestão energética e adiposidade (MARSSET-BAGLIERI et al, 2004). Para esses autores, as dietas de restrição para perda de peso têm gerado grande interesse, quando a composição de macronutrientes é alterada, embora a ingestão calórica não seja especificada. Dietas com baixos teores de gordura e carboidrato, que são ricas em lipídeos e proteínas, mostraram-se como causa de uma redução na ingestão calórica ad libitum e de perda de peso significativa em seres humanos. A glicose tem sido considerada o principal combustível metabólico para o desenvolvimeto fetal em mamíferos e para o recém-nascido. Koski, Hill (1990) refere que a falta de carboidratos na dieta materna durante a gestação está associada com o retardo de crescimento intra-uterino e uma alta incidência de mortalidade pós-natal. Foi demonstrado em ratos que a presença de carboidratos na dieta materna é essencial para a produção de leite e a consequente manutenção da prole. Ratas alimentadas com uma dieta baseada em proteína (10 %), ácidos graxos (36%, como ácido oleico) e triacilglicerol (6%) não produziram leite quando os carboidratos não foram adicionados à dieta. Na concentração de 6% de carboidrato, a composição em carboidratos e lipídeos do leite produzido foi significativamente menor que a produzida por ratas alimentadas com dieta rica em carboidrato (62%) (KOSKI, HILL, LÖNNERDAL, 1990). Algumas alterações metabólicas foram avaliadas em ratos Wistar que receberam dieta com baixo teor de proteínas (6%) desde a gravidez até o final da lactação. Apesar do aumento na ingestão alimentar por ratas alimentadas com dieta hipoproteica na lactação, esses animais reduziram o peso corporal. A dieta hipoproteica reduziu a secreção de prolactina o que comprometeu a produção de leite e o crescimento dos filhotes (MORETTO et al, 2011).

29 Zambrano et al (2006), ao expor cobaias grávidas a uma dieta com baixo teor de proteínas (10%) durante a gestação e/ou lactação, concluiu que a restrição de proteína materna durante esse período altera o crescimento pós-natal, o comportamento alimentar, fisiologia da leptina, concentrações de colesterol, modifica o metabolismo da glicose e a resistência à insulina. A alimentação disponível na gestação e lactação desempenha um papel importante na determinação do fenótipo metabólico da prole. Os efeitos mais prováveis, a longo prazo, (por exemplo, aumento de gordura no tecido, colesterol elevado e resistência à insulina), ocorrem em filhotes cujas mães sofreram restrições durante a gestação. Para Weigle et al (2005), estudos dos efeitos de macronutrientes no balanço energético são obscurecidos pela incapacidade de variar a proteína dietética, carboidratos e teor de gordura independentemente uns dos outros. Esses autores descobriram que um aumento no teor de proteína dietética comparado ao observado em dietas populares de baixo teor de carboidratos, mas sem redução no teor de carboidratos da dieta, resultou em perdas rápidas de peso e gordura corporal. Esta mudança favorável na composição corporal é causada por uma constante queda de apetite e ingestão calórica ad libitum. É provável que uma redução da gordura dietética por 15% do total de energia contribuiu para a perda de peso no presente estudo. No entanto, uma maior redução de 20% de gordura dietética sem alteração das porcentagens de calorias provenientes da proteína produziu menor perda de peso. Weigle et al (2005) sugerem dois mecanismos pelos quais uma maior ingestão de proteína dietética pode promover um balanço energético negativo e perda de gordura corporal. O primeiro é a capacidade da proteína dietética de aumentar o gasto de energia. Este é um aumento pequeno, mas significativo, que pode depender da proporção relativa de proteínas animal e vegetal na dieta e é parcialmente resultado de uma maior

30 termogênese, induzida mais pela dieta após o consumo de proteína do que após consumo de carga calórica igual, de carboidratos ou gordura. O aumento da proteína dietética também indicou aumento do gasto total de energia diária em cobaias no balanço energético e diminuições da taxa metabólica de repouso e do total do gasto energético diário em indivíduos que seguem dietas de restrição. Burlamaqui et al (2011) observaram que a esteatose hepática ocorreu em uma proporção muito maior em animais que receberam uma alimentação hipercalórica e hiperlipídica (72,7%) do que em animais que receberam dieta controle (18,2% lipídeos). O risco de esteatose foi maior no grupo experimental, visto que peroxidação lipídica favorece o desenvolvimento de DHNA (Doença hepática não-alcoólica). DHNA é o tipo mais comum de lesão hepática crônica em muitos países. Manifestações variam de esteatose simples para esteato-hepatite não-alcoólica (DHNA) à fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular. A prevalência de DHNA, atualmente entre 15% e 40% em populações ocidentais e entre 9% e 40% em populações asiáticas, aumentou dramaticamente ao longo dos últimos 15 anos, principalmente em razão da sua associação com as duas maiores epidemias atuais do mundo: a obesidade e o diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (BURLAMAQUI et al, 2011). A patogênese da DHNA não é completamente compreendida, mas a resistência à insulina, estresse oxidativo e inflamação desempenham um papel importante no desenvolvimento e na progressão da doença. Além disso, níveis anormalmente elevados de ácidos graxos livres em circulação têm sido correlacionados com a gravidade da DHNA. (BURLAMAQUI et al, 2011). Picchi et al (2011) submeteram ratas Wistar a uma dieta hiperlipídica e com baixo teor de carboidratos. Os ratos que consumiram uma dieta rica em gordura (HF) ingeriram uma quantidade menor de alimentos, em contraste com a hipótese de que dietas com

31 elevado teor de gordura promovem hiperfagia em roedores. Observou-se que a dieta de elevado teor de gordura não induziu maior ganho de peso, mas conduziu a um maior ganho de gordura hepática. No homem, o consumo de uma dieta de HF por tempo prolongado pode conduzir a uma maior formação de placas de ateroma, já que a gordura da dieta primeiro atinge a circulação antes de se acumular no fígado (PICCHI et al, 2011). A dieta hiperlipídica permite caracterizar o desenvolvimento da obesidade e a avaliação das intervenções antiobesidade num ambiente experimental in vivo, fisiopatologicamante muito semelhante à doença humana. Isto contribuiu imensamente para a compreensão da obesidade e da resistência à insulina provenientes da dieta e muitos conceitos fisiopatológicos no campo, por exemplo, a importância da deposição de gordura hepática, a interação entre inflamação e resistência à insulina (BUETTNER, 2007).

32 1.2 HIPÓTESE A hipótese do presente trabalho é que a alimentação de ratas com uma dieta hiperlipídica e restrita em carboidratos não atende às necessidades para o adequado desenvolvimento da gestação/lactação, mesmo quando adequada em relação ao nível de proteínas.

33 II. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL O objetivo geral do presente trabalho foi estudar o efeito da concentração de proteínas presente em uma dieta hiperlipídica e com restrição de carboidratos no metabolismo de ratas Wistar adultas e suas ninhadas. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Os objetivos específicos compreenderam a determinação do efeito de duas dietas hiperlipídicas com diferentes concentrações proteicas nos seguintes parâmetros: peso das mães durante a gestação e lactação. número de componentes da ninhada no nascimento e ao final da lactação. peso da ninhada (no nascimento e ao final da lactação). parâmetros bioquímicos (glicemia, trigliciridemia, colesterol total e frações - HDL, LDL e VLDL) das mães e seus filhotes ao final da lactação. parâmetros anatômicos (peso de fígado, coração, rins, tecido adiposo) das mães e de seus filhotes. parâmetros histopatológicos do fígado e tecido adiposo das mães e de seus filhotes (no nascimento e ao final da lactação).