Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Ciencias Morfológicas

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3 Universidade de Santiago de Compostela Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Ciencias Morfológicas ESTUDIO ULTRASTRUCTURAL E IMUNOHISTOQUÍMICO DE LOS MIOFIBROBLASTOS DE LA CAVIDAD ORAL TESIS DOCTORAL MARCO ANDRÉ MELO DE SOUSA NICOLAU MARTINS Director: Professor Doutor Juan Suárez Quintanilla Co-director: Professor Doutor Fernando Jorge Neves Ferreira SANTIAGO DE COMPOSTELA ISBN (Edición digital PDF)

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5 DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS Facultad de Medicina y Odontología Hospital Clínico Universitario c/ San Francisco, s/n Santiago de Compostela D. Juan Antonio Suárez Quintanilla, Doctor en Medicina y Cirugía, profesor Titular del Departamento de Ciencias Morfológicas de la Universidad de Santiago y D. Fernando Jorge Neves Ferreira, Doctor en Odontologia, profesor Titular del Departamento de Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica da Cooperativa de Ensino Superior Politécnico e Universitário CERTIFICAN: Que el trabajo titulado ESTUDO ULTRASTRUTURAL E IMUNOHISTOQUÍMICO DOS MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL, presentado por D. Marco André Melo de Sousa Nicolau Martins para optar al Grado de Doctor en Odontologia, há sido realizado bajo nuestra dirección. Revisado el mismo, quedamos conformes com su presentación para ser juzgado como Tesis Doctoral por el correspondiente tribunal. Para que conste a los efectos oportunos, firmamos el presente certificado en Santiago de Compostela, a 2 de Septiembre. Fdo.: Prof. Juan Suárez Quintanilla Fdo.: Prof. Fernando Ferreira Doutorando: Marco André Melo de Sousa Nicolau Martins

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7 ESTUDIO ULTRASTRUCTURAL E IMUNOHISTOQUÍMICO DE LOS MIOFIBROBLASTOS DE LA CAVIDAD ORAL Marco André Melo de Sousa Nicolau Martins 2010

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9 Agradecimentos Aos Professores Doutores Juan Suarez Quintanilha e Fernando Jorge Neves Ferreira pela sua disponibilidade, ensinamentos e conselhos que foram imprescindíveis na execução desta Tese. Ao Departamento de Ciências Morfológicas da Faculdade de Medicina e Odontologia da Universidade de Santiago de Compostela que me aceitaram no seu Programa de Doutoramento e por toda a atenção que recebi. À Universidade de Barcelona, Instituição de acolhimento para o inicio dos trabalhos de Doutoramento, na pessoa da Professora Doutora Cristina Manzanares. À C.E.S.P.U. (Cooperativa de Ensino Superior Politécnico e Universitário) por todo o apoio institucional, pela ajuda, motivação, confiança e empenhamento de todos os colegas membros dos Órgãos Sociais, para que fossem ultrapassadas todas as dificuldades ao longo da preparação deste trabalho.

10 À Direcção do Instituto Politécnico de Saúde - Norte, ao Conselho Cientifico, ao Conselho Pedagógico. Ao Professor Doutor António Manuel de Almeida-Dias, Presidente do Instituto Politécnico de Saúde Norte, pela motivação que sempre me transmitiu para a importância da realização da Tese de Doutoramento. Ao Departamento de Ciências Dentárias, na pessoa do seu director, Professor Doutor Joaquim Moreira, pelo seu apoio e sua disponibilidade. Ao Dr. Fernando Figueira, Director do Serviço de Estomatologia e Medicina Dentária do Hospital Senhora da Oliveira Guimarães, pelo seu apoio e principalmente pela sua amizade. Ao Departamento de Anatomia Patológica Citológica e Tanatológica do Instituto Politécnico de Saúde - Norte, por toda a dedicação e vontade que sempre demonstraram em colaborar neste trabalho. Ao Luís Monteiro, amizade mais recente sem dúvida, mas também ele sempre que sentiu a minha necessidade de ajuda, de pronto me dedicou toda a atenção necessária. Ao Fernando Ferreira, pois desde a primeira hora me dedicou toda a sua experiencia, conhecimento e amizade, o que permitiu a elaboração deste trabalho. À Filomena Salazar, de difícil descrição todas as lutas que temos travado juntos, mas sem dúvida indicador que a nossa amizade é e será sempre impenetrável. Ao Professor Almeida Dias, meu Mestre, aquele que sempre se impõe, não criando obrigatoriedades, mas pelo reconhecimento que se lhe tem. À minha Madrinha, sustento de coesão nos momentos mais difíceis.

11 À minha Avó, Maria Beatriz Nicolau, que infelizmente não teve o prazer de assistir a este momento da minha vida. Ao meu Pai, por todo o apoio, dedicação e incentivo no decorrer da minha vida pessoal e profissional. À minha Mãe, pela aposta contínua e difícil a que se dedicou desde à 38 anos e que com este trabalho vê realizar um dos seus sonhos - Obrigado minha Mãe. A ti Ana, mulher que me trouxe a felicidade que poucos conseguem alcançar, ou seja, amar e ser amado. A todos os meus amigos e colegas que me apoiam demonstrando a sua verdadeira amizade.

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13 Ao meu filho Diogo André, pois ver o seu crescer dá-me alento para concretizar a mais difícil das tarefas.

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15 Índice ABREVIATURAS RESUMO ABSTRACT RESUMEN INTRODUÇÃO OBJECTIVOS FUNDAMENTOS TEÓRICOS ORIGEM DOS MIOFIBROBLASTOS FACTORES DE CRESCIMENTO DIFERENCIAÇÃO MIOFIBROBLÁSTICA SISTEMAS DE ADESÃO DOS MIOFIBROBLASTOS INIBIÇÃO MIOFIBROBLÁSTICA PATOLOGIA COM ENVOLVIMENTO DE MIOFIBRO-BLASTOS MIOFIBROBLASTOS NA CICATRIZAÇÃO FIBROSE PULMONAR MIOFIBROBLASTOS NAS NEOPLASIAS MIOFIBROBLASTOS NA FIBROSE HEPÁTICA MIOFIBROBLASTO NA PATOLOGIA CARDÍACA MIOFIBROBLASTOS E A CAVIDADE ORAL MIOFIBRIBLASTOS E PATOLOGIAS CAVIDADE ORAL FIBROMATOSE GENGIVAL HEREDITÁRIA CICATRIZAÇÃO DE LESÃO DO PALATO MIXOMA ODONTOGÉNICO CARCINOMA ESPINO CELULAR (CEC) MATERIAL E MÉTODOS CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA AVALIAÇÃO CLÍNICA TÉCNICA DE COLHEITA

16 4.4. FIXAÇÃO PROCESSAMENTO PROCESSAMENTO DOS TECIDOS PARA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA PROCESSAMENTO DOS TECIDOS EM HISTOQUÍMICA Coloração de Hematoxilina Eosina Tricrómio de Masson Especial Van Gieson TÉCNICA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA OBSERVAÇÃO E FOTOGRAFIA ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DO GRUPO I AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DO GRUPO II AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DO GRUPO III DISCUSSÃO CONCLUSÕES BIBLIOGRAFIA

17 Índice de figuras FIGURA 1 - FIBROBLASTOS GENGIVAIS. HE X20 (SETAS) FIGURA 2 - FIBROBLASTOS GENGIVAIS. HE X40 (SETA) FIGURA 3 - FIBROBLASTOS GENGIVAIS. TRICRÓMIO DE MASSON 20X FIGURA 4 - TRANSIÇÃO EPITÉLIO-CONJUNTIVO. HE X 20. VASOS (SETAS) FIBROBLASTOS E COLAGÉNIO (RECTÂNGULOS) FIGURA 5 - TECIDO CONJUNTIVO GENGIVAL. TRICRÓMIO DE MASSON X 20. FIBROBLASTO (SETA) FIGURA 6 - TECIDO CONJUNTIVO GENGIVAL. VAN GIESON X FIGURA 7 - TECIDO CONJUNTIVO GENGIVAL. REGIÃO VESTIBULAR. VAN GIESON X FIGURA 8 - TECIDO CONJUNTIVO GENGIVAL. VAN GIESON X FIGURA 9 - TRANSIÇÃO EPITÉLIO-CONJUNTIVA. HE X FIGURA 10 - TRANSIÇÃO EPITÉLIO-CONJUNTIVA. REGIÃO VESTIBULAR. TRICRÓMIO DE MASSON X FIGURA 11 - GENGIVA ADERIDA. REGIÃO VESTIBULAR. HE X FIGURA 12- GENGIVA ADERIDA. REGIÃO VESTIBULAR. HE X FIGURA 13 - INTERDIGITAÇÕES EPITÉLIO-CONJUNTIVAS. GENGIVA ADERIDA DA REGIÃO VESTIBULAR DO DENTE 46. HE X FIGURA 14 - INTERDIGITAÇÕES EPITÉLIO-CONJUNTIVAS. GENGIVA ADERIDA DA REGIÃO VESTIBULAR DO DENTE 46. TRICRÓMIO DE MASSON X FIGURA 15 - MIOFIBROBLASTOS DA REGIÃO VESTIBULAR. ACTINA X40(SETA) FIGURA 16 - MIOFIBROBLASTOS DA REGIÃO VESTIBULAR. ACTINA X FIGURA 17- MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL. ACTINA X FIGURA 18 - MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL. P63 X FIGURA 19 - MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL. P63 X FIGURA 20 - MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL. VIMENTINA X FIGURA 21 - MIOFIBROBLASTOS FORTEMENTE POSITIVOS FIGURA 22 - BIÓPSIA DE GENGIVA ADERIDA. ACTINA X FIGURA 23 - BIÓPSIA DE GENGIVA ADERIDA. P63 X FIGURA 24 - MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL. ACTINA X FIGURA 25 - MIOFIBROBLASTOS DE GENGIVA ADERIDA. P63 X FIGURA 26 - MIOFIBROBLASTOS DE GENGIVA ADERIDA. VIMENTINA X FIGURA 27 - MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL. ACTINA X

18 FIGURA 28 - LEUCOPLASIA DA CAVIDADE ORAL. VIMENTINA X FIGURA 29 - CARCINOMA PAVIMENTOSO DA CAVIDADE ORAL FIGURA 30 - CARCINOMA PAVIMENTOSO DA CAVIDADE ORAL FIGURA 31 - COLAGÉNIO (X ) FIGURA 32 - FIBROBLASTO GENGIVAL (25.000X) FIGURA 33 - MIOFIBROBLASTO (12.000X) FIGURA 34 - MIOFIBROBLASTO (10.000X) FIGURA 35 - FIBROBLASTO GENGIVAL (X ) FIGURA 36 - FIBROBLASTO GENGIVAL (X ) FIGURA 37 - COLAGÉNIO (50.000X) FIGURA 38 - COLAGÉNIO (20.000X)

19 Índice de gráficos GRÁFICO 1 - DISTRIBUÍÇÃO POR GÉNEROS DA AMOSTRA ESTUDADA (N=90) GRÁFICO 2 - DESCRIÇÃO DA FREQUÊNCIA DEPENDENDO DA IDADE DO PACIENTE GRÁFICO 3 - DISTRIBUIÇÃO POR IDADES NOS DIFERENTES GRUPOS GRÁFICO 4 - DISTRIBUIÇÃO DOS GRUPOS DE ESTUDO GRÁFICO 5 - DISTRIBUIÇÃO ETÁRIA GRÁFICO 6 - DISTRIBUIÇÃO DOS GRUPOS EM FUNÇÃO DO GÉNERO GRÁFICO 7 - CARACTERIZAÇÃO DO MARCADOR P63 NOS GRUPOS I, II E III GRÁFICO 8 - CARACTERIZAÇÃO DO MARCADOR DESMINA NOS GRUPOS I, II E III GRÁFICO 9 - CARACTERIZAÇÃO DO MARCADOR ACTINA NOS GRUPOS I, II E III GRÁFICO 10 - CARACTERIZAÇÃO DO MARCADOR VIMENTINA NOS GRUPOS I, II E III GRÁFICO 11- IMUNOMARCAÇÃO EM FUNÇÃO DOS TRÊS GRUPOS ESTUDADOS

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21 Índice de tabelas TABELA 1 - CARACTERIZAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO GRUPO I TABELA 2 - CARACTERIZAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO GRUPO II TABELA 3 - CARACTERIZAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO GRUPO III TABELA 4 - CARACTERIZAÇÃO DOS INDIVÍDUOS DOS GRUPOS I, II E III

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23 Abreviaturas FN: Factor de crescimento derivado das plaquetas. IFN: Interferão. TGF: Factor de transformação do crescimento. mrna: RNA mensageiro. ADN: Ácido desoxirribonucleico TNF: Factor de necrose tumoral. EGF: Factor de crescimento epidérmico. IGF: Factor de crescimento insulínico. CTGF: Factor de crescimento do tecido conjuntivo. MMP: Metaloproteinases. FAP: Proteína de activação fibroblástica. KGF: Factor de crescimento de queratinócitos. TIMP: Factor Inibidor de metaloproteinases. ANG II: Angiotensina II. 21

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25 Resumo 1. INTRODUÇÃO Os miofibroblastos são células que expressam a isoforma - actina da célula muscular lisa. Estas células demonstram características intermediárias entre fibroblastos e células musculares lisas, no entanto apresentam morfologia similar aos fibroblastos. Miofibroblastos foram também denominados de fibroblastos peri-tumorais, fibroblastos associados ao carcinoma e fibroblastos activos do estroma, mas hoje são mais trivialmente chamados de miofibroblastos. Estão presentes como uma pequena subpopulação celular em quase todos os órgãos e são capazes de expressar e secretar uma extensa quantidade de citoquinas, factores de crescimento, quimiocinas, hormonas, neurotransmissores, mediadores inflamatórios, proteínas de adesão e proteínas da MEC - matriz extra-celular. Os miofibroblastos são também responsáveis pela produção acentuada de material colagenar, metaloproteinases, gelatinases, glicosaminoglicanos e factores de crescimento hepatocíticos e queratinocíticos. Uma vez que o miofibroblasto manifesta a capacidade para expressar níveis elevados de citoquinas, matriz extracelular e -actina do músculo liso, desempenha papéis importantes na inflamação, deposita tecido conjuntivo, r, esperando-se que estes possam contribuir para a resposta fibrótica através dos respectivos fenótipos característicos. Os miofibroblastos são caracterizados morfologicamente como células alongadas, fusiformes ou estreladas com núcleo regular e central. Apresentam um proeminente citoplasma de microfilamentos de actina (fibras de stress), um retículo endoplasmático bem desenvolvido e estão conectados uns aos outros 23

26 através de aderências e junções do tipo gap junctions. Estas células também estabelecem contactos com os componentes da matriz extracelular através de fibronexus, que é um complexo transmembranar formado por actina, integrina e fibronectina. Miofibroblastos são identificados através da expressão de -SMA Este marcador citoplasmático é encontrado adicionalmente noutros 2 tipos celulares: células musculares lisas e células mioepiteliais. A presença de outros marcadores como laminina, desmina, calponina, miosina de músculo liso, caldesmonina e proteína de activação de fibroblastos tem sido utilizada para caracterizar os miofibroblastos, mas o padrão de expressão é variável e dependente principalmente da origem, localização e condição patológica. Então, SMA é o melhor marcador celular para identificação dos miofibroblastos, permitindo monitorizar e identificar o comportamento destas células em situações clínicas e patológicas. Estas células podem ser encontradas em inúmeras situações, participando tanto em processos fisiológicos quanto patológicos. Os miofibroblastos contribuem para o crescimento e diferenciação dos tecidos e órgãos, através de interacções com células epiteliais, desempenhando também um importante papel no processo de reparo, através da retracção do tecido de granulação e da síntese de MEC, incluindo colágeno, fibronectina e proteoglicanos. Contudo, se estas células persistirem, uma quantidade excessiva de colágeno é produzida, resultando em desordens fibróticas, como quelóide e fibroses hepáticas. 24

27 2.OBJECTIVOS Neste trabalho, foram observadas diferentes formas de expressão imunocitoquímica, em diversos ambientes clínicos. O objectivo foi estabelecer uma escala gradual de expressão biológica com elevada aplicabilidade no contexto clínico ao nível do diagnóstico das principais patologias da cavidade oral. Assim, são objectivos deste trabalho: 1. Caracterizar uma amostra das principais patologias da cavidade oral; 2. Avaliar a expressão fenotípica dos miofibroblastos nas principais patologias da cavidade oral, através de um painel de anticorpos: - actina, desmina, vimentina e P63; 3. Relacionar a intensidade da imunomarcação com a severidade das principais lesões da cavidade oral. 25

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29 3.MATERIAL E MÉTODOS 3.1.CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA A amostra estudada abrange 90 indivíduos, da consulta de Medicina Dentária do Hospital Senhora da Oliveira Guimarães, a Norte de Portugal, entre os anos de 2003 e A todos os indivíduos foi aplicado um protocolo de trabalho, previamente definido, onde se registaram os principais elementos da sua identificação, história clínica e localização exacta da colheita. Nos indivíduos dos grupos I e II foram ainda registados os elementos relativos às patologias diagnosticadas. 3.2.AVALIAÇÃO CLÍNICA A avaliação clínica foi feita através de uma anamnese e de um exame objectivo. Na anamnese, foi elaborado um questionário sobre as principais patologias locais e sistémicas, presentes ou passadas, hábitos e terapêuticas. No exame objectivo foi efectuada uma observação clínica intra e extraoral. No exame extraoral, foram despistadas as principais alterações esqueléticas, de pele e mucosas. No exame intraoral, foram avaliadas as mucosas de revestimento, mastigatória e especializada. Foram ainda observadas as principais inserções de freios, tumefações, pigmentações endógenas e exógenas dos tecidos moles e duros. Procedeu-se ao preenchimento de uma ficha clínica periodontal para os respectivos registos. severidade. 27 O diagnóstico de periodontite teve por base o índice de extensão e

30 As diferentes patologias da cavidade oral tiveram por base os diagnósticos anátomo-patológicos. Após a avaliação clínica e histopatológica, os indivíduos foram distribuídos pelos respectivos grupos de estudo da seguinte forma: - Grupo I: foram aqui colocados todos os indivíduos que não apresentaram qualquer patologia sistémica ou localizada. Clinicamente foram classificados como clinicamente saudáveis e serviram como grupo de controlo. - Grupo II: foram aqui colocados todos os indivíduos que não apresentaram qualquer patologia sistémica mas evidenciaram perda de inserção clínica de leve a moderada. Clinicamente foram classificados como indivíduos com periodontite leve a moderada e sendo classificados como grupo de periodontite. A classificação leve a moderada foi baseada na classificação de Armitage, Grupo III: foram aqui colocados todos os indivíduos que apresentaram outras patologias da cavidade oral, previamente diagnosticadas. Clinicamente foram classificados de acordo com as diferentes patologias e serviram como base de referência para o estudo comparativo com os outros dois grupos. As patologias estudadas foram: leucoplasia, carcinoma espinocelular, líquen plano, fibroma, hiperplasia fibro-epitelial, epúlide fibrosa e epúlide granulomatosa. 3.3.TÉCNICA DE COLHEITA Os tecidos foram colhidos em ambiente asséptico, pela técnica de biopsia convencional, ao nível da região vestibular dos 3º e 4º quadrantes, na 28

31 transição entre a gengiva livre e gengiva aderida com tamanhos que oscilaram entre os 2x2mm e os 10x5mm.Todas as biópsias foram efectuadas com anestesia locoregional à base de lidocaína a 2%, após consentimento prévio do paciente obtido por escrito de forma esclarecida e voluntária, em modelo próprio, aprovado pela comissão de ética do Hospital Senhora da Oliveira Guimarães. 3.4.FIXAÇÃO Todos os tecidos estudados em microscopia óptica foram fixados com formaldeído tamponado a 10%, numa quantidade de correspondeu a pelo menos dez vezes o volume do tecido fixado. Os tecidos estudados em microscopia óptica foram fixados em tampão cacodilato de sódio a 0,1 M (ph 7,4). Em alguns casos foi feito o processamento directo a partir da fixação para microscopia óptica. 3.5.PROCESSAMENTO Processamento dos tecidos para microscopia electrónica A partir das amostras incluídas em blocos de parafina, efectuou-se uma selecção da área de maior interesse, a qual foi removida, cuidadosamente, com ajuda de um bisturi. O fragmento foi cortado em pequenos pedaços e colocados em xilol durante 24 horas de modo a remover toda a parafina. Seguiu-se uma hidratação numa série decrescente de álcool com passagens de 1 hora em etanol a 100% e de 30 minutos em etanol a 90% e 70%, sempre com duas mudanças para cada álcool. 29 De seguida, os fragmentos foram mergulhados em tampão cacodilato de sódio a 0,1 M (ph 7,4) durante 1 hora e 30 minutos, fazendo mudanças do

32 tampão a cada 30 minutos. Seguiu-se a etapa de pós-fixação durante 1 hora (a 4ºC) com tetróxido de ósmio a 1%, em tampão cacodilato de sódio a 0,1 M (ph 7,4). Posteriormente, efectuou-se uma desidratação numa série ascendente de álcool, com passagens de 10 minutos por soluções de etanol a 50%, 75%, 90% e 95%, sempre à temperatura de 4ºC, seguidas de três passagens, também de 10 minutos cada, em etanol absoluto. Na última mudança de etanol absoluto o processamento passou a ser à temperatura ambiente. Seguiram-se mais duas passagens, de 10 minutos cada, mas agora por óxido de propileno. A impregnação das amostras na resina de inclusão consistiu em submeter os fragmentos em misturas de óxido de propileno e uma resina tipo Epoxy (Epon ) nas proporções de 3:1, 1:1 e 1:3, respectivamente, com a duração de 1 hora em cada mistura. Finalmente os fragmentos foram mergulhados em Epon puro, no qual ficaram durante 1 hora à temperatura ambiente e durante 30 minutos a 50ºC. Seguiu-se a inclusão, realizada em moldes de borracha os quais, depois de preenchidos com um fragmento em cada extremidade e cheios com Epon, foram colocados na estufa à temperatura de 60ºC durante 2 dias para polimerização da resina. Os cortes ultrafinos foram obtidos com uma faca de diamante, num ultramicrótomo (Leica Ultracut ), e recolhidos em grelhas de cobre com 200 mesh. Uma dupla contrastação dos cortes foi efectuada manualmente, tendo-se emergido, primeiramente, as grelhas com os cortes uranilo durante 20 minutos e posteriormente, numa solução de citrato de chumbo durante 10 minutos. A observação foi feita num microscópio electrónico de transmissão JEOL 100CXII, no qual foram efectuados registos de algumas imagens sob a forma de microfotografias. 30

33 3.5.2.PROCESSAMENTO DOS TECIDOS EM HISTOQUÍMICA Coloração de Hematoxilina Eosina A coloração de Hematoxilina-Eosina foi usada em todos os tecidos estudados como primeira coloração. É o principal método histoquímico efectuado na rotina histopatológica, acompanhando sempre técnicas complementares de diagnóstico como a imunohistoquímica. É utilizada por ser aquela que nos oferece uma relação núcleo-citoplasma mais fidedigna e por ser a que melhor demonstra a arquitectura tecidular, sendo uma técnica capaz de demonstrar os principais elementos tecidulares: o núcleo, o citoplasma e o colagénio. Procedimento técnico: Os tecidos foram preparados tendo por base o protocolo aferido pelo laboratório de Anatomia Patológica e seguiu os passos que a seguir se descrevem: Os tecidos foram submetidos a três banhos sucessivos em xilol, estando precisamente 10 minutos em cada banho. Em seguida, os tecidos foram hidratados passando para tal por uma série descrescente de álcoois, respectivamente a 100%, 95%, 80%, 50% e finalmente colocados em água. Depois de lavados, foram corados pela hematoxilina durante 3 minutos, e novamente lavados em água para serem de seguida colocados no Ácido Clorídrico para diferenciação. Seguidamente foram lavados em água corrente durante 10 minutos e posteriormente corados pela eosina durante 3 minutos. Depois de corados pela eosina, os cortes foram lavados, removidos os excessos de corante e depois secos em estufa durante 10 minutos. Depois de secos os cortes, procedeu-se à montagem em meio resinoso (Entellan ). 31

34 Tricrómio de Masson Especial Esta coloração especial foi particularmente importante na identificação das fibras de colagénio e sua localização, para a compreensão de processos patológicos associados aos miofibroblastos, como a expressão do tecido conjuntivo no processo de reparação, e padronização das alterações histológicas em resposta a agressões físicas ou químicas. Procedimento: Foi feita inicialmente uma desparafinação a que se seguiu a hidratação e lavagem. Os tecidos foram passados por água destilada e corados com azulceleste durante 5 minutos. De seguida, os cortes foram escorridos e corados os núcleos com Hematoxilina de Gill durante 5 minutos. Cobriram-se com álcool-pícrico durante 5 minutos e depois foram abundantemente lavados com água corrente. Depois de bem lavados, foram corados durante 5 minutos pela solução Ponceau-Fucsina. Lavaram-se de seguida com água destilada e colocaram-se no mordente Ácido Fosfomolíbdico 1% durante 5 minutos. Foram novamente lavados com água destilada e corados pelo azul de anilina num tempo que variou entre 2 a 5 minutos. Finalmente e após nova lavagem em água destilada foram desidratados os tecidos, diafanizados e posteriormente montados em meio de montagem resinoso. Os resultados encontrados nos diferentes cortes foram de acordo com a técnica clássica, ou seja, os núcleos coraram de azul-escuro, o colagénio de azul, as fibras musculares de vermelho, os eritrócitos de amarelo a laranja, os citoplasmas de vermelho, as estruturas nervosas de azul e o fibrinogénio de vermelho escuro. 32

35 3.5.3.TÉCNICA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA Os tecidos estudados foram submetidos a uma técnica imunohistoquímica para avaliação da presença de actina, vimentina, desmina e p63 utilizando os anticorpos NCL SMA, NCL-L-VIM-572, NCL-DESM-DERII e NCL-p63 (mouse monoclonal antibody, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK), respectivamente. Para este efeito, as lâminas com cortes histológicos foram desparafinadas durante 20 minutos em xilol e hidratadas numa série decrescente de álcoois até à água (álcool 100 % 5 minutos, álcool 100% 5 minutos, álcool 70% 5 minutos, álcool 50% 5 minutos e água corrente 5 minutos). As amostras utilizadas foram fixadas com formaldeído tamponado a 10% e incluídas em parafina. O processo de fixação de tecidos em formaldeído proporciona a formação de ligações cruzadas que mascaram os epítopos antigénicos. Assim sendo, alguns anticorpos requerem recuperação antigénica para detectar o seu epítopo antigénico específico. Nesta série, com os anticorpos anti-vimentina e anti-actina não foi necessário proceder à recuperação antigénica visto que estes anticorpos detectam os seus epítopos antigénios específicos sem que seja necessário quebrar as ligações cruzadas provocadas pela fixação em folmaldeído. No entanto, para a detecção dos epítopos antigénicos p63 e desmina, foi necessário realizar a recuperação antigénica utilizando altas temperaturas. Neste trabalho, a recuperação antigénica foi efectuada com uma solução comercial (RA Epitope Retrival Solution ph6, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK) semelhante à solução de tampão citrato original (10mM, ph=6,0), em banhomaria a 98ºC durante 30 minutos. O sistema de detecção utilizado para a reacção de imuno-histoquímica foi um kit de detecção com polímero de peroxidase (Novolink Polymer Detection System, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK), sendo que a detecção dos diferentes tipos de anticorpos foi efectuada seguindo 33

36 as instruções do fabricante deste sistema de detecção: Bloqueio da Peroxidase endógena com a Peroxidase Block, durante 5 minutos; Inibição das reacções inespecíficas com Protein Block, durante 5 minutos; incubação dos anticorpos primários (anti-actina, diluição 1/200 e incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente; anti-desmina, diluição 1/50 e incubação à temperatura ambiente durante 60 minutos; anti-vimentina, diluição de 1/200 e incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos; anti-p63, diluição 1/10 e incubação à temperatura ambiente durante 60 minutos); incubação do reagente Post Primary Block, durante 30 minutos; Incubação com Polymer, durante 30 minutos; revelação com DAB, durante 5 minutos. Após a marcação imunohistoquímica, os cortes histológicos foram contrastados com Hematoxilina, durante 2 minutos, desidratados numa se série crescente de álcoois (álcool 50 % durante 2 minutos, álcool 80% durante 2 minutos, álcool 95% durante 2 minutos, duas vezes álcool 100% durante 2 minutos), diafanizados em xilol e montados. A precisão da técnica de imuno-histoquímica depende da obtenção de uma marcação altamente específica prevenindo a reacções inespecífica do anticorpo primário no tecido. Na imuno-histoquímica é necessário assegurar que cada anticorpo é utilizado na diluição apropriada, não evapore durante a incubação e que seja removido completamente, se não estiver ligado, antes que o próximo reagente seja adicionado. Por esta razão em cada ensaio realizado foram incluídos lâminas com cortes histológicos de tecidos com presença dos epítopos antigénicos em questão e, antes da realização da técnica, procedeu-se à padronização das condições mais adequadas, adaptando-se para cada anticorpo primário, a utilização de recuperação antigénica e o tempo de incubação, temperatura e diluição do anticorpo primário. A técnica foi realizada em câmara húmida e cada corte foi isolado com caneta hidrofóbica. Em cada reacção, foram incluídos cortes histológicos de apêncide íleo-cecal como controlo positivo para o anticorpo anti-actina, antidesmina e anti-vimentina, e cortes histológicos de próstata como controlo positivo para o anticorpo anti-p63. 34

37 4.DISCUSSÃO E CONCLUSÕES O fenótipo do músculo liso que apresenta as células mioepiteliais, é demonstrado pela marcação positiva para a actina da célula muscular lisa. Estes marcadores, em especial a -actina são determinantes para a identificação dos miofibroblastos num estroma complexo e por vezes desmoplásico. No contexto da doença periodontal é frequente a expressão fenotípica da -actina por parte dos miofibroblastos, particularmente ao nível da gengiva aderida. A marcação do citoesqueleto é igualmente positiva para os filamentos de vimentina e desmina. A sua expressão é evidente, no entanto, inferior à observada para os indivíduos que apresentam patologias de tipo desmoplásico ou mesmo neoplásico (grupo III). Do estudo efectuado podem retirar-se as seguintes conclusões: 1. As principais patologias da cavidade oral podem ser acompanhadas de forma directa e proporcional pela expressão fenotípica dos miofibroblastos. 2. A intensidade da imunomarcação pela -actina, desmina, vimentina e P63 é directamente proporcional à severidade das principais lesões da cavidade oral. 3. A intensidade da imunomarcação pela -actina, desmina, vimentina e P63 é um importante factor de diagnóstico e prognóstico das principais lesões da cavidade oral. 35

38 4. A imunomarcação pela -actina, desmina, vimentina e P63 é tendencialmente negativa na ausencia de fenómenos proliferativos. 5. A imunomarcação pela -actina, demonstra a evolução da severidade da doença periodontal. 36

39 Abstract 1.INTRODUCTION The myofibroblasts are cells which express the α-actin isoform of the smooth muscle cell. These cells show intermediate characteristics between fibroblasts and smooth muscle cells, although they present similar morphology to the fibroblasts. Myofibroblasts were also called as peritumoral fibroblasts, carcinoma-associated fibroblasts and active fibroblasts of the stroma. Nowadays, they are more commonly called as myofibroblasts. They are present as a small cellular subpopulation in almost every organ, and they are able to express and segregate an extensive quantity of cytokines, growth factors, chemokines, hormones, neurotransmitters, inflammatory mediators, adhesion proteins and ECM proteins - extracellular matrix. The myofibroblasts are also responsible for the important production of collagen material, metalloproteinases, gelatinases, glycosaminoglycans and hepatocytic and keratinocytic growth factors. Since the myofibroblast manifests the capacity of expressing high levels of cytokines, extracellular matrix and smooth muscle α-actin, it plays important roles in the inflammation, it places connective tissue, r, waiting that these can contribute for the fibrotic answer through its characteristic phenotypes. The myofibroblasts are morphologically characterised as oblong, fusiform and stellate cells with regular and central nucleus. They show a prominent cytoplasm of actin microfilaments (stress fibbers), a well developed endoplasmic reticulum, and they are connected with each other through adherences and junctions of the gap junctions type. These cells also establish contacts with extracellular matrix components through the fibronexus, which is a transmembrane complex composed by actin, integrin and fibronectin. 37

40 Myofibroblasts are identified through the α-sma expression. This cytoplasmic marker is additionally found in other 2 cellular types: smooth muscle cells and myoepithelial cells. The presence of other markers such as laminin, desmin, calponin, smooth muscle myosin, caldesmon and fibroblast activation protein, has been used to characterise the myofibroblasts, but the expression pattern is variable and mainly dependent of the origin, location and pathological condition. Therefore, α-sma is the best cellular marker for the identification of myofibroblasts, allowing the behaviour supervision and identification of these cells in clinical and pathological situations. These cells can be found in numerous situations, part of physiological and pathological processes. The myofibroblasts contribute to the growth and differentiation of tissues and organs, through interactions with epithelial cells, playing also an important role in the repair process, through the retraction of the granulation tissue and the ECM synthesis, including collagen, fibronectin and proteoglycans. However, if these cells persist, an excessive quantity of collagen is produced, which results in fibrotic disorders, such as keloid and hepatic fibrosis. 38

41 2.GOALS In this work, different forms of immunocytochemical expression, in several clinical environments. The aim was to establish a gradual scale of the biological expression with high applicability in the clinical context at the diagnosis level of the main pathologies of the oral cavity. Therefore, the goals of this work are: 1. Characterise a sample of the main pathologies related with the oral cavity; 2. Evaluate the phenotypic expression of the myofibroblasts in the main pathologies related with the oral cavity, through an antibody panel: alpha-actin, desmin, vimentine and P63; 3. Relate the immunomarking with the severity of the main lesions in the oral cavity. 39

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43 3.MATERIAL AND METHODS 3.1.SAMPLE CHARACTERISATION The studied sample includes 90 individuals, from the Dentistry consultation of the Hospital Senhora da Oliveira Guimarães, in the North of Portugal, between 2003 and A previously defined work protocol was applied to each person, where it was registered the main elements of his/her identity, clinical history and exact location of the sampling. In individuals of the groups I and II, elements related with the diagnostic pathologies were also registered. 3.2.CLINICAL ASSESSMENT The clinical assessment was made through an anamnesis and an objective examination. In the anamnesis, a questionnaire was made about the main local and systemic, current and past pathologies, habits and therapies. In the objective examination, an intra and extra-oral clinical observation was made. In the extra-oral exam, the main skeletal, skin and mucosal changes were screened. The covering, masticatory and specialised mucosas were evaluated in the intra-oral exam. The main bridle insertion, tumefactions, endogenous and exogenous pigmentations of the soft and hard tissues where also observed. A periodontal record was filled in for the respective records. severity. The periodontitis diagnosis was based on the extension index and 41

44 The different pathologies of the oral cavity were based in the anatomicpathological diagnosis. After the clinical and histopathological assessment, the individuals were divided in study groups as following: - Group I: all the individuals that did not present any systemic or localised pathology. Clinically, they were classified as clinically healthy and they used as control group. - Group II: all the individuals that did not present any systemic pathology, but who evidentiate loss of clinical insertion from mild to moderate. Clinically, they were classified as individuals with mild to moderate periodontitis, and they were classified as the periodontitis group. The mild to moderate classification was based in Armitage classification, Group III: all the individuals who present other pathologies, previously diagnosed in the oral cavity. Clinically, they were classified according to the different pathologies, and they were used as reference to the comparative study with the other two groups. The pathologies studied were: leukoplakia, spinocellular carcinoma, lichen planus, fibroma, fibroepithelial hyperplasia, fibrous epulides and granulamatous epulides. 3.3.COLLECTION TECHNIQUE The tissues were collected in an aseptic environment, by the conventional biopsy technique, in the vestibular region of the 3 rd and 4 th quadrants, in the transition between the free gum and the joined gum, with sizes that vary between the 2x2mm and 10x5mm. All the biopsies were done with local-regional anaesthesia of lidocaine 2%, after previous consent of the patient, which was obtained in a written document in an explicit and volunteer way, in a 42

45 model approved by the Ethics Commission of the Hospital Senhora da Oliveira Guimarães. 3.4.FIXATION All the tissues studied in optical microscopy were fixed with buffered formaldehyde 10%, in a quantity which corresponded to at least ten times the volume of the fixed tissue. The tissues studied in optical microscopy were fixed in sodium cacodylate buffer 0.1 M (ph 7.4). In some cases, the direct processing was done from the fixation for the optical microscopy. 3.5.PROCESSING Tissue processing for electronic microscopy From the samples included in paraffin blocks, a selection of the most interesting area was made, which was carefully removed with the help of a scalpel. The fragment was cut in small pieces, and they were put in xylol for 24 hours, in order to remove the paraffin. Then, it was done a hydration in a decreasing series of alcohol with immersions of 1 hour in ethanol 100% and 30 minutes in ethanol 90% and 70%, always with two changes for each alcohol. Afterwards, the fragments were immersed in sodium cacodylate buffer 0.1 M (ph 7.4) for 1 hour and 30 minutes, changing the buffer each 30 minutes. This was followed by the postfixation phase for 1 hour (at 4ºC) with osmium tetroxide 1%, in sodium cacodylate buffer 0.1 M (ph 7.4). Subsequently, a dehydration was done in an increasing series of alcohol, with immersions of 10 minutes in ethanol solutions at 50%, 75%, 90%, and 95%, always at a temperature of 4ºC, followed by three immersions, also with 10 minutes each in absolute ethanol. In the last change of absolute ethanol, the processing was 43

46 done at room temperature. Two more immersions were done of 10 minutes each, but now in propylene oxide. The impregnation of the samples in inclusion resin consisted of submitting the fragments in mixtures of propylene oxide and a resin of Epoxy type (Epon ), in the ratios of 03:01, 01:01 and 01:03, respectively, with 1 hour for each mixture. Finally, the fragments were immersed in pure Epon, in which they stood for 1 hour at room temperature and 30 minutes at 50ºC. This procedure was followed by the inclusion, done in rubber moulds which, after being filled with a fragment in each end and filled with Epon, they were put in a dryer at a temperature of 60ºC for 2 days, for the resin polymerisation. The ultra-thin cuts were made with a diamond knife, in an ultramicrotome (Leica Ultracut ), and colleted in copper grids with 200 mesh. A doubled etching of the cuts is manually made. For that, the grids with the cuts were emerged in a saline solution of uranyl acetate for 20 minutes and then, in a solution of lead citrate for 10 minutes (Reynolds, 1963). The observation was made in a transmission electron microscope JEOL 100CXII, in which records of some images were made as microphotographs Tissue processing in histochemistry Haematoxylin-eosin Staining The haematoxylin-eosin staining was used in all the studied tissues as the first staining. This is the main histochemical method executed in the histopathological routine, following always complementary diagnosis techniques such as the histochemistry. It is used because it is the one which offers a more trustworthy nucleus-cytoplasm relation and because it is the staining that better shows the tissue architecture. This technique is able to demonstrate the main tissue elements: the nucleus, the cytoplasm and the collagen. Technical procedure: The tissues were prepared based on the protocol defined by the Pathological Anatomy laboratory and followed the steps described below: 44

47 The tissues were submitted to three successive baths in xylol, and they were precisely 10 minutes in each bath. Then, the tissues were hydrated through a decreasing series of alcohols, at 100%, 95%, 80%, 50% respectively, and finally put in water. After being washed, they were stained by haematoxylin for 3 minutes, and then, they were washed once again with water to be put in Hydrochloric Acid for differentiation. Afterwards, the tissues were washed with fresh water for 10 minutes and then stained by eosin for 3 minutes. After being stained by eosin, the cuts were washed, the staining excesses were removed and then dried in a dryer for 10 minutes. After the cuts being dried, we proceeded the assembly in resinous environment (Entellan ) Special Masson Trichrome stain This special staining was particularly important in the identification of the collagen fibres and its location, for the comprehension of the pathological processes associated with the myofibroblasts, such as the expression of the connective tissue in the repair process, and the standardization of the histological changes as an answer to physical and chemical strength. Procedure: In the beginning, a deparaffination was done and was followed by the hydration and washing. The tissues were passed by water and stained with sky blue for 5 minutes. Then, the cuts were exuded, and the nucleuses were stained with Gill's Haematoxylin for 5 minutes. They were covered with picric alcohol for 5 minutes and then, they were washed in abundance with fresh water. After being washed, they were stained for 5 minutes with the Ponceau- Fucsina solution. They were washed afterwards with distilled water, and they were put phosphomolybdic acid stain 1% for 5 minutes. They were once again washed with distilled water and stained with aniline blue, in a period of time that varied between 2 to 5 minutes. 45

48 Finally, and after a new washing with distilled water, the tissues were dehydrated, diaphanized and then assembled in a resinous mounting environment. The results found in the different cuts were done according to the classic technique, i.e., the nucleuses stained of dark blue, the collagen of blue, the muscle fibres of red, the erythrocytes of yellow to orange, the cytoplasms of red, the nervous structures of blue, and the fibrinogen of dark red Immunohistochemical Technique The studied tissues were submitted to an immunohistochemical technique for assessment the presence of actin, vimentine, desmin and p63, using respectively, the antibodies NCL SMA, NCL-L-VIM-572, NCL-DESM- DERII and NCL-p63 (mouse monoclonal antibody, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK). For this effect, the blades with histological cuts were desparaffined for 20 minutes in xylol and hydrated in a decreasing series of alcohols to water (alcohol 100% for 5 minutes, alcohol 100% for 5 minutes, alcohol 70% for 5 minutes, alcohol 50% for 5 minutes and fresh water for 5 minutes). The used samples were fixed with buffered formaldehyde 10%, and included in paraffin. The tissue fixation process in formaldehyde provides the formation of crossed connections which masked the antigenic epitopes. This way, some antibodies need an antigenic recovery to detect their specific antigenic epitope. In this series, with the anti-vementine and anti-actin antibodies, it was not necessary to proceed with the antigenic recovery, since these antibodies detect their antigenic epitopes, without being necessary to break the crossed connections created by the fixation in formaldehyde. However, to detect the antigenic epitopes p63 and desmin, the antigenic recovery was necessary, using high temperatures. In this work, the antigenic 46

49 recovery was done with a commercial solution (RA Epitope Retrival Solution ph6, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK) similar to the solution of original citrate buffer (10mM, ph=6.0), in water bath at 98ºC, for 30 minutes. The detection system used for the immunohistochemical reaction was a detection kit with peroxidase polymer (Novolink Polymer Detection System, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK), and the detection of the different types of antibodies was made following the manufacturer instructions for this detection system: endogenous Peroxidase Block with a Peroxidase Block, for 5 minutes; unspecific reaction inhibition with Protein Block, for 5 minutes; incubation of the primary antibodies (anti-actin, 1/200 dilution and incubation for 15 minutes at room temperature; anti-desmin, 1/50 dilution and incubation at room temperature for 60 minutes; anti-vimentine, 1/200 dilution and incubation at room temperature for 30 minutes; anti-p63, 1/10 dilution and incubation at room temperature for 60 minutes); reagent incubation with Post Primary Block, for 30 minutes; Incubation with Polymer, for 30 minutes; revelation with OBD, for 5 minutes. After the immunohistochemical marking, the histological cuts were contrasted with Haematoxylin for 2 minutes, dehydrated in an increasing series of alcohols (alcohol 50% for 2 minutes, alcohol 80% for 2 minutes, alcohol 95% for 2 minutes, two times alcohol 100% for 2 minutes), diaphanized in xylol and assembled. The precision of the immunohistochemical technique depends on getting an highly specific marking, preventing an unspecific reaction of the primary antibody in the tissue. In immunohistochemistry, it is necessary assure that each antibody is used in the appropriate dilution, it does not evaporate during the incubation and it is removed completely if it is not connected, before the next reagent is added. For this reason, in each executed test, blades with histological cuts of tissues with the presence of antigenic epitopes were included and, before the technique execution, the standardization of the most appropriate conditions was done, adapting it for each primary antibody, the use 47

50 of antigenic recovery and the incubation time, temperature and primary antibody dilution. The technique was developed in a humidity cabinet and each cut was isolated with hydrophobic pen. In each reaction, histological cuts of ileocecal appendix as positive control to the anti-actin, anti-desmin and anti-vimentine antibody, and histological cuts of prostate as positive control to the anti-p63 antibody were included. 48

51 4. DISCUSSION AND CONCLUSIONS The smooth muscle phenotype which shows the myoepithelial cells is demonstrated by positive marking for the actin of the smooth muscle cell. These markers, specially the α-actin, are determinant for the identification of the myofibroblasts in a complex stroma and, sometimes, desmoplastic. In the periodontal disease context, it is frequent the phenotype expression of the α -actin by the myofibroblasts, especially at the level of the joined gum. The cytoskeleton marking is also positive for the vimentine and desmin filaments. Its expression is obvious; however, it is inferior to the observed for the individuals who present pathologies of desmoplastic or even neoplasic type (group III). From the developed study, the following conclusions can be obtained: 1. The main pathologies of the oral cavity can be followed directly and proportionally by the phenotypic expression of the myofibroblasts. 2. The immunomarking intensity by the α-actin, desmin, vimentine and P63 is directly proportional to the severity of the main lesions in the oral cavity. 3. The immunomarking intensity by the α-actin, desmin, vimentine and P63 is an important diagnosis and prognosis factor of the main lesions in the oral cavity. 49

52 4. The immunomarking by the α-actin, desmin, vimentine and P63 tends to be negative in the absence of proliferative phenomena. 5. The immunomarking by the α-actin shows the evolution of the periodontal disease severity. 50

53 Resumen 1. INTRODUCCIÓN Los miofibroblastos son células que expresan la isoforma α-actina de la célula muscular lisa. Estas células exhiben características intermedias entre fibroblastos y células musculares lisas; sin embargo revelan una morfología similar al de los fibroblastos. Los miofibroblastos también han sido llamados de fibroblastos peri-tumoral, fibroblastos asociados al carcinoma y fibroblastos activos del estroma, pero hoy son comúnmente conocidos por miofibroblastos. Ellos se presentan como una pequeña subpoblación celular en casi todos los órganos y son capaces de expresar y secretar una gran cantidad de citocinas, factores de crecimiento, quimiocinas, hormonas, neurotransmisores, mediadores inflamatorios, proteínas de adhesión y proteínas de la MEC - matriz extracelular. Los miofibroblastos son también responsables por la alta producción de material colágeno, metaloproteinasas, gelatinases, glicosaminoglicanos y factores de crecimiento de hepatocitos y queratinocitos. Con base en su capacidad de expresar altos niveles de citocinas, matriz extracelular y α-actina del músculo liso vascular, el miofibroblasto desempeña una participación muy importante durante la inflamación, deposita tejido conectivo, r, esperándose que estos puedan contribuir a la respuesta fibrótica a través de los fenotipos característicos concernientes. Los miofibroblastos se caracterizan morfológicamente como células alargadas, fusiformes o estrelladas con un núcleo regular y central. Ellos presentan un prominente citoplasma de microfilamentos de actina (fibras de estrés), un retículo endoplasmático bien desarrollado y están conectados entre sí a través de nudos y adhesiones del tipo gap junctions. Estas células también establecen contactos con los componentes de la matriz extracelular a través de 51

54 fibronexus, que es un complejo transmembrana formado por la actina, la fibronectina y la integrina. Los miofibroblastos son identificados a través de la expresión de α-sma. Este marcador citoplasmático se encuentra, además, en otros dos tipos de células: células musculares lisas y células mioepiteliales. La presencia de otros marcadores como la laminina, desmina, calponina, miosina del músculo liso, caldesmonina y proteína de activación de los fibroblastos ha sido utilizada para caracterizar los miofibroblastos, pero el patrón de expresión es variable y depende principalmente del origen, ubicación y condición patológica. Por consiguiente, α-sma es el mejor marcador celular para la identificación de miofibroblastos, permitiendo identificar y supervisar el comportamiento de estas células en contextos clínicos y patológicos. Estas células pueden encontrarse en inúmeras situaciones, participando ya sea en procesos fisiológicos o bien en procesos patológicos. Los miofibroblastos contribuyen para el crecimiento y diferenciación de los tejidos y órganos, a través de la interacción con las células epiteliales, y también desempeñan un papel importante en el proceso de reparación, a través de la retracción de tejido de granulación y de la síntesis de MEC, incluyendo el colágeno, fibronectina y proteoglicanos. Sin embargo, si persisten estas células, una cantidad excesiva de colágeno se produce, lo que resulta en transtornos fibróticos tales como la fibrosis hepática y queloides. 52

55 2.OBJETIVOS En este trabajo, son observadas diferentes formas de expresión inmunocitoquímica, en diversos entornos clínicos. El objetivo fue establecer una escala progresiva de expresión biológica con alta aplicabilidad en el contexto clínico con respecto al diagnóstico de las principales patologías de la cavidad oral. Por lo tanto, son objetivos de este trabajo: 1. Caracterizar una muestra de las principales patologías de la cavidad oral. 2. Evaluar la expresión fenotípica de los miofibroblastos en las principales patologías de la cavidad oral a través de un panel de anticuerpos: alfa-actina, desmina, vimentina y P Relacionar la intensidad de la inmunomarcación con la severidad de las principales lesiones de la cavidad oral. 53

56

57 3.MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. CARACTERIZACIÓN DE LA MUESTRA La muestra estudiada es formada por 90 personas, de la consulta de Medicina Dental, del Hospital Senhora da Oliveira Guimarães, en el norte de Portugal, entre los años 2003 y A todos los individuos se aplicó un protocolo de trabajo, previamente establecido, en el cual se han listado los principales elementos de su identidad, su historia clínica y la ubicación exacta de la cosecha. En las personas de los grupos I y II se registró también la información relativa a las patologías diagnosticadas. 3.2.EVALUACIÓN CLÍNICA La evaluación clínica se realizó a través de una anamnesis y de un examen objetivo. En la anamnesis, se ha elaborado un cuestionario sobre las principales patologías locales y sistémicas, presentes o pasadas, hábitos y terapéuticas. En el examen objetivo se ha realizado una observación clínica, intra y extraoral. En el examen extraoral, fueron descartados los principales cambios esqueléticos, de la piel y mucosas. En el examen intraoral, se evaluó las mucosas de revestimiento, masticatoria y especializada. Además se observó las principales inserciones de frenillos, tumefacciones, pigmentaciones exógenas y endógenas de los tejidos blandos y duros. A continuación, se completó un ficha clínica periodontal para los respectivos registros. severidad. El diagnóstico de periodontitis se basa en el índice de extensión y 55

58 Las diversas patología de la cavidad oral se basaron en los diagnósticos anatomopatológicos. Después de la evaluación clínica y histopatológica, los individuos fueron asignados por sus grupos de estudio de la siguiente manera: - Grupo I: Aquí han sido colocadas todas las personas que no manifestaron ninguna patología sistémica o localizada. Clínicamente se clasifican como clínicamente sanos y actuaron como grupo de control. - Grupo II: Aquí han sido colocadas todas las personas que no han demostrado ninguna patología sistémica, pero que han todavía manifestado una pérdida de la inserción clínica de leve a moderada. Clínicamente se clasifican como personas con periodontitis leve a moderada y actuaron como grupo de periodontitis. La clasificación leve a moderada se basó en la clasificación de Armitage, Grupo III: Aquí han sido colocadas todas las personas que presentaron otras patologías de la cavidad oral, previamente diagnosticadas. Clínicamente fueron clasificadas de acuerdo con las distintas patologías y sirvieron de base para un estudio comparativo con los otros dos grupos. Las patologías estudiadas fueron: leucoplasia, carcinoma de células escamosas, liquen plano, fibroma, fibroma, hiperplasia fibroepitelial, épulis fibromatoso y épulis granulomatosa TÉCNICA DE COSECHA Los tejidos fueron recolectados en ambiente aséptico, por medio de la técnica de biopsia convencional al nivel de la región vestibular de los 3º y 4º cuadrantes, en la transición entre la encía libre (marginal) y encía adherida con 56

59 tamaños que oscilaron entre 2x2mm y 10x5mm. Todas las biopsias se realizaron con anestesia loco-regional à base de lidocaína al 2%, después del consentimiento previo del paciente obtenido por escrito de manera informada y voluntaria, en formulario apropiado, aprobado por el comité de ética del Hospital Senhora da Oliveira - Guimarães FIJACIÓN Todos los tejidos estudiados en microscopía óptica fueron fijados con formaldehído tamponado al 10%, en una cantidad que representaba a lo menos diez veces el volumen del tejido fijado. Los tejidos estudiados en microscopía óptica fueron fijados en buffer cacodilato de sodio a 0,1 M (ph 7,4). En algunos casos se efectuó el procesamiento directo desde la fijación para la microscopía óptica PROCESAMIENTO Procesamiento de tejidos para la microscopía electrónica A partir de las muestras incluidas en los bloques de parafina, se ha realizado una selección del área de mayor interés, que ha sido retirada, cuidadosamente, con la ayuda de un bisturí. El fragmento fue cortado en pedazos pequeños y se colocaron en xilol durante 24 horas para eliminar toda la parafina. Se procedió a una hidratación por una serie decreciente de alcoholes con pasajes de 1 hora por etanol al 100% y de 30 minutos por etanol al 90% y 70%, siempre con dos reemplazamientos para cada alcohol. A continuación, los fragmentos han sido sumergidos en buffer cacodilato de sodio a 0,1 M (ph 7,4) por 1 hora y 30 minutos, haciendo cambios en el buffer cada 30 minutos. Se procedió a la etapa de post-fijación durante 1 hora (a 4º C) con tetraóxido de osmio al 1%, en buffer cacodilato de sodio a 0,1 M 57

60 (ph 7,4). Posteriormente, se llevó a cabo una deshidratación por serie de alcoholes de gradación creciente, con pasajes de 10 minutos en solución de etanol al 50%, 75%, 90% y 95%, siempre a una temperatura de 4º C, seguidas de tres pasajes, también de 10 minutos cada uno, en etanol absoluto. En el último reemplazamiento de etanol absoluto, el procesamiento ha sido realizado a temperatura ambiente. En seguida, dos pasajes más de 10 minutos cada uno, pero ahora por óxido de propileno. La impregnación de las muestras en la resina de inclusión consistió en presentar los fragmentos en mezclas de óxido de propileno y una resina tipo Epoxy (Epon ) en las proporciones de 3:1, 1:1 y 1:3, respectivamente, con una duración de 1 hora en cada mezcla. Por último, los fragmentos fueron sumergidos en Epon puro, en el cual quedaron durante 1 hora a temperatura ambiente y durante 30 minutos a 50 º C. A esto se siguió la inclusión, realizada en moldes de goma los cuales, después de completados con un fragmento en cada extremo y llenos de Epon, fueron incubados en estufa a una temperatura de 60 º C durante 2 días para la polimerización de la resina. Los cortes ultrafinos fueron realizados con un bisturí de diamante, en un ultramicrótomo (Leica Ultracut ), y fueron recogidos en mallas de cobre con 200 mesh. Se llevó a cabo manualmente, una doble contrastación de los cortes, sumergiéndose, en primer lugar, las mallas con los cortes en una solución salina de acetato de uranilo durante 20 minutos y posteriormente, en una solución de citrato de plomo durante 10 minutos. La observación se hizo en un microscopio electrónico de transmisión JEOL 100CXII, donde se efectuaron registros de algunas imágenes en forma de micrografías Procesamiento de tejidos en histoquímica Coloración de Hematoxilina Eosina La coloración de Hematoxilina-Eosina fue utilizada en todos los tejidos estudiados como primera coloración. Este procedimiento es el principal método histoquímico realizado en la rutina histopatológica, acompañando siempre las 58

61 técnicas complementarias de diagnóstico como la inmunohistoquímica. Se utiliza puesto que es la técnica que nos proporciona una relación núcleocitoplasma más fiable y porque es la que mejor demuestra la estructura del tejido. Esta es también una técnica capaz de exponer los elementos principales de tejidos: el núcleo, el citoplasma y el colágeno. Procedimiento técnico: Los tejidos se prepararon sobre la base del protocolo, establecido por el laboratorio de Anatomía Patológica y siguió los pasos que se detallan a continuación: Los tejidos fueron sometidos a tres baños sucesivos en xilol, con tan sólo 10 minutos por cada baño. En seguida, los tejidos fueron hidratados por una serie de alcoholes de gradación decreciente, respectivamente al 100%, 95%, 80%, 50% y, por último, fueron colocados en agua. Después de lavarse los tejidos, fueron coloreados con hematoxilina durante 3 minutos, y se lavó nuevamente en agua para colocarse en seguida en Ácido Clorhídrico para la diferenciación. Subsiguientemente fueron lavados con agua corriente durante 10 minutos y luego coloreados por la eosina durante 3 minutos. Después de coloreados por la eosina, las secciones fueron lavadas, se eliminó los excesos de colorante, y se incubaron en estufa durante 10 minutos. Después del secado de las secciones, se procedió a la montaje en medio resinoso (Entellan ) Tricrómico de Masson Especial Esta coloración especial fue muy importante en la identificación de las fibrillas de colágeno y su ubicación, para la comprensión de los procesos patológicos asociados a los miofibroblastos, como la expresión del tejido conectivo en el proceso de reparación, y normalización de los cambios histológicos en respuesta a agresiones físicas o químicas. 59

62 Procedimiento: Inicialmente se hizo una desparafinación, seguida por una hidratación y lavado. Los tejidos fueron lavados con agua destilada y coloreados con azul celeste durante 5 minutos. En seguida, los cortes fueron aclaradas y los núcleos fueron coloreados con hematoxilina de Gill durante 5 minutos. Los cortes fueron cubiertos con el alcohol pícrico durante 5 minutos y luego lavados abundantemente con agua corriente. Después de bien lavados, fueron coloreados durante 5 minutos por una solución de Ponceau-Fucsina. En seguida, fueron lavados con agua destilada y se colocaron en el mordiente Ácido Fosfomolíbdico al 1% durante 5 minutos. Los cortes fueron lavados nuevamente con agua destilada y coloreados por el azul de anilina durante un tiempo que osciló entre 2 a 5 minutos. En último lugar, y después de nuevo lavado con agua destilada, los tejidos fueron deshidratados, y diafanizados y en seguida se procedió a la montaje en medio resinoso. Los resultados encontrados en los diferentes cortes estaban en consonancia con la técnica clásica, es decir, los núcleos se tiñeron de azul oscuro, el colágeno de azul, las fibras musculares de rojo, los glóbulos rojos de color amarillo a naranja, los citoplasmas de rojo, las estructuras nerviosas de azul y el fibrinógeno de rojo oscuro Técnica De Inmunohistoquímica Los tejidos estudiados fueron sometidos a una técnica inmunohistoquímica para una evaluación de la presencia de actina, vimentina, desmina y p63, utilizando los anticuerpos NCL-SMA, NCL-L-VIM-572, NCL- DESM-DERII y NCL-p63 (mouse monoclonal antibody, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK), respectivamente. Con este propósito, las láminas con cortes histológicas fueron desparafinadas durante 20 minutos en xilol y hidratadas por una serie decreciente de alcoholes hasta el agua (alcohol al 100% 5 minutos, alcohol al 60

63 100% 5 minutos, alcohol al 70% 5 minutos, alcohol al 50% 5 minutos y agua corriente 5 minutos). Las muestras utilizadas fueron fijadas con formaldehído tamponado al 10% e incluidas en parafina. El proceso de fijación de los tejidos en formaldehído proporciona la formación de enlaces cruzados que enmascaran los epítopes antigénicos. Por lo tanto, algunos anticuerpos requieren la recuperación antigénica para detectar a su epítope antigénico específico. En esta serie, con los anticuerpos anti-vimentina y anti-actina no fue necesario procederse a la recuperación antigénica ya que estos anticuerpos detectan a sus epítopes antigénicos específicos sin tener que romper los enlaces cruzados causados por la fijación en formaldehído. Sin embargo, para la detección de epítopes antigénicos p63 y desmina, fue necesario realizar la recuperación antigénica utilizando altas temperaturas. En este estudio, la recuperación antigénica se realizó con una solución comercial (RA Epitope Retrival Solution ph6, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK) similar a la solución de tampón citrato original (10mm, ph = 6,0) en baño maría a 98 C durante 30 minutos. El sistema de detección utilizado para la reacción de inmunohistoquímica fue un kit de detección con polímero de peroxidasa (Novolink Polymer Detection System, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK), y la detección de los diferentes tipos de anticuerpos se hizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante de este sistema de detección: Bloqueo de la Peroxidasa endógena con la Peroxidase Block, durante 5 minutos; inhibición de las reacciones inespecíficas con Protein Block, durante 5 minutos; incubación de los anticuerpos primarios (antiactina, dilución de 1/200 y incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente; anti-desmina, dilución de 1/50 y incubación a temperatura ambiente durante 60 minutos; anti-vimentina, dilución de 1/200 y incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos; anti-p63, dilución de 1/10 y incubación a temperatura ambiente durante 60 minutos); incubación del reactivo Post Primary Block, durante 30 minutos; Incubación con Polymer, durante 30 minutos; revelación con DAB, durante 5 minutos. Después 61

64 de la marcación inmunohistoquímica, los cortes histológicos fueron contrastados con Hematoxilina, durante 2 minutos, deshidratados por una serie creciente de alcoholes (alcohol al 50% durante 2 minutos, alcohol al 80% durante 2 minutos, alcohol al 95% durante 2 minutos, dos veces alcohol al 100% durante 2 minutos), diafanizados en xilol y montados. La exactitud de la técnica de inmunohistoquímica depende de la obtención de una marcación muy específica previniendo así las reacciones inespecíficas del anticuerpo primario en el tejido. En la inmunohistoquímica es necesario garantizar que cada anticuerpo se usa en la dilución adecuada, que no se evapora durante la incubación y que es eliminado completamente, si no está ligado, antes de añadir el reactivo siguiente. Por este motivo, en cada ensayo realizado se incluyeron láminas con cortes histológicos de tejidos con la presencia de los epítopes antigénicos en cuestión y, antes de la realización de la técnica se procedió a la normalización de las condiciones más adecuadas, adaptándose a cada anticuerpo primario, el uso de la recuperación antigénica y el tiempo de incubación, la temperatura y la dilución del anticuerpo primario. La técnica se llevó a cabo en cámara húmeda y cada corte se aisló con pluma hidrofóbica. En cada reacción, se incluyeron cortes histológicos de apéndice íleocecal como control positivo para el anticuerpo anti-actina, anti-desmina antivimentina, y cortes histológicos de la próstata como control positivo para el anticuerpo anti-p63. 62

65 4. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES El fenotipo del músculo liso que presenta las células mioepiteliales, es demostrado por la marcación positiva para la actina de la célula muscular lisa. Estos marcadores, en particular la α-actina, son fundamentales para la identificación de los miofibroblastos en un estroma complejo y, a veces, desmoplásico. En el contexto de la enfermedad periodontal es frecuente la expresión fenotípica de la α-actina por parte de los miofibroblastos, en particular en la encía adherida. La marcación del citoesqueleto es igualmente positiva para los filamentos de vimentina y desmina. Su expresión es clara, sin embargo, inferior a la observada para las personas que presentan patologías del tipo desmoplásico o incluso neoplásico (Grupo III). De los análisis realizados se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. Las principales patologías de la cavidad oral pueden ser acompañadas de una forma directa y proporcional por la expresión fenotípica de los miofibroblastos. 2. La intensidad de la inmunomarcación por la α-actina, desmina, vimentina y P63 es directamente proporcional a la severidad de las principales lesiones de la cavidad oral. 3. La intensidad de la inmunomarcación por la α-actina, desmina, vimentina y P63 es un factor importante de diagnóstico y pronóstico de las principales lesiones de la cavidad oral. 4. La inmunomarcación por la α-actina, desmina, vimentina y p63 es tendencialmente negativa en la ausencia de fenómenos proliferativos. 63

66 5. La inmunomarcación por la α-actina, muestra la evolución de la severidad de la enfermedad periodontal. 64

67 INTRODUÇÃO

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69 Introdução 1. INTRODUÇÃO Os miofibroblastos são células que expressam a isoforma α-actina da célula muscular lisa (Powell et al., 2005). Estas células demonstram características intermediárias entre fibroblastos e células musculares lisas, no entanto apresentam morfologia similar aos fibroblastos (Powell et al., 2005; Desmoulière et al., 2004; Grotendorst et al., 2004). Miofibroblastos foram também denominados de fibroblastos peri-tumorais, fibroblastos associados ao carcinoma e fibroblastos activos do estroma, mas hoje são mais trivialmente chamados de miofibroblastos (Lewis et al., 2004). Estão presentes como uma pequena subpopulação celular em quase todos os órgãos e são capazes de expressar e secretar uma extensa quantidade de citocinas, factores de crescimento, quimiocinas, hormonas, neurotransmissores, mediadores inflamatórios, proteínas de adesão e proteínas da matriz extra celular (Orimo & Weinberg, 2006; Desmoulière et al., 2004). Os miofibroblastos são também responsáveis pela produção acentuada de colagénio, metaloproteinases, gelatinases, glicosaminoglicanos e factores de crescimento hepatocíticos e queratinocíticos (Jester et al. 1999, 2002). Uma vez que o miofibroblasto manifesta a capacidade para expressar níveis elevados de citoquinas, matriz extracelular e α-actina do músculo liso, desempenha um papel chave na inflamação, depositando tecido conjuntivo e contribuindo para a resposta fibrótica através dos respectivos fenótipos característicos (Phan et al., 2002; Ferreira et al.). Os miofibroblastos são caracterizados morfologicamente como células alongadas, fusiformes ou estreladas, com núcleo regular e central (Mike & 67

70 Introdução Östman, 2004). Possuem características intermediárias entre fibroblastos e células musculares lisas (B. Li & J.H.-C. Wang, 2009; Powell et al., 2005; Desmoulière et al., 2004; Grotendorst et al., 2004). Apresentam um proeminente citoplasma com microfilamentos de actina (fibras de stress), um retículo endoplasmático bem desenvolvido e estão conectados uns aos outros através de aderências e junções do tipo gap junctions (Mike & Östman, 2004; Tang et al., 1996; Darby et al., 1994). Estas células também estabelecem contactos com os componentes da matriz extracelular através de fibronexus, que é um complexo transmembranar formado por actina, integrina e fibronectina (Powell et al., 1999; Eyden, 1993). Os miofibroblastos são identificados através da expressão de α-actina (Desmoulière et al., 2004). Este marcador citoplasmático é encontrado adicionalmente noutros dois tipos celulares: células musculares lisas e células mioepiteliais. A presença de outros marcadores como laminina, desmina, calponina, miosina de músculo liso, caldesmonina e proteína de activação de fibroblastos, têm sido utilizadas para caracterizar os miofibroblastos, mas com padrão de expressão variável e dependente principalmente da origem, localização e condição patológica (Mike & Östman, 2004). Então, a α-actina é o melhor marcador celular para identificação dos miofibroblastos, permitindo monitorizar e identificar o comportamento destas células em situações clínicas e patológicas. Estas células podem ser encontradas em inúmeras situações, participando tanto de processos fisiológicos quanto patológicos. Os miofibroblastos contribuem para o crescimento e diferenciação dos tecidos e órgãos, através de interacções com células epiteliais, desempenhando também um importante papel no processo de reparação, através da retracção do tecido de granulação e da síntese de matriz extracelular, incluindo colágenio, fibronectina e proteoglicanos (Gailit et al., 2001). Contudo, se estas células persistem, uma quantidade excessiva de colágeno é produzida, resultando em desordens fibróticas, como quelóide e fibroses hepáticas (Desmoulière et al., 2003; Vaquero et al., 1999; Gunhan et al., 1995). Li & Wang (2010) reportaram que os miofibroblastos podem derivar de células epiteliais tubulares através da transição epitélio-mesênquima (EMT), podendo adiconalmente derivar de células precursoras fibrócitárias, circulantes 68

71 Introdução no sangue periférico, as quais representam uma sub-população de leucócitos originários da medula óssea que possuem características semelhantes aos fibroblastos. Outra possibilidade defendida é que estes derivam de células estaminais tecido-específicas que sobre determinado estímulo (ex.mecânico) se diferenciam em miofibroblastos. 69

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73 OBJECTIVOS

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75 Objectivos 2. OBJECTIVOS Hipótese: Os miofibroblastos estão presentes na gengiva e no ligamento periodontal de doentes com patologia da cavidade oral Hipótese nula: Os miofibroblastos não estão presentes na gengiva e no ligamento periodontal de doentes com patologia da cavidade oral O objectivo principal foi estabelecer uma escala gradual de expressão biológica por observação de diferentes formas de expressão imunohistoquímica, com elevada aplicabilidade no contexto clínico ao nível do diagnóstico das principais patologias da cavidade oral. Assim, são objectivos secundários deste trabalho: Caracterizar uma amostra das principais patologias da cavidade oral. Avaliar a expressão fenotípica dos miofibroblastos presenes nas principais patologias da cavidade oral, através de um painel de anticorpos: alfa-actina, desmina, vimentina e P63. Relacionar a intensidade da imunomarcação com a severidade das principais lesões da cavidade oral. 73

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77 FUNDAMENTOS TEÓRICOS

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79 Fundamentos Teóricos 3. FUNDAMENTOS TEÓRICOS O estudo dos miofibroblastos há muito que tem sido investigado por diversos autores. Na realidade, podemos dizer que o grande pioneiro destes estudos foi Carrel, tendo publicado trabalhos científicos relacionados com os tratamentos e cicatrização de lesões (Carrel, 1910; 1916). Abercrombie et al., (1956) relacionaram células do tecido conectivo com a geração de forças de tensão responsáveis pela contracção do mesmo. O tecido de granulação de uma lesão foi definido como o órgão de contractura (Billingham and Russel, 1956). Outros estudos posteriores demonstraram que as células geradoras de força estavam localizadas nas margens da lesão e não no centro do tecido de granulação, conforme era descrito anteriormente (Watts et al., 1958). Também outros autores seguiram o trabalho de Carrel, tendo concluído que as forças contrácteis residem no tecido de granulação que preenche a lesão (James, 1964; Ross, 1968; Van Winkle, 1967). Subsequentemente, Gabbiani et al. (1972) demonstraram in vitro que o tecido de granulação apresentava um comportamento semelhante ao de uma contracção do músculo liso e descobriram que as células no seu interior exibem algumas características de células musculares lisas, tal como feixes de filamentos de actina (fibras de stress). Mediante o seu comportamento, e dado que as 77

80 Fundamentos Teóricos mesmas são as responsáveis pela geração de força, Majno et al. (1971) atribuíram-lhe o nome de miofibroblastos. Já Skalli and Gabbiani, (1988) e Rudolph et al. (1992) os referiram como sendo a característica comum de tecidos que sofram este tipo de contracção. Hinz (2007), define miofibroblasto como uma célula reparadora do tecido conjuntivo, que contribui para a reconstrução de tecido danificado, pela produção de nova matriz extra-celular (MEC) e por exercer uma elevada força contráctil, mantendo determinadas características. As características associadas ao miofibroblasto são: um extenso sistema fibrilar citoplasmático; uma marcação imuno-histoquímica do seu citoplasma com soro humano antimúsculo liso; um núcleo com pregas e múltiplas indentações indicativas de contracção celular como no músculo liso, miocárdio, endotélio vascular; uniões de célula com célula e de célula com estroma ORIGEM DOS MIOFIBROBLASTOS A origem dos miofibroblastos permanece por esclarecer. Apesar da sua importância na fibrose, a origem dos miofibroblastos e a génese das diversas subpopulações caracterizadas por distintos fenótipos permanecem pouco claros. Têm sido descrito fenótipos distintos e relativamente estáveis em miofibroblastos isolados a partir de tecidos submetidos a remodelação, que não estavam presentes no tecido normal intacto. Isto indica um processo pelo qual estas distintas subpopulações de miofibroblastos poderiam surgir a partir de progenitores ou células precursoras residentes e/ou serem recrutados a partir de vários tecidos, tais como a medula óssea. As provas para estas possibilidades são analisadas, mas há ainda um entendimento incompleto sobre as células precursoras e a sua potencial interrelação entre os vários fenótipos, especialmente quanto à forma como estes se relacionam com o fenótipo distinto do miofibroblasto. Além disso, a complexidade do mecanismo para a génese destes fenótipos, tais como o miofibroblasto, é destacado pela regulação dos vários processos de diferenciação, com evidência para a 78

81 Fundamentos Teóricos importância das várias vias sinalizadoras, factores de transcrição e mecanismos epigenéticos. Na pele lesionada, uma proporção substancial de miofibroblastos expressam marcadores de superfície, nomeadamente CD13 e CD45, os quais não poderiam ser expressos se se diferenciassem a partir dos fibroblastos. Ultra-estruturalmente os miofibroblastos são distintos dos fibroblastos, por apresentarem abundantes aderências inter-celulares, predominantemente junções de hiato e microfilamentos citoplasmáticos contrácteis (fibras de estresse), que compõem o aparelho contráctil da célula (Li & J.H.-C. Wang, 2009). De facto, das experiências de Mori et al, (2005) estas, indicaram que o tecido de fibroblastos não apresenta imunoreactividade ao CD13 e ao CD45. Os fibrócitos representam a única população celular conhecida que expressa CD13 e CD45 em conjugação com a α-actina (Metz, 2003). Ao examinarem o fenótipo dos fibrócitos isolados da ferida em diferentes pontos temporais, Mori et al., (2005) descobriram que 61,4% destas células tornaram-se α-actina positivas entre o quarto e o sétimo dia pós-lesão, indicando uma proporção substancial de fibrócitos que começam a sua diferenciação em miofibroblastos nesse local do tecido. Embora tenha sido encontrada a diferenciação dos fibrócitos em miofibroblastos in vitro, quando estimulados com citoquinas fibrogénicas envolvidas na reparação tecidular (como a TGF-β1), poucos estudos (Schmidt et al, 2003) apresentam evidências dos miofibroblastos se poderem formar a partir dos fibrócitos in vivo. Simultâneamente, existem documentos contraditórios e inconclusivos sobre a origem dos fibrócitos a partir da medula óssea (Phillips et al, 2004). No entanto, Mori et al, (2005) obtiveram resultados que indicaram a formação dos fibrócitos a partir da derivação de precursores da medula óssea e que, os mesmos, contribuem para a população de miofibroblastos presentes nas lesões. Também é suportada a hipótese de que os fibrócitos medeiam a reparação do tecido e da sua remodelação. 79 O desenvolvimento destes estudos contribui para uma evidência crescente de que as células da medula óssea contêm stem cells que se podem

82 Fundamentos Teóricos diferenciar quer em células hematopoiéticas (incluindo macrófagos) como também em células não hematopoiéticas (incluindo células endoteliais, perícitos, condrócitos, osteoblastos, adipócitos, células de componente neural, fibroblastos e naturalmente queratinócitos), sendo no entanto, importante referir que todas apresentam papéis importantes no processo de reparação tecidular (Badiavas et al, 2003; Yamaguchi et al, 2005). Surpreendentemente, tem-se visto que as células da medula óssea se diferenciam em células mesangiais glomerulares, hepatócitos e células miogénicas, incluindo nestas últimas, células miocárdicas e mioblastos, após a sua entrada no microambiente do tecido específico (nicho). No entanto até à data, o efeito das células da medula óssea na reparação de lesões ainda não foi totalmente esclarecido (Badiavas et al, 2003; Yamaguchi et al, 2005). Actualmente, tem sido aceite que a modulação miofibroblástica dos fibroblastos inicia-se com o aparecimento de protomiofibroblastos, cujas fibras de stress contêm apenas actinas citoplasmáticas do tipo β e γ. Em cultura, o protomiofibroblasto é um fenótipo estável, representando um passo intermédio na maior parte das condições in vivo onde se procede em direcção ao miofibroblasto diferenciado, que é caracterizado pela expressão de novo de α- actina músculo liso, o seu mais comum marcador molecular utilizado. Apesar destas células tenderem a evoluir para miofibroblastos diferenciados, a variante mais comum desta célula, com fibras de stress contendo α-actina, dever-se-á referir que existem casos excepcionais. Os miofibroblastos podem, de acordo com a situação clínica ou experimental, expressar uma outra proteína contráctil da célula muscular lisa, tal como a cadeia pesada de miosina ou a desmina (Desmoulière et al, 1993). No entanto, torna-se importante destacar que a presença do α-actina representa o marcador mais seguro do fenótipo miofibroblástico (Tomasek et al, 2002). Embora a modulação para protomiofibroblastos não esteja bem conhecida até ao presente, o mesmo não pode ser dito em relação à mudança destes para miofibroblastos diferenciados. Na verdade, esta mudança tem vindo a ser referenciada através de células inflamatórias e de células fibroblásticas, apresentando-se o Transforming growth factor-β1 (TGF-β1), 80

83 Fundamentos Teóricos como o estimulador mais aceite para esta diferenciação miofibroblástica (Desmoulière et al, 1993). Quanto à diferenciação dos miofibroblastos a partir dos fibroblastos, vários estudos têm sido realizados. Na córnea, observa-se que os queratócitos se diferenciam em miofibroblastos (Netto et al, 2005). A transformação dos queratócitos em miofibroblastos deve-se principalmente à presença de factores de crescimento, como TGF-β e também ocorre secundariamente a uma diminuição na densidade celular (Jester et al, 2002; Folger et al, 2001). A identificação directa dos miofibroblastos é possível através da utilização de anticorpos específicos contra α-actina, abundantemente encontrada nessas células. Diferenciação miofibroblástica foi igualmente evidenciada por Microscopia Electrónica de Transmissão e imuno-histoquímica num caso de Mixoma odontogénico, onde se observou ultra-estruturalmente miofilamentos na periferia do miofibroblasto, estas alterações são sugestivas de proporcionar alterações na matriz extracelular que podem contribuir para a invasão deste tipo de tumor (Martínez-Mata G et al, 2008). A trans-diferenciação fenotípica dos queratócitos secundária ao trauma cirúrgico resulta em importantes alterações fisiológicas, incluindo uma exacerbação na contractilidade e uma produção anómala de componentes da matriz extracelular (Dohlman et al, 1968; Campos et al, 1994). Ross et al, (1970), na década de setenta, propuseram, através dos seus estudos, que os miofibroblastos eram originados pelo recrutamento local de fibroblastos presentes no tecido circundante dérmico e subcutâneo. No entanto, foi descrita outra fonte possível do aparecimento dos miofibroblastos, nomeadamente, através dos pericitos, designados como células musculares lisas vasculares envolvendo vasos no tecido de granulação (Desmoulière et al, 2004). A presença dos miofibroblastos tem sido relatada em praticamente todas as situações fibróticas caracterizadas por retracção de tecido e remodelação (Desmoulière et al, 2003). 81

84 Fundamentos Teóricos Por microscopia electrónica alguns autores, sugeriram que estas células especializadas derivariam de pelo menos três tipos celulares diferentes, as quais incluiriam os pericitos de pequenos vasos, células musculares lisas e fibroblastos indiferenciados (Sappino et al, 1990; Gabbiani, 1996). No entanto, fibroblastos provenientes da medula óssea não expressam α-actina, e são resistentes à conversão fibroblasto-miofibroblasto por TGF-β1 (Willis et al, 2006). A expressão de α-actina em fibras de tensão confere ao miofibroblasto diferenciado uma dupla e forte actividade contráctil em comparação com α- actina negativa em culturas de fibroblastos (Liu et al, 2006). É ainda uma incógnita como α-actina gera maior contracção em comparação com outras isoformas de actina, mas α-actina N terminal, aminoácido específico cuja sequência AcEEED (Chaponnier et al, 1995) desempenha um papel importante neste mecanismo. Buccala et al, (1994) identificaram uma nova subpopulação de leucócitos que apresentavam propriedades do tipo fibroblasto, designadas por fibrócitos. Muito recentemente, foi sugerido que os fibrócitos circulantes possam representar uma importante fonte de fibroblastos durante a cicatrização de queimaduras exteriores, onde deverá ser difícil para os mesmos migrarem das bordas da lesão. Em estudos clínicos actuais, de pacientes com cicatrizes hipertróficas e outras desordens fibrosantes, existem evidências de que têm fibrócitos nas suas lesões (Desmoulière et al, 2005). Estudos recentes têm demonstrado que os miofibroblastos podem não derivar de um tecido fibroblástico, como foi antes referido, mas sim, originaremse a partir de um precursor da medula óssea. O fenótipo deste precursor ainda é desconhecido, mas tem sido colocada a hipótese de que essa célula se possa desenvolver a partir de fibrócitos circulantes (Direzke et al, 2003). Conforme foi referido anteriormente, a actina, a maior proteína das células eucarióticas, é expressa como isoforma de seis células tipo específicas. Estas isoformas apresentam diferentes sequências conservadas, ainda que 82

85 Fundamentos Teóricos pequenas (Vandekerckhove and Weber, 1978). A isoforma actina difere, essencialmente, no seu terminal NH2 (Vandekerckhove and Weber, 1978); portanto, este domínio representa-se como um candidato na mediação de funções específicas através de uma ligação específica. A sequência NH2- terminal Ac-EEED (o epítopo de anticorpo monoclonal directamente contra a α- actina) (Skalli et al, 1986; Chaponnier et al, 1995) surge devido à sua importância na polimerização do α-actina e incorporação em fibras de stress (Chaponnier et al, 1995). Quando microinjectado em cultura de fibroblastos, a Ac-EEED promove o desaparecimento da imunodetecção α-actina específica (Chaponnier et al, 1995), sugerindo que a mesma interfira na função desta isoforma. Para verificar qual dos efeitos da entrega do péptido incluir mudanças funcionais na actividade miofibroblástica, os autores Hinz et al, (2002) construíram uma fusão peptídica (FP; SMA-FP) incluindo Ac-EEED e a sequência da terceira hélice Antennapedia (pantp-pro50) (Derossi et al, 1994) que permite a penetração celular, dado que a sequência N-terminal da α-actina não penetra, espontaneamente nas células, devido à sua forte acidez. Foi demonstrado que o SMA-FP se localiza rapidamente nas fibras de stress depois da sua entrega; inibindo então a contractibilidade dos miofibroblastos in vitro e a contracção do tecido de granulação in vivo, suportando o facto de que a α-actina apresenta um importante papel na contracção da lesão. O mecanismo de expressão mrna colagénio diminuído em células tratadas SMA-FP não está bem esclarecido. É concebível que a redução da tensão, depois da aplicação do SMA-FP, se torna responsável pela diminuição do colagénio e da expressão mrna α-actina, iniciada ao terceiro dia após a aplicação do SMA-FP. A expressão da α-actina, em miofibroblastos, tem-se mostrado diminuída com a redução da tensão no substrato de colagénio em cultura (Arora et al, 1999) e no tecido de granulação do rato (Hinz et al, 2001a). Com base nestas descobertas, Gabbiani, (2003) e Hinz et al, (2002), sugeriram que a SMA-FP pode exercer efeitos benéficos em casos de excesso de contracção de feridas e em patologias fibrocontrácteis, para as quais não existe, actualmente, terapias farmacológicas eficientes. 83

86 Fundamentos Teóricos O importante papel dos miofibroblastos no desenvolvimento e promoção de doenças sugere que a modulação destas células e, consequentemente, da reacção do estroma possa representar um alvo terapêutico inexplorado. Contudo, um melhor entendimento dos mecanismos associados à participação dos miofibroblastos é necessário para a criação de estratégias terapêuticas FACTORES DE CRESCIMENTO Diferenciação miofibroblástica Entre os numerosos factores de crescimento, o TGF-β1 (factor de transformação do crescimento) é considerado o principal estimulador da cicatrização da lesão, contribuindo para a migração, proliferação e diferenciação de uma multiplicidade de células (Roberts et al, 1992) Dos factores de crescimento que desempenham importantes acções no processo de cicatrização da lesão, a TGF-β1, induz uma alta expressão da proteína α-actina em fibroblastos palatinos normais (Yokozeki et al, 1997). De uma forma similar, a estimulação da expressão da α-actina pela TGF-β1 tem sido também descrita noutros tipos de células. Estudos feitos em fibroblastos dérmicos de rato (Desmoulière et al, 1993) e em fibroblastos da glândula mamária (Ronnov and Petersen, 1993) confirmam a afirmação anterior. O TGFβ1 é um peptídeo multifuncional que regula várias actividades celulares, incluindo crescimento e diferenciação celular e expressão e metabolismo de macromoléculas da matriz extracelular (Huang & Lee, 2003). Os efeitos de TGF-β1 na homeostasia do tecido conjuntivo parecem ser mediados pela activação dos receptores citoplasmáticos e do factor de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF) (Tabibzadeh, 2002). TGF-β1 é secretado na matriz extracelular como um complexo latente e sua activação é regulada por proteases, incluindo plasmina, catepsina, entre outras (Annes et al, 2003). Este peptídeo desempenha um papel fundamental na transdiferenciação dos fibroblastos para miofibroblastos, como revelado pela sua capacidade de 84

87 Fundamentos Teóricos super-regular a expressão de colágenio e α-actina em modelos in vivo e in vitro (Lewis et al, 2004). Tuxhorn et al, (2002) demonstraram in vivo e in vitro a participação de TGF-β1 na conversão dos fibroblastos em miofibroblastos. No modelo in vitro de cobaias com cancro de cólon, os autores demonstraram através de imuno-histoquímica que as áreas que continham a presença de miofibroblastos apresentavam uma forte expressão de TGF-β1. Adicionalmente, em ensaios in vitro com anticorpos neutralizantes anti- TGF-β1 revelaram que a inibição de TGF-β1 foi acompanha por uma inibição na proliferação dos fibroblastos intestinais e uma significante indução na transdiferenciação em miofibroblastos (Tuxhorn et al, 2002). Untergasser et al. (2005) demonstraram que em fibroblastos de próstata tratados sob acção do TGF-β1 verificou-se a transdiferenciação em miofibroblastos, como revelado pela aquisição de densos feixes de fibras no citoesqueleto e um aumento na expressão de α-actina, calponina, e tenascina. Os achados in vivo de que TGF-β1 induz a transdiferenciação dos miofibroblastos foram confirmados por modelos in vitro. Foi demonstrado In vitro que para ocorrer à conversão dos fibroblastos em miofibroblastos dois factores são necessários: a ausência de contacto entre as células e a presença de TGF-β1 (Arora & McCulloch, 1994). Quando fibroblastos derivados do intestino, mama, pele, fígado ou próstata em cultura são tratados com TGF-β1, passam a expressar α-actina e expandem o retículo endoplasmático rugoso adquirindo morfologia de miofibroblasto (Powell et al, 2005; Desmoulière et al, 2004; Kunz-Schughart & Knuechel, 2002). Ainda em relação à regulação da diferenciação dos miofibroblastos, outros grupos têm sido descritos bibliograficamente, sobretudo a heparina; GM- CSF e endotelin-1, aumentam a expressão de α-actina em fibroblastos e em células musculares lisas arteriais, enquanto o interferão-γ (IFN-y) e o factor de crescimento plaquetário (PDGF) diminuem esta expressão nestas células (Yokozeki et al, 1997). 85

88 Fundamentos Teóricos O efeito do factor de crescimento plaquetário (PDGF) na diferenciação do miofibroblasto (Bostrom et al, 1996) está restrito à diferenciação do fibroblasto em proto-miofibroblasto, uma vez que este não induz a expressão de α-actina (Tomasek et al, 2002). No entanto, PDGF pode ser marcante para a diferenciação de queratinócitos em miofibroblastos (Jester et al, 2002). Logo, a tensão mecânica é um factor muito relevante para a promoção da diferenciação dos fibroblastos em miofibroblastos, onde o PDGF também parece estar implicado. Yokozeki et al, (1997) referiram nos seus estudos, alguns autores que defendem que o TGF-β1 estimula a expressão do seu próprio gene em vários tipos celulares (Van et al, 1988; Bascom et al, 1989; Kim et al, 1999 referidos em Yokozeki et al, 1997). Também Yokozeki e seus colaboradores (1997) demonstraram que o TGF-β1 induz uma alta expressão de TGF-β1 mrna nos fibroblastos palatinos. Os fibroblastos de cicatriz no palato expressão TGF-β1 mrna bem como a α- actina sem o tratamento com a TGF-β1 e os anticorpos neutralizantes específicos para o TGF-β1 inibem de forma significativa a contracção por essas células. O marcante papel da acção local das citoquinas e dos factores de crescimento na reparação da lesão está bem documentado. Assim, a citoquina TGF-β1 tem um papel crucial na evolução do tecido de granulação e particularmente na formação de miofibroblastos possivelmente depois de outras citoquinas ou factores de crescimento (PDGF, IL-1 e TNF-α) terem directa ou indirectamente estimulado a proliferação fibroblástica (Desmoulière et al, 1993). Já em relação à expressão de α-actina pelos fibroblastos, os autores Rubbia-Brandt et al, (1991) e Desmoulière et al, (1992) defendem que o PDGF (platelet derived growth factor) e o factor de necrose tumoral (TNF) não a afectam directamente. A alteração de protomiofibroblastos a miofibroblastos diferenciados é essencialmente devida a uma acção combinada da variante ED-A da 86

89 Fundamentos Teóricos fibronectina celular (Serini et al, 1998) e da TGF-β (Desmoulière et al, 1993), particularmente da TGF-β1, a qual é primeiramente produzida por células fagocitárias e depois, provavelmente, sob a influência de tensão mecânica. A tensão mecânica é, por sua vez, também produzida por protomiofibroblastos e portanto desencadeia um ciclo vicioso, levando ao aparecimento de miofibroblastos diferenciados (Gabbiani, 2003). Uma força mecânica gerada pela migração de fibroblastos impulsiona a organização e formação de fibras de stress, pela qual é caracterizado o protomiofibroblasto (Tomasek et al, 2002; Hinz and Gabbiani, 2003). O número aumentado de fibroblastos na área da lesão leva à segregação de novo colagénio e fibronectina. A orientação das células e fibras, dentro desta matriz, é paralela à superfície da lesão e ao longo das linhas de tensão (Hinz et al, 2001a). Os fibroblastos, tradicionalmente exercitam pequenas forças na matriz recém formada, reforça os contactos célula-matriz, desenvolve fibras de stress intracelular, transformando-se assim em protomiofibroblasto (Hinz and Gabbiani, 2003). O fenótipo protomiofibroblasto, é mantido pela contínua interacção entre a tensão celular gerada e a reacção de um substrato que é suficientemente duro para resistir a esta força (Hinz and Gabbiani, 2003). A tensão mecânica do TGF-β1 e FN, são responsáveis na diferenciação dos protomiofibroblastos em miofibroblastos maduros (Tomasek et al, 2002; Gabbiani, 2003; Phan, 2003). TGF-β1 estimula a expressão de FN e de α- actina, e aumenta a formação e organização de fibras de stress e aderências focais tanto in vitro como in vivo (Borsi et al, 1990; Desmouliere et al, 1993; Ronnov-Jessen and Petersen 1993; Yokozeki et al, 1997; Vaughan et al, 2000) Segundo Liao et al, (2002) e Muro et al, (2003) os miofibroblastos ligamse preferencialmente à FN por via das integrinas α9β1 e α4β1. Na presença de FN e de TGF-β1, o fenótipo de miofibroblasto, é perdido quando as tensões são removidas (Hinz et al, 2001b). Assim, a diferenciação do protomiofibroblasto em miofibroblasto maduro é estimulada por uma interacção entre 87

90 Fundamentos Teóricos TGF-β1 e FN, na presença de tensão mecânica (Serini et al, 1998; Vaughan et al, 2000). A acção do TGF-β1 depende da presença local da ED-A, domínio da fibronectina celular (Desmoulière et al, 2005). Como já foi referido anteriormente, é sabido que a tensão mecânica desempenha um papel importante na modulação dos fibroblastos em miofibroblastos em cultura, favorecendo a formação de fibras de stress e a expressão de α-actina (Grinnell, 2000). A tensão mecânica altera a união da fibronectina, proteína da matriz extracelular, aos miofibroblastos, bem como a resposta fibroblástica aos factores de crescimento. Esta, pode ser também, a responsável pela prevenção da apoptose fibroblástica (Hinz et al, 2001b). Também foi descrito que a tensão isométrica actua na regulação dos mecanismos de contracção fibroblástica (Grinnell et al, 1999). Em estudos publicados, Hinz et al (2001a, b) demonstraram que a tensão mecânica influi na diferenciação miofibroblástica in vivo. Assim foi, também indicada uma correlação existente entre os níveis de expressão da α- actina e a contractibilidade do tecido obtido durante as diferentes situações experimentais. Verificou-se que a correlação obtida apresentava valores elevados quando o tecido de granulação fica sujeito a tensão e, valores baixos quando o tecido se encontra em relaxamento. Assim, como conclusão desta investigação verificou-se que a tensão mecânica apresenta um papel relevante quer para a modulação miofibroblástica, quer para a manutenção da sua actividade contráctil. Existem indicadores de que a estimulação do TGF-β na produção de colagénio dos fibroblastos é uma consequência da diferenciação de miofibroblastos isto é, a aquisição do fenótipo de miofibroblastos é necessária para uma produção de colagénio aumentada (Petrov et al, 2002). Para além disso, este efeito na produção de colagénio é irreversível, persistindo mesmo após a remoção do TGF-β. Isto indica que a expressão aumentada do gene da matriz é uma característica fenotípica do miofibroblasto que se manifesta na diferenciação completa, ou talvez, terminal. É digno de atenção o facto de a 88

91 Fundamentos Teóricos supressão da expressão da α-actina do músculo liso resultar na redução da expressão do gene do colagénio (Hinz et al, 2002), afirmando, assim, o conceito de que uma expressão aumentada do gene do colagénio é manifestada apenas no fenótipo completamente diferenciado. Mais recentemente, uma supressão semelhante da expressão da α-actina do músculo liso inibiu a actividade promotora do factor de crescimento do tecido conjuntivo, o qual está associado a uma reduzida translocação nuclear (Chaqour et al, 2006). Assim, a manifestação do fenótipo que expressa a α- actina do músculo liso pode ser central para a aquisição de muitas das características notáveis do miofibroblasto completamente diferenciado, o que pode representar um acontecimento importante na indução e progressão da fibrose. (Shi-Wen et al, 2004; Bogatkevich et al\, 2001). A diferenciação de miofibroblastos é normalmente induzida pelo tratamento dos fibroblastos, ou de outras células percursoras susceptíveis, com TGF-β. Assim, a maioria dos estudos centrou-se em aspectos da sinalização do TGF-β que dão origem ao fenótipo diferenciado, com uma atenção principal na expressão do gene marcador, a α-actina do músculo liso. Para além de um requerimento básico para a tensão mecânica, a presença de um estímulo solúvel como o TGF-β, encontrado na zona inflamatória, e de outras citoquinas resulta numa diferenciação completa (Hinz et al, 2007). Existem diversas provas de várias vias da quinase, incluindo quinases Jun (JNK) e proteína activada pelo mitogénio (MAP) p38, apesar de, necessariamente, não estarem de acordo em todos os estudos (Hinz et al, 2007; Hashimoto et al, 2001). Para além de ser um marcador importante da diferenciação de miofibroblastos, e do seu papel na regulação do colagénio e expressão do gene do factor de crescimento do tecido conectivo (CTGF), a α-actina do músculo liso também tem sido implicada nas interacções com os componentes de sinalização, incluindo factores de transcrição com diferentes genes alvo (Furukawa et al, 2003; Wang et al, 2005; Deaton et al, 2005; Chaqour et al, 2006; Matsuoka et al, 2002). 89 O efeito bem conhecido do TGF-β na expressão da α-actina do músculo liso e a diferenciação de miofibroblastos sugerem a importância da via Smad

92 Fundamentos Teóricos associada ao TGF-β canónico. As provas in vitro indicam a importância do Smad3 na expressão da α-actina do músculo liso nos fibroblastos do pulmão (Hu et al, 2003) e a deficiência in vivo de Smad3 resulta numa redução significativa da fibrose pulmonar (Adam et al, 2005). Contudo, os mecanismos adicionais reguladores da expressão deste gene podem ser essenciais, como evidenciado por estudos que mostram uma multiplicidade de factores que podem regular a sua actividade promotora. Quatro áreas no promotor parecem ser de importância predominante: um elemento de ligação a Smad (SBE), uma região hipersensível ao TGF-β (THR), um elemento de controlo do TGF-β (TCE) e um elemento de ligação a C/EBP, quais são activados por Smad3, SP1/SP3, factores tipo Krüppel e C/EBPβ, respectivamente (Hinz et al, 2007). Permanecem por identificar a totalidade dos factores que podem interagir com estes locais no promotor, directamente e indirectamente via interacções com factores de ligação directa. Para além disso, ambos os factores de estimulação e inibição estão envolvidos na regulação destes locais. Por exemplo, os efeitos inibitórios do factor tipo Krüppel (GKLF) podem ser mediados directamente por interacção de ligação com o domínio MH2 do Smad3, reduzindo a sua ligação ao SBE (Adam et al, 2005; Hu et al, 2007). Relativamente ao C/EBPβ, a sua isoforma predominante, proteína activadora enriquecida no fígado (LIP), activa a diferenciação de miofibroblastos, enquanto que a isoforma truncada, proteína inibitória enriquecida no fígado (LIP), inibe a diferenciação (Hu et al, 2004). Contudo, os ratinhos com deficiência em C/EBPβ exibiram uma redução significativa na fibrose pulmonar, associada a uma presença reduzida de miofibroblastos (Hu et al, 2007). Os factores adicionais que podem desempenhar um papel importante incluem a via de sinalização Notch, a qual parece ser importante na transição mesenquimal-epitelial (Zavadil et al, 2004), enquanto que a YB-1 (proteína-1 de ligação à caixa Y), NF- B (factor nuclear) e PPAR (receptor- activado para proliferador do peroxissoma) podem ser importantes na supressão da diferenciação (Zhang et al, 2005; Mann et al, 2007). Assim, falta da inibição, bem como da activação por factores de 90

93 Fundamentos Teóricos transcrição estimuladores, podem ser essenciais na diferenciação de miofibroblastos. Outros factores parecem também estar envolvidos na diferenciação do proto-miofibroblasto em miofibroblasto maduro. Factores estimuladores de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) parecem induzir a síntese de α-sma in vivo (Rubbia-Brandt et al, 1991; Feugate et al, 2002), mas não, quando adicionado a culturas de fibroblastos (Rubbia-Brandt et al, 1991). Isto sugere que GM-CSF estimula o agrupamento dos macrofagos in vivo, que por sua vez expressa TGF-β1, estimulando desta forma a expressão de α-actina (Serini and Gabbiani, 1999). O aparecimento de miofibroblastos in vivo é muitas vezes precedido de uma acumulação de macrófagos. (Vyalov et al, 1993; Serini and Gabbiani, 1999). Segundo Kwon et al, (2006) o factor de crescimento epidérmico EGF (Factor de Crescimento Epidérmico, recombinante humano), também está envolvido na diferenciação. Os autores, através de um estudo experimental em ratos Sprague-Dawley divididos em dois grupos, avaliaram a cura de uma lesão através de um tratamento com uma pomada contendo rhegf e averiguaram uma melhoria significativa a partir do quinto dia no grupo tratado com a pomada, relativamente ao grupo tratado sem rhegf. Os autores presenciaram que rhegf aumenta significativamente a área imunorreactiva de α-actina (marcador do miofibroblasto). Sugerem que a contracção rápida da lesão induzida pelo rhegf se deve ao aumento da actividade miofibroblástica nos estágios intermédios do processo de cura de uma lesão. Park et al, (2000) e Babul et al, (2004), evidenciaram que rhegf pode regular negativamente a função de TGF-β sem que se averigúe intervenção na cicatrização. Grotendorst et al, (2004) referem que a acção de TGF-β no fibroblasto, proliferação fibroblástica, síntese de colagénio e a diferenciação miofibroblastica é mediada via CTGF-dependente (Factor de Crescimento do Tecido Conectivo), uma proteína mediadora autócrina de transformação de TGF-β. 91

94 Fundamentos Teóricos Noutro estudo (Grotendorst and Duncan, 2005), constataram que os dois domínios de CTGF produzem efeitos diferentes consoante a presença ou não de outros factores. O Domínio N-Terminal de CTGF induz a proliferação celular e síntese de colagénio quando relacionado com IGF-2. O Domínio C-Terminal de CTGF induz a proliferação celular, quando relacionado com EGF. O bloqueio da síntese de CTGF ou da sua acção inibe efectivamente o efeito de TGF-B no fibroblasto (Kothapalli et al, 1997; Duncan et al, 1999). Os autores Grotendorst et al, (2004) referem que uma sinalização combinada determina se o fibroblasto responde ao TGF-β, como mitogénico ou factor de indução-diferenciação. Os autores verificaram que a presença ou ausência de outros factores de crescimento como EGF ou IGF-2 (Factor de crescimento semelhante à insulina), são fundamentais para determinar a resposta biológica das células alvo. Quando as células são estimuladas com TGF-β ou CTGF, na presença de EGF ou outro co-mitogénico, imediatamente, todas as células são estimuladas à síntese de ADN e posterior proliferação. Se as mesmas células forem estimuladas com TGF-β ou CTGF na presença de IGF-2, expeditamente todas as células responderão através da diferenciação em miofibroblastos e aumento da síntese de colagénio. Se EGF for adicionado à cultura quando as células estiverem a ser activadas na presença de IGF-2, todas as células responderão com síntese de ADN mas não com diferenciação. Desta forma, a capacidade de estimulação da proliferação e diferenciação celular de TGF-β e do CTGF, depende de determinadas condições em que se encontram. No entanto, esta relação ainda permanece pouco clara. CTGF parece ser insuficientemente potente para que sozinho consiga induzir a diferenciação miofibroblástica (Yang et al, 2004) Outro indutor de α-actina in vitro, parece ser a heparina (Desmouliere et al, 1992), no entanto, in vivo parece requerer de TNF-α (Factor de Necrose Tumoral) 92

95 Fundamentos Teóricos As integrinas, também estão envolvidas na diferenciação dos protomiofibroblastos em miofibroblastos maduros (Dugina et al, 2001). A expressão do receptor α5β1 da fibronectina aumenta concomitantemente com o aumento de α-actina na diferenciação dos miofibroblastos (Masur et al, 1996, 1999). De facto, grandes aglomerações desta integrina estão presentes no fibronexus do miofibroblastos maduros (Dugina et al, 2001; Masur et al, 1999). A ligação das integrinas αβ1, αvβ3, e αvβ5 à vitronectina inibem a diferenciação de miofibroblastos maduros (Scaffidi et al, 2001). A função bloqueadora de anticorpos monoclonais contra essas integrinas induz a expressão de α-actina e a sua organização das fibras de stress, o que aumenta a contracção do colagénio (Scaffidi et al, 2001). A inexistência de contactos célula-célula também induz a diferenciação para miofibroblastos maduros. Esta ausência também causa um aumento do número de receptores TGF-β, resultando num aumento na expressão do α- actina pelo TGF-β (Rizzino et al, 1988). Lesões tratadas com anti-tgf β1 mostraram uma resposta inflamatória mais baixa e uma menor deposição de matriz extracelular nos estágios precoces do processo de regeneração (Shah et al, 1999). No entanto, em estágios tardios, TGF-B1 induz a apoptose miofibroblástica (Funato et al, 1997, 1999). Isto pode resultar no aumento da contracção da ferida e da formação cicatricial. Dado este papel bifásico do TGF-β1 durante o processo de cura, a sua eliminação poderá induzir problemas inesperados sendo importante aplicar um tratamento deste tipo em tempos programados. Outro tratamento possível poderá estar relacionado com o bloqueio da FN, o qual é essencial para a diferenciação do proto-miofibroblasto em miofibroblasto maduro (Balza et al, 1988; Serini et al, 1998). Um anticorpo contra a FN bloqueia a indução TGF-β1 através da expressão de α-actina e colagénio tipo I em culturas de fibroblastos (Serini et al, 1998). Sendo assim a eliminação da FN demonstra ser prometedor para a melhoria do processo de cura de uma lesão. 93

96 Fundamentos Teóricos Outra vantagem da FN é a de que está presente apenas em estado embrionário e nas lesões tecidulares, o qual atenua o risco de efeitos secundários (Kornblihtt et al, 1996). O relaxamento da tensão no colagénio reduz o α-actina, ED-A FN e níveis de TGF-β1 (Arora et al, 1999). Isto indica que a FN e TGF-β1 são necessários para a expressão de α-actina, sendo no entanto, também necessário a tensão como pré-requisito. Já posteriormente, Lygoe et al (2004) demonstraram que a diferenciação miofibroblástica, a deposição de matriz extra-celular (ECM) e o factor de transformação do crescimento (TGF-β1), estão intimamente ligados. Este conecção ocorre devido há existência da via de receptores das integrinas. As integrinas são uma família de receptores heterodímeros transmembranares da ECM, compostas por cadeias α e β não covalentes. Além da sua função adesiva, as integrinas medeiam importantes sinais de passagem, regulando diversas funções celulares incluindo a motilidade, proliferação e apoptose. Porém, certos sinais específicos das integrinas podem afectar a composição do tecido conectivo através da modulação da expressão de proteínas da ECM e da degradação de enzimas da matriz e seus inibidores. Além disso, as integrinas da família αβ podem activar a TGF-β1 latente, ligando-se ao factor de crescimento. Portanto, poder-se-á dizer que a expressão diferencial das integrinas pode ser uma característica da transição dos fibroblastos para miofibroblastos. De facto, demonstrações recentes in vitro indicaram que a regulação diferencial de receptores integrina (particularmente as αv integrinas) ocorre concomitantemente com a diferenciação celular em modelos de osteoblastos, oligodendrócitos, queratinócitos e diferenciação de miofibroblastos (Lygoe et al, 2004). A transição de fibroblasto para miofibroblasto pode ser modulada por uma variedade de estímulos, entre eles, factores de crescimento (TGF-β1) e ECM, sugerindo um possível papel para os receptores célula-matriz neste processo de diferenciação (Norman et al, 2000). Também Lygoe et al, (2004) demonstraram, nos seus estudos, que os receptores integrina, incluindo a subunidade αv e/ou β1, se encontravam envolvidos na diferenciação miofibroblástica induzida pela TGF-β1. A expressão de ambas (integrinas αv e β1) aumentava quando submetidas a um 94

97 Fundamentos Teóricos tratamento com TGF-β1, no entanto, na ocorrência de um bloqueio funcional das mesmas, estas induziam a inibição a TGF-β1. Além disso, o bloqueio das integrinas αv específicas, as αvβ5 e αvβ3, suprimiam a diferenciação dos fibroblastos em miofibroblastos na cavidade oral e pele. Já em relação às células renais, a prevenção da diferenciação foi vista apenas com o bloqueio da integrina αvβ5 e não com a αvβ3. Quando ocorrem danos, as células epiteliais e/ou endoteliais lesadas libertam mediadores inflamatórios que iniciam uma cascata de coagulação antifibrinolítica (Kumar et al, 2005), que desencadeiam a formação de coágulos de sangue e MEC (matriz extracelular) provisória. De seguida, a desgranulação plaquetária promove a vasodilação e uma maior permeabilidade dos vasos sanguíneos, enquanto os miofibroblastos estimulados e as células epiteliais e/ou endoteliais produzem metaloproteinases da matriz (MMP), que rompem a membrana basal, permitindo a mobilização eficiente de células inflamatórias para o local da lesão. As células epiteliais e endoteliais também segregam factores de crescimento, citoquinas e quimioquinas, que estimulam a proliferação e o recrutamento de leucócitos através da MEC provisória. Após a activação de vários mecanismos, também as células T ficam activas e segregam citoquinas profibróticas, como a IL-13 e o TGF-β (Li et al, 2006; Wynn et al, 2003), que, por sua vez, posteriormente activam os macrófagos e os fibroblastos. Os fibroblastos activados transformam-se em miofibroblastos de expressão de α- actina à medida que migram pela rede de fibrina para a lesão. As células epiteliais também podem sofrer transição epiteliomesenquimatosa (EMT), providenciando uma rica fonte renovável de miofibroblastos (Quan et al, 2006). Após a activação, os miofibroblastos promovem a contracção da lesão. Por último, as células epiteliais e/ou endoteliais dividem-se e migram através das camadas basais para regenerar o tecido danificado, o que completa o processo de cicatrização normal. Todavia, quando ocorrem lesões repetidamente, a inflamação crónica e a reparação causam uma acumulação exagerada de componentes da ECM (tais como 95

98 Fundamentos Teóricos ácido hialurónico, fibronectina, proteoglicanos e colagénios intersticiais), que contribuem para a formação de uma cicatriz fibrótica permanente. Na fase de remodelação, a síntese de colagénio novo pelos fibroblastos excede a velocidade a que é degradado, de forma que a quantidade total de colagénio continua a aumentar. Embora a inflamação normalmente preceda a fibrose, os resultados de modelos experimentais deste processo demonstraram que a fibrose não é sempre necessariamente conduzida pela inflamação, sugerindo que os mecanismos que regulam a fibrogénese são, em certa medida, diferentes dos que regulam a inflamação (Pardo et al, 2006). Isto poderia explicar a falta geral de eficácia dos mediadores anti-inflamatórios no tratamento da doença fibrótica e a necessidade de identificar as terapias antifibróticas alvo Sistemas de adesão dos Miofibroblastos Os miofibroblastos, após estimulação pela TGF-β (Desmoulière et al, 1993), expressam α-actina, formando estruturas especializadas de adesão com a matriz extra-celular (ECM) (Hinz et al, 2003). Segundo Hinz et al, (2004) os miofibroblastos do tecido de granulação de uma lesão, em contraste com os fibroblastos da derme, juntam fibras de stress em sítios de junção aderente intercelular tipo-caderina. No entanto, a função das junções aderentes (AJs) dos miofibroblastos, a sua composição molecular e o mecanismo da sua formação ainda é bastante desconhecida. O envolvimento de α-actina nas fibras de stress, concede uma alta actividade contráctil ao miofibroblasto (Hinz et al, 2001b), levando à formação de contactos especializados com a matriz extracelular (Hinz and Gabbiani, 2003a), que são chamados de adesões focais supermaduras (FAs) (Dugina et al, 2001) e fibronexus (um complexo transmembranar de microfilamentos contrácteis) in vivo. Contudo, uma correlação directa entre as fibras de tensão dentro da célula e a fibronectina fora dela é aparentemente evidente nos 96

99 Fundamentos Teóricos chamados fibronexus. Ao contrário dos contactos focais, estabelecidos entre as células e o substrato, o fibronexus parece estar envolvido na ligação das células com as matrizes extracelulares e com outras células. (Singer et al, 1984) A formação e transformação das adesões focais supermaduras (FAs), dá-se como consequência da diferenciação dos fibroblastos em miofibroblastos, as quais diferem das adesões focais supermaduras (FAs) clássicas pelos níveis significativos de tensina e pelo comprimento que atinge, cerca de 6-30µ comparativamente com 2-5µ das adesões focais supermaduras (FAs) clássicas que contêm na sua composição típica αvβ3 com integrina, vinculina, paxilina ou talina. Assim, transformando-se em adesões focais supermaduras (FAs). Dugina et al, (2001). A acção das FAs supermaduras é relevante, uma vez que, na interface entre as proteínas da ECM e das fibras de stress intracelulares, estas contribuem para a transmissão da força e tensão local, o que origina a comunicação indirecta célula-célula através dos campos de stress da matriz circundante (Hinz and Gabbiani, 2003). As fibras de stress dos miofibroblastos em contacto estão conectadas directamente aos sítios das junções aderentes (AJs) célula-célula tipo caderina. Esta relação tipo caderina foi descrita ultrastruturalmente como placa electrodensa que une microfilamentos que estão subjacentes à membrana plasmática dos miofibroblastos. Estes últimos encontram-se em contacto no tecido de granulação da lesão e em tecidos fibróticos. As junções aderentes estão ausentes em tecidos fibroblásticos normais que não desenvolvem fibras de stress (Gabbiani and Rungger-Brondle, 1981; Welch et al, 1990). Portanto, em contraste com os fibroblastos caderinanegativos da derme normal, os fibroblastos do tecido de granulação, expressam caderinas das quais OB-, N- e T-caderinas estão presentes em quantidades consideráveis. Os protomiofibroblastos expressam, predominantemente, a clássica caderina (tipo I), trivialmente designada por N- caderina. A sua expressão está associada, frequentemente, ao crescimento da migração celular. No entanto, também pode ser expressa nos fibroblastos durante a passagem da reacção estromal a tumor epitelial estando relacionado 97

100 Fundamentos Teóricos com a invasão das células epiteliais cancerígenas que exprimem a N-caderina (De Weber and Marcel, 2003). Hinz et al, (2004), mencionam que uma possível função para as junções aderentes (AJs) dos miofibroblastos é a transmissão intercelular de α-actina mediado por forças contrácteis, que requer contactos mecânicos resistentes. Estes autores, evidenciaram que a formação de junções aderentes e o nível de expressão de proteínas junções aderentes (AJs) aumenta nos fibroblastos do tecido de granulação durante a cura de uma lesão, e que a expressão muda de N- para OB-caderina com a diferenciação do fibroblasto, in Vitro e in Vivo. A expressão de uma caderina específica pode servir como marcador e/ou como modulador do estado de diferenciação dos fibroblastos e as junções aderentes (AJs) representam um potencial meio terapêutico para o tratamento das patologias fibrocontracteis. A caderina anti-ob, mas não os péptidos anticaderina-n, reduzem a contracção dos miofibroblastos dos géis de colagénio, o que sugere que as junções aderentes (AJs) são um instrumento para a actividade contráctil dos miofibroblastos. A especificidade de AJ do miofibroblasto conduz a um reconhecimento celular homotípico e a um aumento significativo da resistência mecânica dos contactos célula-célula. Documentam ainda que uma grande actividade contráctil de α-actina induz reforços de AJs. Segundo Hinz e Gabbiani (2003b), a interface entre a matriz extracelular e as fibras de stress intracelulares, contribuem para a transmissão da força e tensão local, o que origina a comunicação indirecta célula-célula, através dos campos de stress da matriz circundante. (Simonneau et al, 1995) Como já foi referido anteriormente, os miofibroblastos exibem proeminentes microfilamentos de actina citoplasmática (fibras de stress), e estão conectados entre eles através de junções aderentes e gap junctions. Estas células estão também em contacto com a matriz extra-celular (ECM) por contactos focais conhecidos por fibronexus (um complexo transmembranar de microfilamentos contrácteis) e pela proteína fibronectina da ECM (Powell et al, 1999). O fibronexus foi descoberto e caracterizado por Singer em 1979 e, 98

101 Fundamentos Teóricos posteriormente, relembrado por Eyden (1993). Esta estrutura de adesão facilita a ligação dos miofibroblastos à matriz extra-celular através de um complexo transmembranar αβ- integrina que, por sua vez, une as fibras de stress da actina dos miofibroblastos à fibronectina da ECM (Racine-Samson et al, 1997). Em suma, poder-se-á dizer então, que a capacidade dos miofibroblastos em realizar estes processos depende das mudanças no citosqueleto celular bem como no fibronexus regulado pela Rho e da expressão das integrinas que permite a ligação dos miofibroblastos à matriz extra celular (Racine-Samson et al, 1997). Lygoe et al, (2004), sugerem que os receptores célula-matriz têm um papel na diferenciação de fibroblasto a miofibroblasto. Já posteriormente, Lygoe e colaboradores (2004) demonstraram que a diferenciação miofibroblástica, a deposição de ECM e a TGF-β1, estão intimamente conectados. Esta ligação ocorre devido há existência da via de receptores integrinas. As integrinas são uma família de receptores heterodímeros transmembranares da ECM, compostas por cadeias α e β não covalentes. Além da sua função adesiva, as integrinas medeiam importantes sinais de passagem, regulando diversas funções celulares incluindo a motilidade, proliferação e apoptose. Porém, certos sinais específicos das integrinas podem afectar a composição do tecido conectivo através da modulação da expressão de proteínas da ECM e da degradação de enzimas da matriz e seus inibidores. Além disso, as integrinas da família αβ podem activar a TGF-β1 latente, ligando-se ao factor de crescimento. Portanto, poderse-á dizer que a expressão diferencial das integrinas pode ser uma característica da transição dos fibroblastos a miofibroblastos. De facto, demonstrações recentes in vitro indicaram que a regulação diferencial de receptores integrina (particularmente as αv integrinas) ocorre concomitantemente com a diferenciação celular em modelos de osteoblastos, oligodendrócitos, queratinócitos e diferenciação de miofibroblastos (Lygoe et al, 2004). A transição de fibroblasto a miofibroblasto pode ser modulada por uma variedade de estímulos, entre eles, factores de crescimento (TGF-β1) e ECM, sugerindo um possível papel para os receptores célula-matriz neste processo 99

102 Fundamentos Teóricos de diferenciação (Norman et al, 2000). Também Lygoe et al, (2004) demonstraram, nos seus estudos, que os receptores integrina, incluindo a subunidade αv e/ou β1, encontravam-se envolvidas na diferenciação miofibroblástica induzida pela TGF-β1. A expressão de ambas (integrinas αv e β1) aumentava quando submetidas a um tratamento com TGF-β1, no entanto, na ocorrência de um bloqueio funcional das mesmas, estas induziam a inibição a TGF-β1. Além disso, o bloqueio das integrinas αv específicas, as αvβ5 e αvβ3, suprimiam a diferenciação dos miofibroblastos em fibroblastos a partir da boca e pele. Já em relação às células renais, a prevenção da diferenciação foi vista apenas com o bloqueio da integrina αvβ5 e não com a αvβ3. Em suma, poder-se-á dizer então, que a capacidade dos miofibroblastos realizarem estes processos depende das mudanças no citosqueleto celular bem como no fibronexus e da expressão das integrinas que permite a ligação dos miofibroblastos à matriz extra celular (Racine-Samson et al, 1997). Os futuros estudos sobre estas várias áreas são essenciais para fornecer novos conceitos que podem ajudar a fornecer a via para abordagens translacionais inovadoras. Para desenvolver estratégias modernas que contrariam o mau funcionamento dos miofibroblastos em fibrose e podendo controlar a acção fisiológica e benéfica do miofibroblasto para a reparação do tecido, é necessário entender os mecanismos moleculares que regulam a formação e actividade do miofibroblasto. Durante os últimos quinze anos, a citoquina prófibrótica de transformação do crescimento β1 (TGFβ1) foi estabelecido como o mais potente indutor da diferenciação de miofibroblastos (Desmouliere et al, 1993; Ronnov-Jessen e Petersen, 1993). Porém, durante a reparação do tecido, os fibroblastos reparadores não só entram em contacto com um ambiente químico alterado mas enfrentam dramaticamente uma alteração mecânica. Na realidade, a expressão de α-actina exige, um ambiente mecanicamente contido e a acção de TGFβ1. Actualmente, podemos verificar que a tensão mecânica e TGFβ1 são de facto dois lados da diferenciação do miofibroblasto (Wipff e Hinz, 2008). 100

103 Fundamentos Teóricos É aceite que células dos fibroblastos percebem sinais mecânicos do ECM utilizando integrinas, isto é, as mesmas proteínas transmembranares que fazem de âncora para as fibras de tensão e o substrato através de um complexo de proteínas do citoplasma (Bershadsky et al, 2006; Chen et al, 2004; Giannone e Sheetz, 2006). O papel de sinalização das integrinas baseada nas adesões da ECM fica claro devido à sua maturação em resposta ao desafio mecânico. O reforço de locais de adesão sob tensão começa com integrinas que agrupa adesões que mais adiante se desenvolvem em complexos focais ao se associar com filamentos de actina. O aumento da tensão intracelular necessita ser equilibrado por um substrato mecanicamente resistente que conduza à amplificação do complexo focal em adesões focais clássicas (FAs) (Bershadsky et al, 2006). A análise ao Microscópio Electrónico dos miofibroblastos em tecido fibrótico e tecido de granulação de lesão revelou contactos de células ECM que não são formados por tecido conjuntivo normal de fibroblastos (Eyden, 2005). Análogos a este fibronexus, culturas de miofibroblastos desenvolvem especializadas adesões focais supermaduras (FAs), uma designação que responde ao aparecimento do mais longo (8.30 mm.) (Dugina et al, 2001) comparado com os FAs (2.6 mm.) de α-actina negativo (Geiger et al, 2001) Os miofibroblastos reduzem FAs de supermaduras para pequeno FAs clássicos depois da inibição de α-actina, ou seja, depois desta mediar a contracção (Hinz et al, 2003). Estes estudos sugerem que os fibroblastos ganham informação sobre o estado mecânico da ECM avaliando o nível de tensão das fibras das quais estão limitadas pelo tamanho das âncoras de ECM. Acredita-se que proteínas específicas nas adesões citoplasmáticas servem como sensores mecânicos e agem como interruptores moleculares que mudam o estado de conformação/activação quando força é aplicada. (Giannone e Sheetz, 2006). 101

104 Fundamentos Teóricos Porém, adesão mediada por interruptores mecânicos e sensores mecânicos não são necessariamente localizados dentro da célula. A primeira proteína da ECM identificada como uma proteína mecânico-sensível foi a fibronectina que revelou locais secretos para auto-fibrinogênese quando foi desdobrada (Zhong et al, 1998). As proteínas desdobradas podem revelar locais específicos semelhantemente ao das integrinas e assim a mudança dependente da célula de adesão e obter respostas como migração da célula, proliferação, sobrevivência e diferenciação assim como a organização e remodelação da ECM (Vogel e Sheetz, 2006). A activação dos factores de crescimento pelas integrinas faz-se por dois mecanismos distintos discutidos actualmente que parecem co-existir. No primeiro mecanismo que é sensível a inibidores de protease, as integrinas servem como um ponto de ancoragem comum para TGFb1 e activam as proteases. (Jenkins, 2007; Sheppard, 2005). O segundo mecanismo é independente de qualquer acção proteolítica e envolve forças de tracção que são directamente transmitidas ao LLC (large latent complex) por via das integrinas. O resultado configuracional muda o LLC o que é sugerido para liberar TGFb1 e/ou apresentar isto ao seu receptor. O que sugere quatro condições que precisam ser pelo menos satisfeitas para que este mude: (1) específica integrina que liga ao LLC, (2) a presença de actina contráctil para gerar força e/ou promover resistência mecânica, (3) incorporação de TGFb1 na ECM como LLC e (4) uma ECM que mecanicamente resistente a forças de tracção celulares exercidas pelo LLC (Wipff e Hinz, 2008). A primeira evidência que as integrinas podem directamente activar TGFβ1 independentemente de qualquer actividade proteolítica surgiu de estudos epiteliais de integrina ανβ6 (Annes et al, 2004; Jenkins et al, 2006; Munger et al, 1999). Muito recentemente, foi visto que a integrina ανβ5 e possivelmente a integrina ανβ3 podem activar directamente o TGF-β1 (Wipff et al, 2007). Verificou-se ainda em vários estudos que todas as integrinas contribuem para a activação de TGFβ1, embora interaja fisicamente com LAP 102

105 Fundamentos Teóricos (latency associated protein) (Sheppard, 2005). A primeira evidência directa para a contribuição da activação da tensão mecânica de TGFβ1 foi provida recentemente através de experiências com miofibroblastos que são activados pelo TGFβ1 na sua actividade contráctil. (Wipff et al, 2007). Induzindo a contracção dos miofibroblastos com trombina, angiotensina-ii e endotelina-1 aumentam a activação de TGFβ1; este efeito depende de ligação de integrina a LAP (latency associated protein) (Wipff et al, 2007). O terceiro elemento obrigatório para a activação de TGFβ1 através de integrinas é a incorporação do LLC no ECM (matriz extracelular). A relevância fisiológica da relação entre a ligação de LLC ao ECM e activação de TGFβ1 é compreensível no contexto de reparação de tecido conjuntivo e desenvolvimento progressivo da fibrose. Nestas situações, a resistência de ECM gradualmente aumenta com remodelação contínua da actividade de fibroblastos (Hinz e Gabbiani, 2003) Inibição miofibroblástica Os pericitos, assim como os miofibroblastos, expressam α-actina. (Gabbiani, 2003). Ambos expressam também ED-A FN (variante especifica da fibronectina) e Thy-1 (Glicoproteina membranar) em DcSSc (Difuse Cutaneous Systemic Sclerosis) na pele (Rajkumar et al, 2005). ED-A FN, inclui o segmento ED-A, que se encontra expresso apenas durante a embriogénese (Ffrench-Constant, 1995; Xia and Culp, 1995; Serini et al, 1998) e durante a cicatrização de uma lesão (Tomasek et al, 2002). Segundo Whitby e Ferguson (1991) durante a embriogénese, ED-A FN não induz a diferenciação de miofibroblastos maduros, porque nesta fase o TGF-β1 está ausente. Os autores (Hinz et al, 2001a) referem que a expressão de ED-A FN, precede o aparecimento do miofibroblasto α-actina -positivo, e é considerado um factor crucial na promoção para a formação de miofibroblastos. Segundo 103

106 Fundamentos Teóricos Serini et al, (1998) o bloqueio da interacção entre o ED-A FN e a superfície da célula in vitro inibe a indução de TGF-β à síntese de α-sma e formação do miofibroblasto. Concluíram que a síntese de novo de ED-A FN parece ser um pré-requisito para a expressão de α-actina e diferenciação miofibroblástica. Em relação à função hormonal, verifica-se que as hormonas endócrinas apresentam funções essenciais que só recentemente têm sido reconhecidas por diferentes investigadores (Ashcroft et al, 1997; Grose et al, 2002; Ashcroft et al, 2002). De facto, a hormona de crescimento (GH) é um exemplo de uma dessas hormonas que influencia o processo reparativo (Thorey et al, 2004). Thorey et al, (2004) estudaram o processo reparativo de cicatrização de lesões em ratos transgénicos com elevados níveis de soro bovino (bgh). O fenótipo mais notável foi o grande aumento da formação de tecido de granulação. Uma característica notável observada no tecido de granulação dos ratos transgénicos bgh foi o aumento do número de vasos sanguíneos, o que promove a angiogénese. No entanto, ainda neste estudo, foi detectado uma contracção não eficiente da lesão dos ratos transgénicos bgh, originando um atraso no fecho da lesão, o qual é mais pronunciado nos machos. Foi então sugerido pelos autores, que o fecho inicial da lesão foi devido às forças tradicionais que se desenvolveram por migração fibroblástica. Este atraso na cicatrização deveu-se a uma significante redução numérica dos miofibroblastos locais. Usando estudos in vitro com fibras de colagénio de stress, os mesmos autores identificaram a hormona crescimento (GH) como um inibidor do TGF-β, que é um indutor da diferenciação miofibroblástica, resultando na redução da actividade contráctil do fibroblastos. Foi também a partir deste estudo, sugerido que o tratamento sistémico com GH torna-se prejudicial para o reparo da lesão em indivíduos saudáveis. Já em relação a estudos efectuados in vitro, estes sugerem que o IFNgamma pode modular o fenótipo e a função dos fibroblastos durante o reparo da lesão. O IFN-gama diminui a expressão da α-actina nos miofibroblastos e inibe, de uma forma irreversível, a contracção dos fibroblastos aí existentes (Desmoulière et al, 1992; Moulin et al, 1998). Tem sido reportado que a IFN- 104

107 Fundamentos Teóricos gamma estimula a produção de colagenases pelos fibroblastos da lesão in vitro (Duncan and Berman, 1989) e que a mesma reduz a síntese de colagénio dos fibroblastos de lesões do palato de ratos in vitro (Cornelissen et al, 1999). O IFN-gamma apresenta, também, um papel importante na formação de tecido cicatricial, podendo ser usado como um agente terapêutico na redução da acumulação de colagénio numa lesão mucoperiostea do palato (Cornelissen et al, 2000). Os TGF-β são uma superfamília de factores de crescimento peptídicos multifuncionais (Roberts and Sporn, 1992). Embora existam muitas isoformas, apenas 3 destas TGF-β, existentes nos mamíferos, são reguladas de forma distinta e as suas expressões nos tecidos durante a embriogénese, fibrose e cicatrização são diferentes, no entanto, aparentam um comportamento semelhante na maioria das vezes (Shol et al, 1995; Frank et al, 1996). O TGFβ3, uma das isoformas referidas, apresenta funções distintas na cicatrização (Hsu et al, 2001). Cita-se, como exemplo, a reparação microcirúrgica do lábio leporino, medicado pela TGF-β3 com o intuito de regular a proliferação e migração das células mesenquimais no local de reparo (Kohama et al, 2002). A acção do TGF-β3 reduz a formação da cicatriz, alterando o balanço dinâmico da acumulação e degradação do colagénio tipo I. Os níveis elevados de TGFβ3 reduzem a deposição de colagénio tipo I restringindo a diferenciação miofibroblástica e portanto a síntese de colagénio. Também estas promovem a degradação de colagénio pela MMP-9, dado que a TGF-β3 estimula especialmente a expressão desta, bem como a sua actividade. Estes factos apresentam particular interesse, dado que o TGF-β1 e TGF-β2 apresentam efeitos opostos na formação da cicatriz. As metaloproteinases da matriz são secretadas como zimogénios inactivos e podem deteriorar vários componentes da matriz extracelular do tecido cicatricial incluindo o colagénio tipo I (Hosokawa et al, 2003). Um nível adicional de complexidade é sugerido pelas provas de que a regulação epigenética também poderá ser importante. Por exemplo, a inibição da desacetilase da histona (HDAC) ou da metilação do ADN suprime a diferenciação de miofibroblastos (Mann et al, 2007; Rombouts et al, 2002). No último caso, apresentam-se provas de que deve ser indirectamente mediado pela repressão de supressores da expressão da - 105

108 Fundamentos Teóricos actina do músculo liso, em vez de através de efeitos directos na metilação do promotor do gene da actina (Mann et al, 2007). Contudo, a análise directa do estado da metilação do gene da -actina do músculo liso, bem como a modificação de histonas associadas de perto a este gene, não têm sido sistematicamente empreendidas. Assim, esta breve visão geral salientou a complexidade dos mecanismos subjacentes a apenas um componente principal do fenótipo diferenciado do miofibroblasto. São necessários estudos futuros nestas áreas para lançar mais luz sobre as suas viabilidades como alvos no controlo da fibrose. Citocinas que inibem a diferenciação do miofibroblasto, incluem interferão-γ (IFN-γ) (Hansson et al, 1989), bfgf (Schmitt-Graff et al, 1994; Spyrou GE and Naylor, 2002), e prostaglandina E2 (Kolodsick et al, 2003) tanto in vitro como in vivo, o IFN-γ diminui a expressão do α-sma (Pittet et al. 1994; Spyrou GE and Naylor, 2002). Também bfgf inibe a diferenciação para miofibroblasto in vitro (Schmitt-Graff et al, 1994) e in vivo (Spyrou and Naylor, 2002; Kanda et al, 2003) Este, segundo Funato et al, (1997) induz a apoptose nos miofibroblastos na mucosa palatina de ratos. A ausência de factor de crescimento transformador (TGF-β1) em lesões, está relacionada com a diferenciação do miofibroblasto (Nodder and Martin, 1997). Isto conduz a uma menor contracção da lesão na formação da cicatrização. A eliminação de TGF-β1 pode então prevenir a contracção da lesão e cicatrização, um tema que tem sido estudado de forma intensa. Muitos desses estudos aludem uma forte redução de α-actina e também a redução de miofibroblastos maduros (Shah et al, 1992; Arora and McCulloch, 1999; Hinz et al, 2003). Neutralizando anticorpos contra TGF-β1, inibe significativamente a contracção da rede colagenosa da cicatrização fibroblástica do palato (Yokozeki et al. 1997). Estes anticorpos também previnem a formação de cicatriz durante o processo de cura de uma lesão da derme (Shah et al. 1992). 106

109 Fundamentos Teóricos 3.3. PATOLOGIA COM ENVOLVIMENTO DE MIOFIBRO-BLASTOS Miofibroblastos na cicatrização A cicatrização é um processo que se baseia numa perfeita e coordenada cascata de eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a repavimentação e a reconstituição do tecido (Mandelbaum et al, 2003). Tal facto é um processo dinâmico que envolve fenómenos bioquímicos e fisiológicos que se comportam de forma cadenciada a fim de garantir a restauração tecidular. Vários autores consideram que existem diferentes fases neste processo. Para alguns autores, processa-se em três fases distintas: 1) inflamatória; 2) proliferativa; 3) remodelação (Ortonne e Clévy, 1994). Outros classificam de uma forma mais complexa dividindo o processo em cinco fases principais: 1) coagulação, 2) inflamação, 3) proliferação, 4) contracção da ferida e 5) remodelação (Fazio et al, 2000). Clark (1993) dividiu a fase de reparação em três fases: 1) inflamação, 2) formação de tecido de granulação com deposição de matriz extracelular e 3) remodelação. Independentemente da classificação utilizada para o processo de reparação e cicatrização, os miofibroblastos, participam principalmente a partir da penúltima fase. São de extrema importância, pois para além da sua função na deposição de matriz extracelular (Bitu et al, 2006), são os responsáveis pela aproximação dos bordos de uma lesão aberta, permitindo o fecho progressivo através da sua função de contracção, a qual só é possível por possuírem α- actina incorporadas nas suas fibras de tensão (Hinz et al, 2001b, 2003b; Dugina et al, 2001; Singer et al, 1984; Arora et al,1994; Tomasek et al, 2002; Poh et al, 2005).Perto do final do processo de cicatrização, o número de miofibroblastos vai diminuindo como resultado da apoptose. Este é um processo essencial para a conclusão e equilíbrio da cicatrização. Falhas neste processo, foram identificadas e relacionadas com diversos estados patológicos (Gabbiani, 1996; Schmitt-Graff et al,1994). 107

110 Fundamentos Teóricos A falha na apoptose relativamente a uma população de miofibroblastos é o mecanismo que conduz a uma desordem fibrótica crónica. Zhang e Phan (1999). Da mesma forma que o autor anterior, Dreger et al (2002), referem que quando o ciclo de vida de um miofibroblasto não é regulada devidamente, os miofibroblastos persistem com uma força contínua e produção contínua de matriz extracelular, resultando numa fibrose patológica, cicatriz e doença fibrocontráctil. Em variações patológicas crónicas, tal como cicatrizes hipertróficas e lesões fibróticas, uma deposição excessiva de matriz extracelular pode persistir por vários anos (Tomasek et al, 2002). Durante a reparação normal da lesão, o tecido de granulação começa a desaparecer quando a epitelização se completa, através de uma massiva apoptose dos fibroblastos do tecido de granulação, ou seja, miofibroblastos e células vasculares. No entanto, é de referir que durante os fenómenos fibróticos este caminho apoptótico está fechado o que não acontece em situações normais (Gabbiani, 2003) Fibrose Pulmonar A fibrose pulmonar caracteriza-se por deposição de matriz extra-celular aumentada e celularidade, particularmente em relação aos fibroblastos no local da fibrose activa. Os miofibroblastos, com a sua manifestação de α-actina característica, surgem de novo na fibrose e crê-se que são a fonte principal da expressão de matriz intensificada e de citoquina profibrogénica (Kapanci et al, 1995; Kuhn et al, 1991; Mitchell et al, 1989; Zhang et al, 1994). Os números e a persistência destas células podem ser a base para evolução da doença em vez da resolução. Resultando em doença em fase terminal e num resultado fatal (Kaminski, 2003; King et al, 2001). Assim, compreender as origens, as expansões e os possíveis destinos destes fibroblastos activados é importante para desmascarar a patogénese fibrótica. 108

111 Fundamentos Teóricos A fonte celular desta matriz é a população celular do mesenquima que ocupa a lesão fibrótica durante o período activo da fibrose. Pode-se referir que esta população é heterogénea no que se refere ao número de fenótipos, sendo um desses, o miofibroblasto. Devido às propriedades inflamatórias das citoquinas produzidas pelos miofibroblastos, estas células aparecem com funções importantes na deposição da matriz extra-celular. Os mediadores por eles libertados, contribuem para a mobilização de células inflamatórias e, consequentemente, são importantes na intensificação ou prolongamento da inflamação que está normalmente associado à fibrose. Tal ampliação da resposta inflamatória pode resultar num feedback positivo permitindo uma intensificação e progressão da fibrose. Uma outra propriedade adicional dos miofibroblastos é a contractibilidade. Esta propriedade é importante para a contracção da lesão e talvez para o contributo da alteração das características mecânicas do pulmão fibrótico (Phan, 2002). A cinética relativa ao aparecimento ou desaparecimento dos miofibroblastos numa cicatrização normal e em modelos da auto- limitação da fibrose pulmonar é paralela nos dois processos, isto é, à iniciação e à sua resolução e consequente término, da fibrose activa (Zhang, et al, 1994). A persistência de miofibroblastos está directamente relacionada com o sucesso da resolução da patologia em pacientes com fibrose progressiva (Kuhn et al., 1991). Estas características são típicas do comportamento de uma célula inflamatória num tecido patológico e devidamente inflamado, suportando a designação de miofibroblastos como uma célula inflamatória. Os miofibroblastos, presentes no pulmão fibrótico, expressam α-actina e vimentina, no entanto, não expressam desmina. O mesmo não acontece nos miofibroblastos localizados na periferia e em áreas subpleurais da fibrose (Zhang, et al, 1994). Podemos concluir que a característica comum da fibrose pulmonar é a presença de focos fibroblásticos, áreas ricas em células mesenquimáticas, incluindo números aumentados de fibroblastos e miofibroblastos totalmente diferenciados. Esta população de células é a fonte celular fundamental de matriz extra-celular e é heterogénea relativamente a um número de fenótipos 109

112 Fundamentos Teóricos chave (Phan, 2002; Selman et al, 2001) A emergência de novo ou a génese dos miofibroblastos de expressão da α-actina está bem descrita em lesões fibróticas do pulmão, tanto no estudo de modelo humano como no de modelo animal. Contudo, através de uma série de critérios diferentes, incluindo a expressão de colagénio tipo I, Thy-1 (glicoproteína membranar), α-actina do músculo liso, ciclooxigenase (COX) -2, telomerase e caveolina-1 (Derdak et al, 1992), estas células parecem ser heterogéneas, talvez representando subpopulações distintas (Wang et al, 2006). Outro ponto importante é que estas características fenotípicas só aparecem no pulmão lesionado, sugerindo que estas células surgem de novo de células percursoras ou progenitoras, talvez por um processo de diferenciação, tendo em conta a estabilidade relativa de alguns dos fenótipos. Mas é pouco claro se estes diferentes fenótipos são características de subpopulações distintas com progenitores únicos ou se representam as diferentes fases de diferenciação a partir de um progenitor comum. Surgiram provas recentes que sugerem a existência de subtipos distintos de fibroblastos, em diferentes locais do corpo, com base nos seus padrões de expressão genética (Chang et al, 2002). Tal poderá argumentar para a presença de diferentes progenitores que, potencialmente, poderão dar origem a fenótipos diferenciados ou activados de forma diferente em resposta à lesão do tecido. Em qualquer dos casos, os subtipos diferenciados que se notam nos pulmões lesionados e fibróticos têm fenótipos que são consistentes com as suas importantes funções na promoção da fibrose. Assim, o fibroblasto que expressa a α-actina do músculo liso, conhecido como miofibroblasto, é apresentado como sendo a fonte predominante de colagénio do tipo I e de citoquinas inflamatórias/fibrogénicas, nas lesões fibróticas, e também como transmitindo propriedades mecânicas alteradas para tecidos afectados (Zhang et al, 1994; 2002). Thy-1- e a caveolina-1- também são associados aos pulmões fibróticos, e estes dois marcadores estão ausentes nos miofibroblastos (Hagood et al, 2005; Wang et al, 2006), indicando, desta forma, algum papel na fibrose. Consistente com tal papel está a observação de que a deficiência em caveolina-1 está associada ao desenvolvimento de lesões fibróticos nos pulmões, enquanto que a sua sobreexpressão induzida proporciona alguma 110

113 Fundamentos Teóricos protecção contra a fibrose (Wang et al, 2006). A importância da expressão da telomerase numa certa subpopulação, que é distinta dos miofibroblastos, continua por esclarecer (Nozaki et al, 2000; Liu et al, 2002; 2006), e é especialmente intrigante tendo em conta artigos recentes sobre mutações da telomerase em certas famílias com fibrose pulmonar idiopática (Tsakiri et al, 2007). Também não é claro se alguns dos fenótipos diferenciados, tais como a expressão deficiente de ciclooxigenase (COX-2), estão de qualquer maneira relacionados com os distintos miofibroblastos, os quais estão virtualmente presentes em todas as lesões fibróticas. Contudo, este tipo de análise dos fenótipos dos fibroblastos tem realçado o potencial papel patofisiológico e de aparecimento de novo destas diferentes subpopulações de fibroblastos na fibrose pulmonar, bem como tem sugerido a sua potencial interacção. Neste momento, é pouco claro se estes diferentes fenótipos representam várias fases de diferenciação que, em última instância, poderão conduzir ao miofibroblasto ou, em alternativa, se representam subpopulações independentes que surgem de progenitores distintos. Por conseguinte, uma análise rigorosa e uma boa compreensão destes subtipos ou subpopulações de fibroblastos diferenciados, e as suas potenciais inter-relações e/ou origens, deverão permitir conhecer a patogénese da fibrose progressiva em resposta a certos tipos de lesões pulmonares. (Armanios et al, 2007) A origem dos miofibroblastos é controversa, porém, estudos cinéticos sugerem que os miofibroblastos existentes em fibrose pulmonar derivam de fibroblastos peribranquiais e perivasculares (Zhang et al, 1994). Esta observação foi suportada por evidências bioquímicas e morfológicas in vitro efectuadas por Phan (2002). A persistência de miofibroblastos em lesões fibróticas leva a uma cicatrização excessiva com alteração funcional do órgão afectado. Quando tecidos estão lesados, localmente existem fibroblastos do tecido conectivo e células recrutadas de outras fontes que adquirem características do músculo liso formando fibras de tensão contrácteis e através de sobrexpressão de actina do músculo liso (α-actina) (Hinz, 2007). A alta actividade contráctil gerada por α-actina em fibras de tensão é um papel fundamental para a 111

114 Fundamentos Teóricos remodelação de tecido lesado como durante a sua recuperação. (Hinz et al, 2001a). De alta relevância clínica são os fenómenos retrácteis, causados por excesso de contracção dos miofibroblastos e da matriz extracelular (ECM) que segregam a actividade que caracteriza a grande maioria das doenças fibrocontrácteis. Isto inclui fibrose que afecta órgãos vitais, como coração (Virag e Murry, 2003), fígado (Desmouliere et al, 2003), rim (Lan, 2003) e pulmão (Phan, 2002) e fibrose que reduz a qualidade de vida em escleroderma (Rajkumar et al, 2005), cicatrizes hipertróficas (Desmouliere et al, 2003; Gabbiani, 2003), vias respiratórias e a doença de Dupuytren (Tomasek et al, 1999). Cisneros-Lira et al, (2003) observaram que a exposição ao fumo do tabaco, aumentou o número de miofibroblastos no septo alveolar, exacerbando uma resposta fibrótica pulmonar. Tanto em tecido pulmonar de pacientes, como em modelos animais, Kuhn et al, (1991) and Pache et al, (1998), confirmaram a presença de miofibroblastos, em pacientes com fibrose pulmonar. Estes miofibroblastos, parecem ser algo específicos de acordo com as suas características imuno-histoquímicas. Estes miofibroblastos seriam classificados de VA, uma vez que expressam α-actina e Vimentina.). Zhang et al, (1994), por outro lado, considera que a presença de miofibroblastos é responsável pela iniciação, resolução e consequente término, da fibrose pulmonar. A presença destas células especializadas, é proporcional ao sucesso da resolução da patologia (Kuhn and McDonald, 1991). Esta característica suporta a capacidade inflamatória do miofibroblasto, uma função, já referida. No que respeita ao Tumor Inflamatório Miofibroblástico Pulmonar, Hannah et al, (2007) concluem que este termo é falso em cerca de 50% de casos. Sugerem que estas lesões sejam separadas em dois subconjuntos principais, um para as lesões, mostrando diferenciação de miofibroblastos, e o outro para as linhas celulares da diferenciação do macrófago. 112

115 Fundamentos Teóricos Miofibroblastos Nas Neoplasias Os miofibroblastos, são responsáveis na reacção desmoplástica observada em muitos tipos de neoplasias, ou seja, a proliferação do tecido fibrogénico dentro de ou adjacente ao próprio tumor, e tem sido observado em carcinomas da glândula mamária, tumores do tipo carcinoide, na doença de Hodgkin, em melanomas malignos, entre outros (Frazier and Grotendorst, 1997). Uma acumulação local de células do tecido conjuntivo e de material extracelular é conhecida como reacção estromal, em tumores epiteliais. O miofibroblasto parece ser um dos componentes dessa reacção, sendo para Desmoulière et al, (2004), o tipo celular predominante, responsável pela deposição de colagénio bem como a remodelação, em tumores epiteliais primários e metastáticos. Com esta base, os miofibroblastos podem representar um novo alvo importante da terapia anti-tumoral. Os miofibroblastos têm um papel importante na promoção e regulação da transformação epitelial maligna e na manutenção da progressão do cancro, sugerindo que a modulação destas células, e consequentemente a reacção estromal, possam representar um alvo terapêutico até agora inexplorado para vários tipos de cancro. A proteína de activação fibroblástica (FAP) é uma proteína membranar tipo II expressa no tumor estromal fibroblástico em mais de 90% de todos os carcinomas. A FAP serve como marcador de diagnóstico e representa um potencial alvo terapêutico no tratamento de um vasto leque de carcinomas. Têm sido desenvolvidos anticorpos contra a FAP, o que poderá vir a ser uma ferramenta valiosa na análise do papel funcional da FAP face ao tumor, como também na avaliação da conveniência da FAP como marcador tumoral. Só recentemente se tornou possível demonstrar que a α-actina é um instrumento na produção de força pelos miofibroblastos in vivo e in vitro (Tomasek, 2002). Isto resultou na sugestão de que a modificação da α-actina poderia influenciar a capacidade de remodelação do tecido de granulação na cicatrização de lesão normal e patológica (Desmoulière et al, 2005). 113

116 Fundamentos Teóricos Os miofibroblastos podem também estimular a angiogênese e linfangiogênese através da expressão de factores pró-angiogênicos (Orlandini & Oliveiro, 2001). Adicionalmente, os miofibroblastos possuem a capacidade de proteger as células malignas da resposta imune do hospedeiro (Wever & Mareel, 2003). Lieubeau et al, (1999) demonstraram que as propriedades de contracção e síntese de matriz extracelular (MEC) pelos miofibroblastos dificultam a infiltração das células do sistema imune e inflamatório para dentro do tumor. Então, os miofibroblastos podem prevenir o contacto físico entre as células malignas e as células do sistema imune, um fenómeno essencial para a destruição das células tumorais (Wever & Mareel, 2003). Achados histológicos de diferentes tipos de neoplasias malignas demonstraram que os tumores que estão associados a uma baixa presença de miofibroblastos apresentaram uma maior reacção inflamatória, ao contrário de tumores associados a uma alta presença de miofibroblastos, em que as reacções imunes e inflamatórias foram escassas ou ausentes (Opdenakker et al., 1992). No tecido tumoral, o TGF- β1 pode ser derivado de células epiteliais, células inflamatórias ou dos próprios miofibroblastos (Galliher et al, 2006). O tratamento com interferon α ou γ reduz a expressão de α-actina pelos miofibroblastos (Gu et al, 2004). As culturas de fibroblastos e células tumorais de diferentes órgãos demonstraram induzir a proliferação celular e a emergência de miofibroblastos (Chen et al, 2005). Em geral, os miofibroblastos adjacentes às células neoplásicas expressam grandes quantidades de α-actina como observado nos carcinomas de mama (Sappino et al, 1988), melanoma metastático (Tsukamoto et al, 1992) e CEC oral (Lewiet al, 2004). O papel dos miofibroblastos na evolução do cancro não está completamente compreendido. Inúmeros eventos relacionados à oncogênese, incluindo proliferação, adesão, invasão e migração celular, podem ser regulados pelos produtos da síntese dos miofibroblastos (Baglole et al, 2006; Orimo et al, 2005; Wever et al, 2004; Lewis et al, 2004). 114

117 Fundamentos Teóricos Orimo et al, (2005) demonstraram que miofibroblastos são capazes de estimular a proliferação das células tumorais em carcinomas invasivos de mama via produção de níveis elevados do factor de crescimento derivado do estroma 1 (SDF-1). Em adição, o fator SDF-1 estimula a angiogênese nos carcinomas de mama, através do recrutamento de células progenitoras endoteliais. A libertação de PDGF e do factor de crescimento de queratinócitos (KGF) por miofibroblastos também foram demonstrados estarem associados a uma indução na proliferação das células tumorais (Mass-Szabowski et al, 2001). Indirectamente, a secreção de HGF/SF pelos miofibroblastos pode promover a invasão neoplásica através da inibição de E caderinas (Trusolino et al, 2002) Miofibroblastos Na Fibrose Hepática A fibrose hepática e a cirrose terminal são as principais características patológicas de muitas doenças hepáticas crónicas (Albanis et al, 2006; Bataller et al, 2005). A fibrose hepática pode conduzir a hipertensão portal e insuficiência hepática, e está associada a um risco aumentado de cancro hepático (Llovet et al, 2006). Embora a fibrose hepática tenha sido considerada uma doença progressiva e irreversível, os dados provenientes de modelos animais e de estudos em humanos começaram a desafiar o dogma de que a fibrose é irreversível (Fallowfield et al, 2006). Existem provas experimentais substanciais de que se a cirrose estiver suficientemente avançada, já não é possível revertê-la. Estudos recentes demonstraram que a diminuição de macrófagos no início da resolução da fibrose pode retardar a degradação da matriz extracelular (MEC) (Duffield et al, 2005). Isto sugere que os macrófagos poderão ser essenciais para iniciar a degradação da MEC. Desmoulière et al, (2005) referiu estudos em que a cirrose hepática é caracterizada pela secreção excessiva de proteínas da matriz devida há existência de miofibroblastos no fígado. A cirrose hepática, previamente considerada irreversível, pode ser remodelada com diminuição da expressão 115

118 Fundamentos Teóricos de colagénio tipo I e tecido inibidor de metaloproteinases (TIMP) mrna, activação das metaloproteinases da matriz (MMPs) e apoptose miofibroblástica Miofibroblasto Na Patologia Cardíaca Na paragem cardíaca, o excesso de fibrose intersticial é produzido pela activação de miofibroblastos, em resposta a sinais reguladores como a angiotensina II, aldosterona, ou relacionada com a libertação de TGF-β1 via parácrina (Gabbiani, 1998; Sou and Weber, 1996). Segundo o autor Jones (2005), no coração, a fibrose cardíaca está associada à proliferação fibroblástica, à transdiferenciação para miofibroblasto e ao aumento da deposição de colagénio. Soini et al. (2001), Rabkin et al. (2001), Otto et al. (1994), Olsson et al. (1994) referem que o aparecimento e localização de miofibroblastos no tecido valvular, está fortemente correlacionado com a desorganização da matriz, lesões degenerativas, aumento de MMP (metaloprotease de matriz), aumento dos níveis de mrna e fibrose, implicando o seu papel na doença valvular. Berk e colegas observaram as alterações estruturais na ECM e concluíram que embora todos os principais componentes do sistema renina angiotensina aldosterona possam apresentar actividade profibrótica, a ANG II parece ser a hormona dominante responsável pela fibrose cardíaca na doença cardíaca hipertensiva. A ANG II exerce os seus efeitos directamente através da estimulação da produção do TGF-β1 e desencadeando a proliferação e a diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos secretores de colagénio (Rosenkranz, 2004). Para além dos seus efeitos sobre a secreção e activação do TGF-β1, a ANG II intensifica directamente a sua sinalização. Por sua vez, posteriormente, o TGFβ1 pode aumentar mais a produção de colagénios intersticiais, fibronectina e proteoglicanos através dos miofibroblastos cardíacos (Gabbiani et al, 2002). 116

119 Fundamentos Teóricos O TGF-β1 também desencadeia a sua própria produção através de miofibroblastos, estabelecendo assim um ciclo autócrino de diferenciação e activação de miofibroblastos. A sobreexpressão do TGF-β1, em ratinhos transgénicos, resulta em hipertrofia cardíaca caracterizada por fibrose intersticial e crescimento hipertrófico dos miócitos cardíacos (Rosenkranz et al, 2002). Os doentes que sofrem de cardiomiopatia hipertrófica idiopática e de cardiomiopatia dilatada também têm níveis aumentados do TGF-β1, no miocárdio do ventrículo esquerdo (Li et al, 2002) Membros da família TGF-β, factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crescimento semelhante à insulina II (IGF-II) e IL-4 demonstraram ser os principais factores envolvidos na transdiferenciação dos fibroblastos em miofibroblastos (Powell et al, 2005; Desmoulière et al, 2004) MIOFIBROBLASTOS E A CAVIDADE ORAL Durante a cicatrização da lesão gengival, uma subpopulação específica de células diferenciadas são designadas por miofibroblastos (Hakkinen et al, 1996). A diferenciação de miofibroblastos é um evento importante na reparação de uma lesão gengival e na inflamação crónica. Os miofibroblastos gengivais têm uma capacidade aumentada de remodelar a matriz extracelular e esta característica foi associada a mudanças na distribuição da F-actina e na expressão do marcador dos miofibroblastos a α-actina. Entre os factores de crescimento que se manifestam na gengiva, o TGFβ1 é produzido de forma abundante quando este tecido é sujeito à inflamação ou cicatrização da lesão (Smith et al, 2006). Este factor de crescimento está igualmente incluído na indução do fenótipo miofibroblastico (Desmoulière 1993). 117

120 Fundamentos Teóricos Smith e seus colaboradores (2006) no estudo que realizaram mostraram que TGF-β1 activou GTPase RhoA, sendo esta a chave reguladora da actina do citoesqueleto. Em consequência deste evento, o factor de crescimento estimula as fibras de tensão e reforça as adesões focais de vinculinaenriquecidas. Estas respostas foram bloqueadas após a inibição de ROCK, o alvo principal da activação de RhoA. Considerando RhoA e sua quinase alvo principal Rho (ROCK) foram apontados por serem essenciais para a formação de complexos focais e de actina (Hotchin and Hall, 1995; Riento and Ridley, 2003). Smith et al, 2006, investigaram como se inicia a activação de RhoA uma vez que esta é controlada por TGF-β1 em fibroblasto gengivais. Estes estudos sugerem que a RhoA-ROCK activada por TGF-β1, seja o componente principal da família de Rho GTPase envolvida nas mudanças do citoesqueleto observadas durante a diferenciação dos miofibroblastos. Finalmente, concluiu-se que TGF- β1 promove a indução do fenótipo dos miofibroblastos com a activação da RhoA-ROCK em fibroblastos gengivais humanos MIOFIBRIBLASTOS E PATOLOGIAS CAVIDADE ORAL Fibromatose gengival hereditária A expressão excessiva de TGF-β1, pode resultar em situações fibróticas (Akagi et al, 1996; Roberts et al, 1996). Esta foi considerada uma citocina indutora responsável do fenótipo miofibroblástico, na Fibromatose Gengival (Bitu et al, 2006), na qual a manifestação mais proeminente, é uma excessiva acumulação de matriz extracelular, predominantemente colagénio tipo I (Araujo et al, 2003). 118

121 Fundamentos Teóricos A fibromatose gengival hereditária (FGH) é caracterizada por um aumento gengival fibroso e de crescimento lento, onde fibroblastos expressam níveis elevados de colagénio e factor de crescimento transformante β1 (TGFβ1). (Bozz et al, 1994). Os resultados do estudo realizados por Bitu e seus colaboradores (2006) sugerem que a presença de miofibroblastos em FGH é dependente dos níveis de expressão de factor de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF), e que mais de um mecanismo biológico está provavelmente envolvido no aumento gengival dos pacientes afectados por esta doença Cicatrização de lesão do palato A maioria dos estudos sobre miofibroblastos foram feitos na pele, embora as diferenças e as similaridades entre a cicatrização na derme e na cavidade oral sejam discutíveis. As mais notáveis diferenças são que lesões na mucosa oral sofrem reparação mais rapidamente e com menos cicatrizes do que as lesões cutâneas. Apesar disto, as características específicas do mucoperiosteo palatino causam a contracção extensiva da ferida e formação de tecidos de cicatrização. Este conhecimento deve ser tido em consideração para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas para melhorar o resultado da cirurgia de fissura congénita do palato (Van Beurden et al, 2005) Mixoma Odontogénico Os mixomas são originários de células mesenquimais primitivas que possuem características de fibroblastos modificados que perderam a capacidade de produzir colágeno maduro e secretar fibras de colágeno imaturas, assim como ácido hialurônico em excesso (Guilllermo et al, 2008). Microscopicamente o mixoma de tecidos moles está constituído por uma proliferação de células fusiformes, estroma mucóide abundante e espaços vasculares finos. Tem sido comprovado que as células neoplásicas são 119

122 Fundamentos Teóricos fibroblastos modificados, negativos para a proteína S-100 e desmina, e positivos para vimentina (Martinez-Mata et al, 2008). O Mixoma odontogénico é uma neoplasia benigna localmente infiltrativa, constituída por células fusiformes, angulares e arredondadas dispersas num abundante estroma mucóide. É definido classicamente como uma lesão tumoral desenvolvida a partir de estruturas dentárias, no entanto a sua etiopatogênese ainda é motivo de discussão. (Reichart and Phillipsen 2004). A maioria dos autores concorda com uma origem mesenquimal do MO, principalmente derivada de fibroblastos modificados ou miofibroblastos (Gundlanch and Schulz 1977, Hasleton et al, 1978). O achado mais significativo nos fibroblastos modificados (mixoblastos) foi a presença de um conglomerado de filamentos no citoplasma dispostos de forma desorganizada e presente em maior quantidade quando comparado aos fibroblastos presentes na mesma lesão. Também Martinez-Mata et al, (2008) concluíram que MO é uma lesão de origem mesenquimal e que possivelmente tenha sua etiologia a partir de células fibroblásticas ou miofibroblásticas modificadas e de seus produtos secretados Carcinoma Espino Celular (CEC) Os mecanismos de indução do estroma tumoral pelas células neoplásicas e o seu papel no controle da carcinogênese não estão completamente compreendidos. Existem fortes evidências de que ocorra uma estimulação recíproca entre as células tumorais e os componentes do estroma através da secreção de fatores de crescimento, citocinas, proteases e proteínas da MEC, promovendo a proliferação, sobrevivência e invasão das células tumorais (Baglole et al, 2006; Orimo et al, 2001; 2005; De Wever et al, 2004; Lewis et al, 2004). Uma das características mais evidentes durante o 120

123 Fundamentos Teóricos desenvolvimento do estroma tumoral é a presença de miofibroblastos. Existem inúmeros estudos que demonstraram a presença de miofibroblastos no estroma tumoral, incluindo aqueles que utilizaram cancro de mama (Ronnov- Jessen et al, 2002; Sieuwerts et al, 1998), próstata (Untergasser et al, 2005; Olumi et al, 1999), pulmão (Cekanova et al, 2006), bexig (Kuroda et al, 2006), colo rectal (Kuroda et al, 2005) e fígado (Mikula et al, 2006). Miofibroblastos também foram encontrados em carcinomas espinocelulares de cavidade oral, faringe e laringe (Kojc et al, 2005; Barth et al, 2004; Lewis et al, 2004). Estudos realizados com cancro de mama, rins, uretra e cólon também demonstraram a ausência de miofibroblastos no estroma de tecidos normais além do frente invasiva do tumor (Kuroda et al, 2006; Cimpean et al, 2005; Kuroda et al, 2005). Por outro lado, carcinoma ductal in situ altamente pleomórfico da mama e carcinoma urotelial de bexiga não-invasivo induziram o aparecimento de miofibroblastos no estroma subjacente às células neoplásicas, demonstrando que factores derivados das células tumorais agressivas são capazes de se difundir através da membrana basal, estimulando a transdiferenciação dos miofibroblastos (Shimasaki et al, 2006; Chauhan et al, 2003). Yazhou et al, (2004), analisando parâmetros prognósticos para os carcinomas ductais de mama, encontraram uma marcante correlação entre a presença dos miofibroblastos e presença de metástases linfonodais, graduação histológica e alta densidade microvascular do tumor, sugerindo que a presença dos miofibroblastos é associada a um pior prognóstico para o paciente. Galie et al, (2005), utilizando células epiteliais de cancro de mama e células do estroma da mesma lesão, concluiram que as células tumorais induzem um estroma altamente vascular e invasivo com presença de miofibroblastos. Adicionalmente, a presença dos miofibroblastos correlacionou significantemente com o desenvolvimento de metástases, visto que a infiltração destas células precede o recrutamento de células endoteliais em micrometástases avasculares, gerando um estroma específico para a angiogênese do tipo sinusoidal e portal (Olaso et al, 2003). 121

124 Fundamentos Teóricos Estes resultados reforçam nossos resultados clínicos da importância da presença dos miofibroblastos para o comportamento tumoral. Citocinas secretadas pelas células tumorais ou pelas próprias células do estroma tumoral são os mais prováveis candidatos para induzir a emergência dos miofibroblastos no estroma tumoral (Desmouliere et al, 2004). Estudos in vivo e in vitro têm demonstrado que células derivadas de CECs orais produzem elevadas quantidades de citocinas e factores de crescimento, incluindo TGFβ1, TGF-α, IGF e ILs (Jackson-Bernitsas et al, 2006). Krtolica et al, (2001) demonstraram que os componentes da MEC secretados pelos miofibroblastos são responsáveis pela proliferação das células tumorais. Por outro lado, Tokunou et al, (2001) demonstraram que a síntese de HGF/SF por miofibroblastos induz a proliferação das linhagens celulares de adenocarcinoma de pulmão. Mais recentemente, Shao et al, (2006) demonstraram que miofibroblastos estimulam a proliferação das células epiteliais intestinais via secreção do factor de crescimento epidérmico anfiregulina. É nítido que outros estudos são necessários para determinar se os efeitos dos miofibroblastos na indução da proliferação das células tumorais são dependentes da síntese de fatores de crescimento, da secreção de componentes da MEC ou ambos. A migração das células tumorais pelo tecido conjuntivo é um fenómeno essencial para a invasão e metástase tumoral. Este evento é acompanhado por alterações nas interacções entre as células e a MEC e pela secreção de enzimas proteolíticas capazes de degradar os componentes da matriz. As principais enzimas proteolíticas associadas à degradação da MEC são as pertencentes à família das MMPs (Vansaun and Matrisian, 2006). 122

125 MATERIAL E MÉTODOS

126

127 Material e Métodos 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA A amostra estudada abrange 90 indivíduos, da consulta de Medicina Dentária do Hospital Senhora da Oliveira Guimarães, a Norte de Portugal, entre os anos de 2003 e A todos os indivíduos foi aplicado um protocolo de trabalho, previamente definido, onde se registaram os principais elementos da sua identificação, história clínica e localização exacta da colheita. Nos indivíduos dos grupos I e II foram ainda registados os elementos relativos às patologias diagnosticadas AVALIAÇÃO CLÍNICA A avaliação clínica foi feita através de uma anamnese e de um exame objectivo. Na anamnese, foi elaborado um questionário sobre as principais patologias locais e sistémicas, presentes ou passadas, hábitos e terapêuticas. No exame objectivo foi efectuada uma observação clínica intra e extra-oral. No exame extraoral, foram despistadas as principais alterações esqueléticas, de pele e mucosas. No exame intraoral, foram avaliadas as mucosas de revestimento, mastigatória e especializada. Foram ainda observadas as 125

128 Material e Métodos principais inserções de freios, tumefações, pigmentações endógenas e exógenas dos tecidos moles e duros. Procedeu-se ao preenchimento de uma ficha clínica periodontal para os respectivos registos. O diagnóstico de periodontite teve por base o índice de extensão e severidade (Carlos et al, 1986) Os diagnósticos das diferentes patologias da cavidade oral tiveram por base avaliações com critérios anátomo-patológicos. Após a avaliação clínica e histopatológica, os indivíduos foram distribuídos pelos respectivos grupos de estudo da seguinte forma: Grupo I: foram aqui colocados todos os indivíduos que não apresentaram qualquer patologia sistémica ou localizada. Foram classificados como clinicamente saudáveis e serviram como grupo de controlo. Grupo II: foram aqui colocados todos os indivíduos que não apresentaram qualquer patologia sistémica mas evidenciaram perda de inserção clínica de leve a moderada. Clinicamente foram classificados como indivíduos com periodontite leve a moderada e sendo classificados como grupo de periodontite. A classificação leve a moderada foi baseada na classificação de Armitage, Grupo III: foram aqui colocados todos os indivíduos que apresentaram outras patologias da cavidade oral, previamente diagnosticadas. Clinicamente foram classificados de acordo com as diferentes patologias e serviram como base de referência para o estudo comparativo com outros dois grupos. As patologias estudadas foram: leucoplasia, carcinoma espinocelular, líquen plano, fibroma, hiperplasia fibro-epitelial, epúlide fibrosa e epúlide granulomatosa. 126

129 Material e Métodos 4.3. TÉCNICA DE COLHEITA Os tecidos foram colhidos em ambiente asséptico, pela técnica de biópsia convencional, ao nível da região vestibular dos 3º e 4º quadrantes, na transição entre a gengiva livre e gengiva aderida com tamanhos que oscilaram entre os 2x2mm e os 10x5mm.Todas as biópsias foram efectuadas com anestesia loco-regional à base de lidocaína a 2%, após consentimento prévio do paciente obtido por escrito de forma esclarecida e voluntária, em modelo próprio, aprovado pela comissão de ética do Hospital Senhora da Oliveira Guimarães FIXAÇÃO Todos os tecidos estudados em microscopia óptica foram fixados com formaldeído tamponado a 10%, numa quantidade de correspondeu a pelo menos dez vezes o volume do tecido fixado. Os tecidos estudados em microscopia óptica foram fixados em tampão cacodilato de sódio a 0,1 M (ph 7,4). Em alguns casos foi feito o processamento directo a partir da fixação para microscopia óptica PROCESSAMENTO Processamento dos tecidos para microscopia electrónica A partir das amostras incluídas em blocos de parafina, efectuou-se uma selecção da área de maior interesse, a qual foi removida, cuidadosamente, com ajuda de um bisturi. O fragmento foi cortado em pequenos pedaços e colocados em xilol durante 24 horas de modo a remover toda a parafina. Seguiu-se uma hidratação numa série decrescente de álcool com passagens de 1 hora em etanol a 100% e de 30 minutos em etanol a 90% e 70%, sempre 127

130 Material e Métodos com duas mudanças para cada álcool. De seguida, os fragmentos foram mergulhados em tampão cacodilato de sódio a 0,1 M (ph 7,4) durante 1 hora e 30 minutos, fazendo mudanças do tampão a cada 30 minutos. Seguiu-se a etapa de pós-fixação durante 1 hora (a 4ºC) com tetróxido de ósmio a 1%, em tampão cacodilato de sódio a 0,1 M (ph 7,4). Posteriormente, efectuou-se uma desidratação numa série ascendente de álcool, com passagens de 10 minutos por soluções de etanol a 50%, 75%, 90% e 95%, sempre à temperatura de 4ºC, seguidas de três passagens, também de 10 minutos cada, em etanol absoluto. Na última mudança de etanol absoluto o processamento passou a ser à temperatura ambiente. Seguiram-se mais duas passagens, de 10 minutos cada, mas agora por óxido de propileno. A impregnação das amostras na resina de inclusão consistiu em submeter os fragmentos em misturas de óxido de propileno e uma resina tipo Epoxy (Epon) nas proporções de 3:1, 1:1 e 1:3, respectivamente, com a duração de 1 hora em cada mistura. Finalmente os fragmentos foram mergulhados em Epon puro, no qual ficaram durante 1 hora à temperatura ambiente e durante 30 minutos a 50ºC. Seguiu-se a inclusão, realizada em moldes de borracha os quais, depois de preenchidos com um fragmento em cada extremidade e cheios com Epon, foram colocados na estufa à temperatura de 60ºC durante 2 dias para polimerização da resina. Os cortes ultrafinos foram obtidos com uma faca de diamante, num ultramicrótomo (Leica Ultracut R), e recolhidos em grelhas de cobre com 200 mesh. Uma dupla contrastação dos cortes foi efectuada manualmente, tendo-se emergido, primeiramente, as grelhas com os cortes numa solução salinada de acetato de uranilo durante 20 minutos e posteriormente, numa solução de citrato de chumbo durante 10 minutos (Reynolds, 1963). A observação foi feita num microscópio electrónico de transmissão JEOL 100CXII, no qual foram efectuados registos de algumas imagens sob a forma de microfotografias. 128

131 Material e Métodos Processamento dos tecidos em histoquímica Coloração de Hematoxilina Eosina A coloração de Hematoxilina-Eosina foi usada em todos os tecidos estudados como primeira coloração. É o principal método histoquímico efectuado na rotina histopatológica, acompanhando sempre técnicas complementares de diagnóstico como a imuno-histoquímica. É utilizada por ser aquela que nos oferece uma relação núcleo-citoplasma mais fidedigna e por ser a que melhor demonstra a arquitectura tecidular, sendo uma técnica capaz de demonstrar os principais elementos tecidulares: o núcleo, o citoplasma e o colagénio. Princípio: Esta técnica tem por base a conjugação de dois corantes com propriedades químicas diferentes, agem sucessivamente um corante nuclear básico (hemateína) e um corante citoplasmático ácido (eosina). A Hematoxilina é um corante aquoso e de carácter básico, com afinidade para estruturas basófilas como o núcleo. A eosina é um corante aquoso de carácter ácido, com afinidade para estruturas acidófilas como o citoplasma Nesta coloração os núcleos coram de azul-escuro/ preto, o citoplasma e fibras conjuntivas de rosa / vermelho Procedimento técnico: Os tecidos foram preparados tendo por base o protocolo aferido pelo laboratório de Anatomia Patológica e seguiu os passos que a seguir se descrevem: Os tecidos foram submetidos a três banhos sucessivos em xilol, estando precisamente 10 minutos em cada banho. Em seguida, os tecidos foram hidratados passando para tal por uma série descrescente de álcoois, respectivamente a 100%, 95%, 80%, 50% e finalmente colocados em água. 129

132 Material e Métodos Depois de lavados, foram corados pela hematoxilina durante 3 minutos, e novamente lavados em água para serem de seguida colocados no Ácido Clorídrico para diferenciação. Seguidamente foram lavados em água corrente durante 10 minutos e posteriormente corados pela eosina durante 3 minutos. Depois de corados pela eosina, os cortes foram lavados, removidos os excessos de corante e depois secos em estufa durante 10 minutos. (Entellan ). Depois de secos os cortes, procedeu-se à montagem em meio resinoso Tricrómio de Masson Especial Esta coloração especial foi particularmente importante na identificação das fibras de colagénio e sua localização, para a compreensão de processos patológicos associados aos miofibroblastos, como a expressão do tecido conjuntivo no processo de reparação, e padronização das alterações histológicas em resposta a agressões físicas ou químicas. Princípio: A coloração foi efectuada inicialmente com um corante ácido, a solução de Ponceau-Fucsina ou Fucsina Ácida, a qual corou todas as estruturas acidófilas (citoplasma, músculo, colagénio). O corante foi retirado das fibras de colagénio por diferenciação com ácido fosfomolíbdico, permanecendo ligado ao citoplasma e músculo. O ácido fosfomolíbdico actua também como mordente para o azul de anilina. Para a coloração nuclear, foi utilizado o azul-celeste, seguido de uma hematoxilina de hemalúmen, pois desta forma obtivemos uma forte coloração nuclear, que é resistente à acção do ácido utilizado. 130

133 Material e Métodos Procedimento: Foi feita inicialmente uma desparafinação a que se seguiu a hidratação e lavagem. Os tecidos foram passados por água destilada e corados com azulceleste durante 5 minutos. De seguida, os cortes foram escorridos e corados os núcleos com Hematoxilina de Gill durante 5 minutos. Cobriram-se com álcool-pícrico durante 5 muinutos e depois foram abundantemente lavados com água corrente. Depois de bem lavados, foram corados durante 5 minutos pela solução Ponceau-Fucsina. Lavaram-se de seguida com água destilada e colocaram-se a morder com Ácido Fosfomolíbdico 1% durante 5 minutos. Foram novamente lavados com água destilada e corados pelo azul de anilina num tempo que variou entre 2 e 5 minutos. Finalmente e após nova lavagem em água destilada foram desidratados os tecidos, diafenizados e posteriormente montados em meio resinoso. Os resultados encontrados nos diferentes cortes foram de acordo com a técnica clássica, ou seja, os núcleos coraram de azul escuro, o colagénio de azul, as fibras musculares de vermelho, os eritrócitos de amarelo a laranja, os citoplasmas de vermelho, as estruturas nervosas de azul e o fibrinogénio de vermelho escuro. Preparação de soluções: As diferentes soluções usadas para o tricrómio foram preparadas de acordo com os protocolos clássicos, nas proporções que a seguir se descrevem: 131

134 Material e Métodos Fucsina ácida: Fucsina ácida Ácido Acético glacial Água destilada 0,5 g 0,5 ml 99,5 ml Ácido Fosfomolíbdico a 1%: Ácido Fosfomolíbdico Água destilada 1 g 100 ml Azul de Anilina: Azul de Anilina Ácido Acético glacial Água destilada 2 g 2,5 ml 97,5 ml Van Gieson Princípio: A técnica de Van Gieson foi usada por ser uma coloração simples, rápida e específica para as fibras de colágenio. É uma coloração tricrómica composta por um corante nuclear e uma solução constituída por uma mistura de dois corantes ácidos (ácido picríco e fucsina ácida). O ácido pícrico actua como diferenciador do azul-celeste e como corante para estruturas como, músculo, fibrina e eritrócitos, que possuem a capacidade de reter pequenas moléculas. A Fucsina-Ácida cora as estruturas mais laxas, como o colagénio por ser constituído por moléculas maiores e menos difusas. 132

135 Material e Métodos Procedimento: Os tecidos foram inicialmente desparafinados e hidratados. Depois, de forma sequencial foram corados os núcleos pela solução de azul-celeste. De seguida, as lâminas foram escorridas e coradas pela Hematoxilina de Gill durante 5 minutos. Foi feita de seguida a lavagem em água corrente e a diferenciação em álcool-ácido. Depois de bem diferenciados os tecidos foram lavados abundantemente durante 10 minutos e corados em seguida pela solução de picro-fucsina de Van Gieson durante 3 a 5 minutos. Para finalizar, os cortes foram escorridos, lavados em água abundante, seguindo-se as fases de desidratação, diafenização e montagem. Resultados: Os resultados foram de acordo com os protocolos estabelecidos, ou seja os núcleos coraram de azul/preto, o citoplasma, músculo e glóbulos vermelhos de amarelo e o colagénio de vermelho. Preparação de soluções: As diferentes soluções usadas para o Van Gieson foram preparadas de acordo com os protocolos clássicos, nas proporções que a seguir se descrevem: Azul Celeste Azul Celeste B Sulfato de Ferro Amónio Glicerina Água destilada 2,5 g 25 g 70 ml 500 ml Dissolver o Sulfato de Ferro Amónio em água destilada fria com agitação, de seguida adicionar o Azul Celeste e ferver esta solução durante poucos minutos. Depois de a solução arrefecer, filtrar e adicionar a glicerina. 133

136 Material e Métodos Picrofucsina de Van Gieson: Solução saturada de ácido pícrico Solução aquosa de fucsina ácida 1% 100 ml 10 ml 4.6.TÉCNICA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA Os tecidos estudados foram submetidos a uma técnica imunohistoquímica para avaliação da presença de actina, vimentina, desmina e p63 utilizando os anticorpos NCL SMA, NCL-L-VIM-572, NCL-DESM-DERII e NCLp63 (mouse monoclonal antibody, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK), respectivamente. Para este efeito, as lâminas com cortes histológicos foram desparafinadas durante 20 minutos em xilol e hidratadas numa série decrescente de álcoois até à água (álcool 100 % 5 minutos, álcool 100% 5 minutos, álcool 70% 5 minutos, álcool 50% 5 minutos e água corrente 5 minutos). As amostras utilizadas foram fixadas com formaldeído tamponado a 10% e incluídas em parafina. O processo de fixação de tecidos em formaldeído proporciona a formação de ligações cruzadas que mascaram os epítopos antigénicos. Assim sendo, alguns anticorpos requerem recuperção antigénica para detectar o seu epitopo antigénico específico. Nesta série, com os anticorpos anti-vimentina e anti-actina não foi necessário proceder à recuperação antigénica visto que estes anticorpos detectam os seus epitodos antigénios específicos sem que seja necessário quebrar as ligações cruzadas provocadas pela fixação em folmaldeído. No entanto, para a detecção dos epitopos antigénicos p63 e desmina, foi necessário realizar a recuperação antigénica utilizando altas temperaturas. Neste trabalho, a recuperação antigénica foi efectuada com uma solução comercial (RA Epitope Retrieval Solution ph6, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK) 134

137 Material e Métodos semelhante à solução de tampão citrato original (10mM, ph=6,0), em banhomaria a 98ºC durante 30 minutos. O sistema de detecção utilizado para a reacção de imuno-histoquímica foi um kit de detecção com polímero de peroxidase (Novolink Polymer Detection System, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK), sendo que a detecção dos diferentes tipos de anticorpos foi efectuada seguindo as instruções do fabricante deste sistema de detecção: Bloqueio da Peroxidase endógena com a Peroxidase Block, durante 5 minutos; Inibição das reacções inespecíficas com Protein Block, durante 5 minutos; incubação dos anticorpos primários (anti-actina, diluição 1/200 e incubação durante 15 minutos à temperatua ambiente; anti-desmina, diluição 1/50 e incubação à temperatura ambiente durante 60 minutos; anti-vimentina, diluição de 1/200 e incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos; anti-p63, diluição 1/10 e incubação à temperatura ambiente durante 60 minutos); incubação do reagente Post Primary Block, durante 30 minutos; Incubação com Polymer, durante 30 minutos; Revelação com DAB, durante 5 minutos. Após a marcação imunohistoquímica, os cortes histológicos foram contrastados com Hematoxilina, durante 2 minutos, desidratados numa se série crescente de álcoois (álcool 50 % durante 2 minuto, álcool 80% durante 2 minutos, álcool 95% durante 2 minutos, duas vezes álcool 100% durante 2 minutos), diafanizados em xilol e montados. A precisão da técnica de imuno-histoquímica depende da obtenção de uma marcação altamente específica prevenindo a reaccções inespecífica do anticorpo primário no tecido. Na imuno-histoquímica é necessário assegurar que cada anticorpo é utilizado na diluição apropriada, não evapore durante a incubação e que seja removido completamente, se não estiver ligado, antes que o próximo reagente seja adicionado. Por esta razão em cada ensaio realizado foram incluídos lâminas com cortes histológicos de tecidos com presença dos epitopos antigénicos em questão e, antes da realização da técnica, procedeu-se à padronização das condições mais adequadas, adaptando-se para cada anticorpo primário, a utilização de recuperação antigénica e o tempo de incubação, temperatura e diluição do anticorpo 135

138 Material e Métodos primário. A técnica foi realizada em câmara húmida e cada corte foi isolado com caneta hidrofóbica. Em cada reacção, foram incluídos cortes histológicos de apêncide ileo-cecal como controlo positivo para o anticorpo anti-actina, antidesmina e anti-vimentina, e cortes histológicos de próstata como controlo positivo para o anticorpo anti-p63. Após a marcação imuno-histoquimica de todos os casos com os quatro anticorpos procedeu-se à avaliação das lâminas ao microscópio óptico OBSERVAÇÃO E FOTOGRAFIA A observação e fotografia das imagens obtidas por microscopia óptica foi feita no microscópio marca Olympus Zeiss Axio A1, com ampliações de x5, x10, x20, x40 e x100. A observação e fotografia das imagens obtidas por microscopia electrónica óptica foi feita no microscópio electrónico de transmissão JEOL 100CXII com ampliações entre as x2000 e as x A leitura imuno-histoquímica dos marcadores alfa-actina, desmina, vimentina e P63, foi feita a partir da observação em microscopia óptica, de forma qualitativa e quantitativa, através de screening, numa escala de 0 a 3, tendo por base os seguintes critérios: Zero: ausência de qualquer marcação. Um: marcação positiva até 1/3 do corte histológico. Dois: marcação positiva em 2/3 do corte histológico. Três: marcação positiva na totalidade do corte histológico. 136

139 Material e Métodos 4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados utilizados para análise estatística foram obtidos a partir do estudo de indivíduos atendidos no Serviço de Estomatologia e Medicina Dentária do Hospital Senhora da Oliveira Guimarães. A colheita de dados foi efectuada pelo investigador, não tendo sido efectuado qualquer estudo prévio de amostragem pelo que a análise estatística se limita à avaliação dos casos em estudo. A análise estatística descritiva dos dados foi feita utilizando a versão 15.0 do SPSS. Dada a natureza das variáveis envolvidas na sua maior parte nominais e categóricas, optou-se pelo uso de ferramentas estatísticas baseadas neste tipo de dados. (Braga, 1995) Para tornar mais perceptível quais as variáveis em estudo, apresenta-se nas tabelas I, II e III, um resumo que contém a designação adoptada no tratamento estatístico. M/F Idade P63 Desmina Actina Vimentina F F F M M F F M M M

140 Material e Métodos M/F Idade P63 Desmina Actina Vimentina M F M M F F F F F F M F F M M M F F M F Tabela 1 - Caracterização imuno-histoquímica do Grupo I M/F Idade P63 Desmina Actina Vimentina M M F F F M F F

141 Material e Métodos M/F Idade P63 Desmina Actina Vimentina M M M M F F M M M F F M M M F F M F F M M F M M M F F Tabela 2 - Caracterização imuno-histoquímica do Grupo II 139

142 Material e Métodos M/F Idade P63 Desmina Actina Vimentina F M F F F F M F M F F M F M M F F F M M F M M F F Tabela 3 - Caracterização imuno-histoquímica do Grupo III 140

143 RESULTADOS

144

145 Resultados 5. RESULTADOS 5.1. CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA Dos 90 indivíduos estudados, 44 são do género feminino e 46 são do género masculino, apresentando idades compreendidas entre os 16 e os 88 anos, com uma média de idades de 41,8 anos (Gráficos 1, 2 e 3) Género F M 46,67% 53,33% Gráfico 1 - Distribuíção por géneros da amostra estudada (N=90) 143

146 Frequência Resultados A amostra compreende três grupos de indivíduos, separados em grupos I (clinicamente saudáveis), II (Periodontite) e III (Patologias orais). Destes, 30 indivíduos não apresentavam qualquer patologia, 35 apresentavam parodontites suaves a moderadas e 25 tinham como diagnóstico outras patologias da cavidade oral. (Gráfico 5 e Tabela 4) A média de idades para os grupos I, II e III é respectivamente de 37,6 anos, 39,1 anos e 51 anos. (Gráfico 4) Mean =41,77 Std. Dev. =15,957 N = Idade Gráfico 2 - Descrição da frequência dependendo da idade do paciente 144

147 Grupo Resultados Idade Gráfico 3 - Distribuição por idades nos diferentes grupos Grupo Designação Frequencia Percentagem I Clínicamente saudáveis 30 33,3 II Periodontite 35 38,9 II Patologias Orais 25 27,8 Total Tabela 4 - Caracterização dos indivíduos dos Grupos I, II e III Grupo Clínicamente saudáveis Periodontite Patologias Orais 27,8% 33,3% 38,9% Gráfico 4 - Distribuição dos grupos de estudo 145

148 Frequência Clínicamente saudáveis Periodontite Patologias Orais Resultados Distribuição dos Grupos em função da Idade Grupos Gráfico 5 - Distribuição etária DIstribuição dos Grupos em função do Género F M Bars show percents 10% 20% 24% Percentagem 30% 35% 33% 31% 31% 40% 45% 50% Clínicamente saudáveis Periodontite Patologias Orais Clínicamente saudáveis Periodontite Patologias Orais Gráfico 6 - Distribuição dos grupos em função do género 146

149 Resultados Ausência Marcação Marcação positiva até 1/3 corte 33,3% 16,7% 15,6% 8,9% Marcação positiva até 2/3 corte Marcação total corte histológico 13,3% 6,7% 5,6% Clínicamente saudáveis Periodontite Patologias Orais Clínicamente saudáveis Periodontite Patologias Orais P63 Gráfico 7 - Caracterização do marcador P63 nos Grupos I, II e III Ausência Marcação Marcação positiva até 1/3 22,22% 16,67% 16,67% 11,11% 4,44% Marcação positiva até 2/ co Marcação total corte 12,22% 13,33% 3,33% Clínicamente saudáveis Patologias Orais Clínicamente saudáveis Patologias Orais Desmina Gráfico 8 - Caracterização do marcador Desmina nos Grupos I, II e III 147

150 Resultados Ausência Marcação Marcação positiva até 1/3 cort 27,8% 3,3% 2,2% 4,4% 1,1% Marcação positiva até 2/3 cort Marcação total corte histológico 23,3% 23,3% 8,9% 2,2% 3,3% Clínicamente saudáveis Patologias Orais Clínicamente saudáveis Patologias Orais Actina Gráfico 9 - Caracterização do marcador Actina nos Grupos I, II e III Ausência Marcação Marcação positiva até 1/3 22,2% 11,1% 13,3% 2,2% 5,6% Marcação positiva até 2/3 Marcação total corte 14,4% 14,4% 8,9% 7,8% Clínicamente saudáveis Patologias Orais Clínicamente saudáveis Patologias Orais Vimentina Gráfico 10 - Caracterização do marcador Vimentina nos Grupos I, II e III 148

151 Resultados P63 Desmina Actina Vimentina Clínicamente Saudáveis Periodontite Patologias Orais Gráfico 11- Imunomarcação em função dos três grupos estudados 5.2. AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DO GRUPO I Os resultados obtidos a partir do grupo I, onde os indivíduos não apresentam lesão clínica, evidenciam um padrão de células fusiformes, com núcleos alongados e citoplasma finamente reticulado, de contornos citoplasmáticos rendilhados. Estas células são abundantes e fortemente envolvidas por um estroma conjuntivo, em larga medida ocupado por fibras de colagénio essencialmente de tipo I, algumas fibras elásticas num estroma denso e fibrilar. A relação entre as células fusiformes e o seu estroma é intima, traduzindo um padrão regular de normalidade. Obervam-se ainda algumas células indiferenciadas com uma elevada relação núcleo-citoplasmática. As 149

152 Resultados células epiteliais são em número considerável e bem diferenciadas (figuras 1, 2 e 12). Em alguns cortes, torna-se evidente a estreita relação epitélio-conjuntiva, onde as cristas epiteliais e as papilas conjuntivas formam interdigitações regulares e abundantes. (Figuras 9, 10, 11, 13 e 14) Os vasos são em número regular, de contornos sinuosos e fortemente envolvidos por células de tipo mioepitelial e tecido conjuntivo. (figura 4) O tecido conujuntivo que rodeia os fibroblastos gengivais de forma abrangente e em particular os miofibroblastos é abundante, denso e rico em colagénio. Quando colocado em evidência, demonstra um padrão sinuoso e alongado, com agrupamentos em feixes. (Figura 3 e 5) A coloração de Van Gieson permite confirmar o padrão de tecido conjuntivo rico em colagénio, de contornos irregulares e sinusoidais. (Figuras 6, 7 e 8) Figura 1 - Fibroblastos gengivais. HE x20 (setas) 150

153 Resultados Figura 2 - Fibroblastos gengivais. HE x40 (seta) Figura 3 - Fibroblastos gengivais. Tricrómio de Masson 20x 151

154 Resultados Figura 4 - Transição epitélio-conjuntivo. HE x 20. Vasos (setas) Fibroblastos e colagénio (rectângulos) Figura 5 - Tecido conjuntivo gengival. Tricrómio de Masson x 20. Fibroblasto (seta) 152

155 Resultados Figura 6 - Tecido conjuntivo gengival. Van Gieson x 40. Figura 7 - Tecido conjuntivo gengival. Região vestibular. Van Gieson x20 153

156 Resultados Figura 8 - Tecido conjuntivo gengival. Van Gieson x20 Figura 9 - Transição epitélio-conjuntiva. HE x20 154

157 Resultados Figura 10 - Transição epitélio-conjuntiva. Região vestibular. Tricrómio de Masson x20. Figura 11 - Gengiva aderida. Região vestibular. HE x20 155

158 Resultados Figura 12- Gengiva aderida. Região vestibular. HE x40 Figura 13 - Interdigitações epitélio-conjuntivas. Gengiva aderida da região vestibular do dente 46. HE x40 156

159 Resultados Figura 14 - Interdigitações epitélio-conjuntivas. Gengiva aderida da região vestibular do dente 46. Tricrómio de Masson x AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DO GRUPO II Pelo estudo detalhado dos cortes submetidos ao estudo imunohistoquímico torna-se evidente a marcação dos miofibroblastos nos indivíduos do grupo II com periodontites leves a moderadas. A marcação pela alfa-actina é positiva em praticamente todos os casos embora com diferentes intensidades de marcação. Em baixa ampliação pode ver-se um fundo celularmente rico, com elevada marcação para a alfa-actina, onde se evidenciam os miofibroblastos como células positivamente evidentes na patologia periodontal, numa expressão fisiopatológica de resposta à agressão. 157

160 Resultados Na figura 15 pode observar-se uma célula alongada, de núcleo poligonal e fusiforme, com projecções citoplasmáticas e núcleos vesiculosos, num estroma rico e denso, compatível com o fibronexus que envolve os miofibroblastos. Na seta, pode observar-se uma marcação positiva para a alfaactina característica de um miofibroblasto. De entre os marcadores citoplasmáticos (alfa-actina, desmina e vimentina) a marcação pela alfa-actina é a que mais caracteriza o miofibroblasto. Mesmo assim, no tecido conjuntivo é bastante exuberante a marcação positiva para a desmina e vimentina. Esta marcação, é particularmente evidente nas formas moderadas de periodontites. (Figuras 16, 17, 22, 24 e 27) Num estudo realizado por Bello I. et al (2009) verificou-se que a expressão imuno-histoquímica de alfa-actina nas ilhotas de células epiteliais de carcinomas ameloblásticos, é um factor preditivo para esta variante metastizante. O mesmo tipo de imunomarcação não ocorreu em casos de ameloblastoma sólido ou multicístico. A expressão de vimentina está particularmente associada às formas de lesão crónicas, ao processo inflamatório envolvente e também à maior proliferação dos miofibroblastos. (Figuras 20, 21 e 26) Nos indivíduos com periodontites estudados observa-se a marcação positiva para a proteína P63, caractrística da linhagem mioepitelial. A marcação positiva aparece de forma esporádica em células isoladas ou de forma extensa. Nos cortes onde é possível observar o epitélio, verifica-se uma extensa marcação em bordadura nas células da camada basal. (Figuras 19, 23 e 25) A marcação do citoesqueleto celular para os filamentos de desmina e vimentina é evidente nas imagens 20, 21 e 26. Esta marcação, apresenta uma expressão leve a moderada e é manifestamente inferior à observada na amostra corrspondente aos indivíduos do grupo III. 158

161 Resultados Figura 15 - Miofibroblastos da região vestibular. Actina x40(seta) Figura 16 - Miofibroblastos da região vestibular. Actina x20 159

162 Resultados Figura 17- Miofibroblastos da cavidade oral. Actina x20 Figura 18 - Miofibroblastos da cavidade oral. P63 x20 160

163 Resultados Figura 19 - Miofibroblastos da cavidade oral. P63 x40 Figura 20 - Miofibroblastos da cavidade oral. Vimentina x20 161

164 Resultados Figura 21 - Miofibroblastos fortemente positivos para vimentina x20 Figura 22 - Biópsia de gengiva aderida. Actina x20 162

165 Resultados Figura 23 - Biópsia de gengiva aderida. P63 x20 Figura 24 - Miofibroblastos da cavidade oral. Actina x20 163

166 Resultados Figura 25 - Miofibroblastos de gengiva aderida. P63 x40 Figura 26 - Miofibroblastos de gengiva aderida. Vimentina x20 164

167 Resultados Figura 27 - Miofibroblastos da cavidade oral. Actina x AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DO GRUPO III Pelo estudo detalhado dos cortes submetidos ao estudo imunohistoquímico torna-se evidente a marcação dos miofibroblastos nos indivíduos do grupo III com lesões desmoplásicas. A marcação pela alfa-actina é positiva em praticamente todos os casos de forma exuberante. (Figura 29) Em baixa ampliação pode ver-se um fundo celularmente rico, com elevada marcação para a alfa-actina e desmina, onde se evidenciam os miofibroblastos como células positivamente evidentes na principais patologias da cavidade oral. Os miofibromas da cavidade oral, como neoplasia benigna com diferenciação miofibroblástica são marcadamente imunoreactivos para a vimentina e alfa-actina (Azevedo R. et al, 2008). Foi igualmente reportado por 165

168 Resultados Demarosi F. e tal (2009) que sarcomas miofibroblásticos de baixo grau (LGMS) da cavidade oral são imuno-histoquimicamente positivos para pelo menos um marcador miogénico, tal como a desmina ou a alfa-actina, no entanto negativos para S-100 e desmina. De entre os marcadores citoplasmáticos (alfa-actina, desmina e vimentina) a marcação pela alfa-actina é a que mais caracteriza o miofibroblasto. Mesmo assim, no tecido conjuntivo é bastante exuberante a marcação positiva para a desmina e vimentina. Esta marcação, é particularmente evidente nas formas severas de patologia. (Figura 28 e 30) Figura 28 - Leucoplasia da cavidade oral. Vimentina x20 166

169 Resultados Figura 29 - Carcinoma pavimentoso da cavidade oral. Actina x20 Figura 30 - Carcinoma pavimentoso da cavidade oral. Desmina x20 167

170 Resultados Em microscopia electrónica, o miofibroblasto revela-se como uma célula tipicamente alongada, pese embora o facto de não raras vezes assumir aspectos incaracterísticos e bizarros. Os aspectos observados em microscopia electrónica, ilustram configurações específicas do estado metabólico celular, particularmente no que diz respeito à sua dinâmica celular. Em ultrastrutura, a vesiculação é abundante, os perfis mitocondriais apresentam aspectos por vezes de sofrimento celular, traduzido pelo apagamento das cristas mitocondriais e distorção da membrana interna. (Figuras 33 e 35) A ultra-estrutura do fibroblasto activo, apresenta uma distribuição de organélos citoplasmáticos abundantes. Vários complexos de Golgi, abundante retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias e vesículas de secreção. (Figura 36) Frequentemente observamos a célula envolvida num estroma fibroso designado por fibronexus, deixando transparecer quadros preciosos da sua biologia. As principais fibras encontradas são sem dúvida as fibras de colagénio, embora nos miofibroblastos se evidenciam também as fibras actínicas de expressão citoplasmática e orientadas segundo o maior eixo da célula. (Figuras 34, 35) As fibras de colagénio, extracelulares, agrupam-se em diversas orientações numa estreita relação com os fibroblastos, em particular no caso específico dos miofibroblastos (Figuras 31, 37 e 38). Este compromentimento celular é particularmente evidente nas patologias de tipo proliferativo como as leucoplasis ou as hiperplasias. O citoesqueleto, permite a observação de microtúbulos e microfilamentos. Os sistemas filamentosos nos fibroblastos possuem um importante papel na estruturação da sua forma bem como na sua fisiopatologia. 168

171 Resultados O sistema microtubular, controla a organização morfológica do fibroblasto e não apenas o seu citoesqueleto. (Figura 32) De forma repetida observam-se mitocôndrias de perfis arredondados ou ovalizados, mas mantendo uma boa preservação das cristas. A nível nuclear, por vezes, observam-se condensações periféricas de cromatina, em núcleos activos e alongados segundo o maior eixo da célula. (Figuras 34 e 36) O miofibroblasto constitui um elemento central no âmbito da heterogeneidade celular. É sem dúvida um fibroblasto muito especial, com marcadas características contrácteis das células musculares lisas e com uma fisiologia definida, evidenciada pelas características ultraestruturais anteriormente apresentadas. Figura 31 - Colagénio (x ) 169

172 Resultados Figura 32 - Fibroblasto gengival (25.000x) Figura 33 - Miofibroblasto (12.000x) 170

173 Resultados Figura 34 - Miofibroblasto (10.000x) Figura 35 - Fibroblasto gengival (x ) 171

174 Resultados Figura 36 - Fibroblasto gengival (x ) Figura 37 - Colagénio (50.000x) 172

175 Resultados Figura 38 - Colagénio (20.000x) 173

176

177 DISCUSSÃO

178

179 Discussão 6. DISCUSSÃO O fenótipo do músculo liso que apresenta as células mioepiteliais, é demonstrado pela marcação positiva para a actina da célula muscular lisa. Estes marcadores, em especial a alfa-actina são determinantes para a identificação dos miofibroblastos num estroma complexo e por vezes desmoplásico. (Desmoulière et al., 2004) No contexto da doença periodontal é frequente a expressão fenotípica da alfa-actina por parte dos miofibroblastos, particularmente ao nível da gengiva aderida. A marcação do citoesqueleto é igualmente positiva para os filamentos de vimentina e desmina. A sua expressão é evidente, no entanto, inferior à observada para os indivíduos que apresentam patologias de tipo desmoplásico ou mesmo neoplásico (grupo III). Os fibroblastos observados apresentam uma matriz extracelular densa e complexa (o fibronexus) com uma membrana que envolve os filamentos intracelulares em continuidade com as proteínas extracelulares. Os miofibroblastos observados apresentam um retículo endoplasmático rugoso bem desenvolvido, expressando dessa forma uma elevada taxa de síntese de proteínas extracelulares, como o colagénio dos tipos I e III. 177

180 Discussão No estudo efectuado foi possível a identificação por via imunohistoquímica de vários marcadores citoplasmáticos de referência e do marcador nuclear P63. Estes marcadores celulares revelaram-se elementos decisívos no diagnóstico e prognóstico da doença periodontal. A imunomarcação ao nível dos miofibroblasto da cavidade oral, particularmente no estadiamento da sua severidade, tem sido abordada em trabalhos anteriores de forma diversa, frequentemente associada a outras patologias não periodontais. (Smith et al., 2006) São inúmeros os trabalhos no âmbito da carcinogénese e das patologias desmoplásicas como a fibrose pulmonar, o carcinoma da mama, ou a cirrose hepática, entre outras. Contudo, quando centramos a nossa atenção nos marcadores estudados em periodontopatias a produção ciêntífica cai de forma abrupta, particularmente no que diz respeito à sua aplicabilidade clínica e diagnóstica. Neste trabalho, sugere-se uma escala de severidade aplicada à doença de forma objectiva, como elemento clínico central. Entre os diversos marcadores estudados, revelam-se sensibilidades diferentes, embora complementares. (Lewis et al., 2004; Tsukamoto et al., 1992) Ao contrário das restantes marcações efectuadas, a marcação pelo P63 é uma marcação nuclear. A proteína P63 é um factor de transcrição (membro da família P53) que marca positivamente células da camada basal de vários tecidos e também células mioepiteliais. A imunomarcação pelo P63 é uma marcação nuclear que deve ser valorizada quando associada a outros marcadores citoplasmáticos, particularmente a alfa-actina, desmina e vimentina. A avaliação da expressão da vimentina e dos miofibroblastos pode ser utilizada como uma ferramenta auxiliar de avaliação e prognóstico da patologia periodontal. Se a estes factores, acrescentarmos a expressão de outros imunomarcadores como a alfa-actina e a desmina obtemos uma valioso quadro clínico de expressão de doença, na cavidade oral em termos gerais e nas periodontites de forma mais particular. 178

181 Discussão Estes marcadores podem agora agrupar-se em forma de escala, correlacionando-se com diversas patologias. Desta forma, poderemos observar que a intensidade da marcação é proporcional à severidade da lesão. As marcações identificadas nos indivíduos do grupo I são práticamente inexistentes, vão aumentando de significado nos indivíduos do grupo II e são extensas e exuberantes nos indivíduos do grupo III. Ao nível clínico, a baixa positividade pelos marcadores estudados, nos doentes com periodontites é um factor de bom prognóstico. Permite prever uma boa resposta à terapêutica instituída e um menor tempo de recuperação. A imunomarcação discreta ou suave (níveis 0, 1 e 2) está directamente relacionada com lesões menos complexas e mais suaves na sua expressão fenotípica. Pelo contrário, a marcação mais intensa (níveis 2 e 3) está associada a lesões moderadas no caso das periodontites ou agressivas no caso das restantes patologias da cavidade oral, particularmente ao nível das lesões neoplásicas e pré-neoplásicas. 179

182

183 CONCLUSÃO

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185 Conclusão 7. CONCLUSÕES Do estudo efectuado podem retirar-se as seguintes conclusões: As principais patologias da cavidade oral podem ser acompanhadas de forma directa e proporcional pela expressão fenotípica dos miofibroblastos. A intensidade da imunomarcação pela alfa-actina, desmina, vimentina e P63 é directamente proporcional à severidade das principais lesões da cavidade oral. A intensidade da imunomarcação pela alfa-actina, desmina, vimentina e P63 é um importante factor de diagnóstico e prognóstico das principais lesões da cavidade oral. A imunomarcação pela alfa-actina, desmina, vimentina e P63 é tendencialmente negativa na ausencia de fenómenos proliferativos. A imunomarcação pela alfa-actina parece ser a mais relevante no acompanhamento da severidade da doença periodontal. 183

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187 BIBLIOGRAFIA

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