UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA. Letícia Batista Pinto

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA Atividade antiviral do Maraviroque e participação do receptor de quimiocina CCR5 na infecção de células mononucleares humanas pelo vírus da dengue 2. Letícia Batista Pinto Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas. RIBEIRÃO PRETO SP 2013

2 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA Atividade antiviral do Maraviroque e participação do receptor de quimiocina CCR5 na infecção de células mononucleares humanas pelo vírus da dengue 2. Letícia Batista Pinto Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas. Orientador: Benedito Antônio Lopes da Fonseca RIBEIRÃO PRETO SP 2013

3 Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. FICHA CATALOGRÁFICA Pinto, Letícia Batista Atividade antiviral do Maraviroque e participação do receptor de quimiocina CCR5 na infecção de células mononucleares humanas pelo vírus da dengue 2. Ribeirão Preto, f. : il. ; 30 cm Monografia (Curso de Ciências Biológicas), Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Orientador: Fonseca, Benedito Antônio Lopes da 1- Dengue 2- Maraviroque 3- CCR5

4 FOLHA DE AVALIAÇÃO Letícia Batista Pinto Atividade antiviral do Maraviroque e participação do receptor de quimiocina CCR5 na infecção de células mononucleares humanas pelo vírus da dengue 2 Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas. Data da defesa: Resultado: BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura:

5 Dedicatória Aos meus pais, Débora e Gilson, pelo bom exemplo, incentivo e amor. Obrigada por estarem comigo nessa jornada, sempre me apoiando. Ao meu irmão Gabriel, que sempre tem uma palavra carinhosa a dizer. Aos meus familiares e amigos, que sempre torceram por mim, e estiveram ao meu lado, vocês com certeza sempre estarão em meu coração

6 Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus por sempre estar ao meu lado me dando serenidade e me guiando. Ao prof. Dr. Benedito Antonio Lopes da Fonseca, meu orientador, pela oportunidade, pelo incentivo e acima de tudo pela confiança que creditou em mim durante esse trabalho. Ao Dr. Flávio Lauretti, meu Co-orientador, por estar sempre comigo, procurando me ensinar tudo que sabe, com boa vontade de disposição. À todos os companheiros de laboratório, Luiza, Danillo, Mariana, João, Taline, Aline, Fernanda, Ana Luisa, Flávia e Emiliana pela amizade, pelas rizadas e momentos de descontração, e por sempre me ajudarem, contribuindo para o meu aprendizado Aos membros da banca por dedicarem parte de seu tempo com a correção do meu trabalho e pela a preocupação na minha aprendizagem. À Dona Leila, por sempre manter o laboratório limpo e organizado. Ao Prof. Dr. Guilherme de Araújo Lucas, por ter compartilhado sua experiência com tanto afeto e carinho. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de Iniciação Científica. Ao Departamento de Medicina de Ribeirão Preto pela concessão do espaço para a realização dos experimentos. À minha mãe, Débora e ao meu pai, Gilson por terem me apoiado desde o começo, financeira e psicologicamente, por sempre me ensinarem que o caminho pode ser difícil, mas que vale a pena percorrê-lo; ao meu irmão, Gabriel, por sempre estar ao meu lado me apoiando.

7 A todos os meus familiares que sempre torceram por mim. Às minhas amigas, Flávia, Vitória e Natália que estão ao meu lado todos os dias, e que me ajudaram tanto neste percurso, obrigada pela compreensão amizade e carinho. Às minhas queridas amigas Ana Beatriz, Daniela, Ingrid, Julia e Mayara, amigas de longa data das quais jamais esquecerei. Ao meu amigo Andrew, por ser um bom ouvinte. E especialmente ao Luis Eduardo, por ter me ajudado nas análises estatísticas. A todos que de alguma maneira contribuíram para a realização desse trabalho.

8 Vamos, então levantar e agir com entusiasmo para qualquer resultado; Ainda realizando, ainda perseguindo, aprender a labutar e a esperar. Henry Wadsworth Longfellow

9 RESUMO A dengue é uma arbovirose humana, febril e aguda, causada pela infecção por um dos quatro sorotipos de dengue vírus (DENV 1 a 4). É transmitida ao homem por mosquitos do gênero Aedes, e é considerada a mais importante arbovirose humana, tanto em termos de morbidade como mortalidade. Os vírus da dengue pertencem à família Flaviviridae, e são dotados de um genoma de RNA de fita simples, revestido por um capsídeo proteico envolto num envelope lipídico. Em trabalhos recentes tem sido observado que os vírus DENV diminuem a carga viral do HIV em pacientes co-infectados, o que está associado a uma redução da replicação do vírus HIV, levando a uma melhor sobrevivência de pacientes infectados por dengue. Como há diminuição da viremia do HIV em pacientes co-infectados por dengue pode-se especular que o CCR5 (receptor de quimiocina cisteína-cisteína tipo 5), que é importante para a infecção do vírus HIV tenha participação na infecção por dengue, já que, interferências cruzadas sugerem uma via comum de infecção. Apesar de vários receptores para os vírus DENV já terem sido elucidados, ainda não foi verificado se o CCR5 é um deles. Desta forma objetivamos determinar a possível atividade antiviral do inibidor de CCR5 maraviroque (MRv) contra o vírus dengue 2 e, com isso, a participação do receptor de quimiocina CCR5 na infecção de células de linhagem monocíticas, derivadas de linfoma histiocítico humano (U937). Para isto a citotoxicidade do MrV foi determinada pelo ensaio da atividade da desidrogenase mitocondrial com 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazólio (MTT, Acros Arganics, USA), chegando-se a CC 50 (concentração que reduz a viabilidade das células em 50%) de 0,7 mg/ml. Além disto, construímos uma curva de crescimento das células U937 infectadas pelos vírus DENV-2, em que o pico de liberação de vírus no sobrenadante é no segundo dia pós-infecção. Por último, realizamos um ensaio de tempo de adição da droga, testando as concentrações de 0,2, 0,4, 0,6 e 0,8 mg/ml da droga em diferentes tempos. Nossos resultados indicam que houve uma redução estatisticamente significativa da quantidade de cópias de RNA viral nas diferentes concentrações de MvR (0,2, 0,4, 0,6 e 0,8 mg/ml), porém estes resultados devem ser confirmados por repetição desta metodologia e realização de um ensaio de neutralização do receptor CCR5 com anticorpos anti-ccr5. Palavras chave: Dengue; Maraviroque; CCR5

10 LISTA DE FIGURAS Figura 01: Casos anuais de dengue no Brasil. Modificado de Figueiredo, Figura 02: Medições longitudinais dos níveis de DNA de HIV-1 em um paciente com dengue na fase aguda e durante 4 semanas. Modificado de Watt, Figura 03: Produto de amplificação por RT-PCR dos estoques de DENV Figura 04: Plaque realizado na titulação da curva de crescimento Figura 05: Resultado da titulação viral por plaque da curva de crescimento de células U937 infectadas pelo vírus DENV 2 (com a retirada do inóculo) em PFU Figura 06: Resultado da titulação viral por qrt-pcr da curva de crescimento de células U937 infectadas pelo vírus DENV 2 (com a retirada do inóculo) em número de cópias por ml Figura 07: Regressão linear entre os valores de Ct (Ciclo threshold) e as concentrações de RNA transcrito em número de cópias/µl Figura 08: Viabilidade celular em função da concentração da droga maraviroque em ensaio de citotoxicidade por MTT com três dias de incubação Figura 09: Viabilidade celular em função da concentração da droga maraviroque em ensaio de citotoxicidade por MTT com sete dias de incubação Figura 10: Número de cópias de RNA viral de DENV 2 em relação ao tempo de adição da droga MrV. As diferentes linhas representam as concentrações da droga utilizada no experimento em mg/ml... 40

11 LISTA DE TABELAS Tabela 01: Primers para Multiplex RT-PCR, segundo Harris et al., Tabela 02: Características dos oligonucleotídeos utilizados na avaliação da carga viral Tabela 03: Resultado da titulação viral por plaque da curva de crescimento de células U937 infectadas (com permanência do inóculo) pelo vírus DENV 2 em PFU... 35

12 LISTA DE ABREVIATURAS BHK Baby Hamster Kidney cells C Proteína estrutural do capsídeo C6/36 Células de mosquito Aedes albopictus CCR5 Receptor de quimiocina 5 CC 50 Concentração que reduz a viabilidade das células em 50% CD14 protein cluster of differentiation 14 CMC carboximetilcelulose CT cycle threshold CXCR4 Receptor de alfa-quimiocinas 4 DC-SIGN dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin DMEM Meio essencial de Eagle modificado por Dulbecco DENV 1 Vírus da dengue tipo 1 DENV 2 Vírus da dengue tipo 2 DENV 3 Vírus da dengue tipo 3 DENV 4 Vírus da dengue tipo 4 DO Densidade optica DSS Síndrome do choque da dengue E Proteína estrutural do envelope FHD Febre hemorrágica da dengue GBV-C Vírus da hepatite G HIV- Vírus da Imunodeficiência Humana HSP Heat shock proteins IgG Imunoglobulina G M Proteína estrutural da membrana MOI Multiplicidade de infecção MrV Maraviroque MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazólio NGC Cepa de dengue 2 New Guinea C NS1 Proteína não estrutural 1 NS2 Proteína não estrutural 2 NS3 Proteína não estrutural 3

13 NS4 Proteína não estrutural 4 NS5 Proteína não estrutural 5 OPAS Organização Pan-Americana da Saúde PB Pares de bases PBS Tampão fosfato salino PCR Reação em cadeia da polimerase PBMC Células mononucleares do sangue periférico PEG polietilenoglicol ph Potencial hidrogeniônico prm Proteína estrutural pré membrana qrt-pcr Reação em cadeia da polimerase em tempo real precedida por transcriptase reversa RNA Ácido ribonucleico RPMI Meio Roswell Park Memorial Institute SFB Soro fetal bovino TNE Tris, NaCl, EDTA TR1751 Cepa viral de dengue 2 Trinidad R 1751 U937 Linhagem celular monocítica humana estabelecida a partir de um linfoma histiocítico difuso Vero Células de rim de macaco verde africano

14 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO Histórico da dengue A doença Os vírus da dengue A relação DENV HIV OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODOS Células Estoque viral Extração de RNA RT- PCR Titulação viral por ensaio de plaque Citotoxicidade Curva de crescimento do DENV 2 em Células U Avaliação da carca viral da curva de crescimento Obtenção da curva padrão RT- PCR em tempo real Imunoflorescência Atividade antiviral do maraviroque Ensaio de tempo de adição da droga Análise estatística RESULTADOS Estoque viral Titulação viral Titulação do estoque viral Titulação da curva de crescimento... 35

15 4.3.Citotoxicidade Ensaio do tempo de adição da droga DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 47

16 Introdução

17 Introdução 1. Introdução 1.1. Histórico da dengue A dengue é uma arbovirose humana, febril e aguda, causada pela infecção por um dos quatro sorotipos intimamente relacionados de dengue vírus (DENV 1-4), pertencentes à família Flaviviridae. Todos os vírus dessa família são sorologicamente relacionados e na maior parte dos casos, são transmitidos por vetores artrópodes hematófagos (mosquitos ou carrapatos) para hospedeiros vertebrados (Jain, 2005). O principal vetor da dengue é o mosquito da espécie Aedes aegypti, mas a doença pode ainda ser transmitida pela espécie A. albopictus. A distribuição destes vetores é de importância global, já que grande parte da população mundial vive em áreas de risco; estas áreas inicialmente eram restritas apenas a regiões topicais, porém com o crescente aumento da dispersão geográfica do gênero Aedes sp. e da globalização, os vetores dos vírus dengue tem sido encontrados em áreas nas quais não eram encontrado anteriormente, como regiões subtropicais (Nishiura & Halstead, 2007; Noisakran et al., 2010). Especula-se que as pandemias de dengue se iniciaram nas regiões da Ásia e do Pacífico durante e depois da segunda Guerra Mundial, principalmente devido a mudanças de padrões ecológicos que favoreceram a expansão e o aumento da densidade do vetor da doença, associadas a alterações em padrões sociais e demográficos, aumentando a suscetibilidade dos indivíduos principalmente pelo grande deslocamento de pessoas (Guzman & Kouri, 2003). Provavelmente a primeira referência a uma epidemia no Brasil datou de 1846 e foi registrada no Rio de Janeiro. A partir deste primeiro registro outros estados como Paraná e o Rio Grande do Sul apontaram epidemias em Uma nova grande epidemia foi registrada no Rio De Janeiro entre os anos de 1922 e 1923 (Figueiredo 2000). Por iniciativa de Oswaldo Cruz, iniciou-se no ano de 1904 uma campanha de erradicação do vetor Aedes aegypti, e a partir do ano de 1940, com o apoio técnico da Fundação Rockefeller, esta erradicação foi efetiva, sendo confirmada no ano de Associado à erradicação do vetor da dengue no Brasil, a Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS), também iniciou um programa de erradicação do Aedes aegypti, a fim de evitar epidemias urbanas de febre amarela; este programa eliminou o vetor de 19 países (mais de 73% da área originalmente infestada). Estas campanhas foram provavelmente a razão para a 16

18 Introdução ausência de surtos de dengue no Brasil entre 1923 e Porém a erradicação do vetor é de difícil manutenção, e na década de 1970, houve uma nova entrada mosquito nas áreas erradicadas e esta reinfestação continuou durante os anos 1980 e 1990 (Figueiredo 2000; Guzman & Kouri, 2003). A partir da década de 1990, os países das Américas Central e do Sul começaram a se destacar no cenário de casos de dengue, relatando sucessivas epidemias, e passaram a registrar muito mais da metade dos casos desta doença no mundo. Nesta mesma década, no ano de 1998, o Brasil registrou mais de 700 mil casos da doença (Barreto & Teixeira, 2008). A reintrodução do Aedes aegypti no Brasil se deu pelo estado de Roraima e pela região amazônica, no ano de 1981 e estima-se que pessoas foram infectadas por DENV 1 e DENV 4, os quais foram isolados a partir de pacientes e do próprio mosquito. O primeiro surto no sudeste do Brasil foi causado pelo DENV 1 e ocorreu em 1986 assolando a região metropolitana do Rio de Janeiro. Novas epidemias surgiram com a entrada dos sorotipos DENV 2 em , no estado do Rio de Janeiro e do DENV 3 em também iniciada no Rio de Janeiro (Figura 1) (Figueiredo 2000; Câmara et al., 2007). Desde a entrada de DENV 4 em 1981, não tinham sido registrados casos de infecção por esta cepa viral, até 2008, quando foi confirmada a infecção de três pacientes na região amazônica. Em 2010, novos casos foram reportados na cidade de Roraima, e em 2011, associado à epidemia de DENV 1, o estado do Rio de Janeiro, especificamente a cidade de Niterói, registrou 7 casos de pacientes infectados com DENV 4. Desde então, o número de casos de dengue registrados na cidade do Rio de Janeiro e também no estado aumentou, atingindo casos confirmados em laboratório até agosto de 2012 (Campos et al, 2012). Atualmente a dengue é foco da maior campanha de saúde pública do Brasil, que visa controlar o vetor Aedes aegypti, o qual está adaptado a se reproduzir nos ambientes doméstico e peridoméstico, em locais contendo água limpa parada. A dengue é registrada em todos os estados do Brasil, e nosso pais é responsável por cerca de 60% dos registros de caso nas Américas (Câmara et al, 2007). A dengue é uma doença de difícil prevenção visto que não há vacinas eficazes ou drogas terapêuticas disponíveis para prevenir ou tratar a infecção. Além disso, o gênero Aedes sp. tem revelado grande capacidade de adaptação a diferentes situações ambientais, inclusive seus ovos têm uma alta capacidade de resistir à dessecação. O fato de o vetor ser bem adaptado ao ambiente urbano densamente povoado, em que a população gera habitats ideais para a proliferação deste mosquito, torna a prevenção da dengue muito complicada. As 17

19 Introdução medidas de controle atuais que têm como objetivo a eliminação do mosquito em todas as suas fazes de vida, não têm sido muito eficazes, de modo que a disseminação do vírus e as epidemias não têm sido evitadas (Barreto & Teixeira, 2008). Casos de dengue Anos Figura 01: Casos anuais de dengue no Brasil. Modificado de Figueiredo, A doença Os quatro sorotipos dos vírus da dengue podem, cada um deles, apresentar quadros clínicos que variam de assintomático, febre não específica, febre da dengue, febre hemorrágica da dengue (FHD), e a síndrome do choque da dengue (DSS). As formas sintomáticas podem apresentar febre com duração de 5 a 8 dias, mialgia, dor nas articulações, erupções cutâneas, rash cutâneo com branqueamento sobre pressão (nas primeiras 24 a 48h de febre), cefaleia, dor retro ocular e leucopenia. Pode-se ainda observar náuseas ou vômito, trombocitopenia e hemorragia cutânea na forma mais grave da doença (Henchal & Putnak, 1990, Malavige et al., 2004). Depois da picada de um mosquito infectado, o vírus entra na corrente sanguínea e passa a se multiplicar em órgãos específicos, como o baço, o fígado e os tecidos linfáticos, principalmente em células mononucleares. Este período é conhecido como período de incubação, em que não há sintomas aparentes, durando de quatro a sete dias. Assim que o vírus volta a circular na corrente sanguínea, depois do período de incubação, ocorrem os primeiros sintomas (Jain, 2005). 18

20 Introdução O quadro febril leve resulta geralmente de uma infecção primária, podendo também ser decorrente de infecção secundária e é clinicamente indistinguível de outras infecções virais. Os sintomas geralmente se iniciam com febre alta súbita, dor de cabeça, particularmente na área retro-orbital, artralgia, mialgia, mal-estar abdominal, e por vezes, rash cutâneo. A prova do laço tem sido positiva em muitos indivíduos com febre da dengue, provavelmente devido à fragilidade capilar. Nos casos típicos, febre persiste por 4 a 6 dias e a viremia geralmente coincide com este período. A recuperação da febre da dengue ocorre usualmente sem complicações, mas pode ser prolongada, especialmente em adultos (Henchal & Putnak, 1990, Malavige et al., 2004). A FHD geralmente resulta de uma infecção secundária, porém pode ser causada por uma infecção primária, especialmente em crianças. Os principais fatores de risco para FHD incluem a estirpe do vírus (sendo algumas mais virulentas do que outras, apesar de todas poderem causar complicações), a idade, os antecedentes genéticos do indivíduo e principalmente infecções anteriores, que podem causar um fenômeno denominado amplificação dependente de anticorpos, no qual os anticorpos produzidos pelo paciente infectado contra o sorotipo da primeira infecção apresentam reação cruzada com os outros três sorotipos aumentando a infecção viral em uma possível infecção posterior (Malavige et al., 2004). A organização Mundial de Saúde define a FHD segundo quatro critérios: febre alta e súbita por 2-7 dias; manifestações hemorrágicas, com pelo menos o teste do laço positivo; a contagem de plaquetas, menor do que 100x10 9 /l de sangue; hemoconcentração (aumento do volume globular 20%) ou outra evidência de vazamento de plasma, por exemplo, ascite, derrame pleural, baixo nível de proteína de soro/albumina (Malavige et al., 2004). A síndrome do choque da dengue está associada a infecções secundárias e leva a uma alta mortalidade (cerca de 9,3% e 47% nos casos de choque profundo). Este quadro clínico é caracterizado por grave extravasamento de plasma associado a manchas na pele, cianose perioral e distúrbios circulatórios. Vômito persistente e dor abdominal aguda são sintomas que indicam choque, e hipotensão súbita pode indicar o início do choque profundo. O choque prolongado é muitas vezes acompanhado pela acidose metabólica, que pode levar a hemorragia maciça (Malavige et al., 2004). 19

21 Introdução 1.3. Os vírus dengue Os vírus da dengue pertencem à família Flaviviridae, com cerca de 70 vírus distintos, todos dotados de um RNA de fita simples que é revestido por um capsídeo proteico de forma icosaédrica. Este nucleocapsídeo está rodeado por uma membrana lipoprotéica derivada do hospedeiro, na qual duas proteínas transmembranas virais são inseridas, a glicoproteína do envelope E, na forma de hélices, e a proteína de membrana M (Smith et al., 2011; Ma et al, 2003 apud Zhang et al, 2003; Henchal & Putnak, 1990). A maioria dos marcadores moleculares para patogenicidade foram localizados no gene da proteína E (Leitmeyer et al., 1999). O genoma viral contém uma única fase aberta de leitura, que codifica uma poliproteína precursora e é flanqueado por duas regiões não traduzidas. A única poliproteína é traduzida e clivada em três proteínas estruturais (E, prm / M, e C) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) por proteases virais ou do hospedeiro (Noisakran et al., 2010). A proteína C é essencial para assegurar a montagem do vírus e a encapsidação específica do genoma viral (Ma et al., 2003 apud Ferlenghi et al, 2001). Na infecção viral, o vírus da dengue se liga aos receptores de superfície celular, e é internalizado por endocitose; uma vez dentro da vesícula endocítica ocorre uma diminuição no ph e a proteína E sofre uma mudança conformacional de dímero para trímero, facilitando a fusão da membrana do envelope viral como a membrana do endossoma, ocorrendo a liberação do nucleocapsídeo no citoplasma, e a replicação imediata do genoma viral (McBride & Bielefeldt-Ohmann, 2000). Assim que a poliproteína viral é clivada, ocorre a montagem do vírus no retículo endoplasmático das células infectadas, seguida pela liberação de virions infecciosos provenientes desta célula no espaço extracelular anexo (Jain, 2005, McBride & Bielefeldt-Ohmann, 2000). O primeiro passo na via de entrada do virion na célula é a ligação da glicoproteína E a um receptor celular, e nos últimos anos, várias moléculas receptoras têm sido identificadas, indicando que os vírus da dengue podem usar vários destes receptores na infecção celular (Smith et al., 2011). Os vírus desenvolveram uma variedade de estratégias para reconhecer e se ligar a células hospedeiras, podendo utilizar proteínas, lipídios, ou oligossacarídeos como ligantes na célula hospedeira (Jain, 2005). Os receptores celulares para os vírus da dengue ainda estão em estudo, porém o envolvimento da proteína do envelope (proteína E) do vírus no processo é indiscutível. Com 20

22 Introdução base nos dados disponíveis, parece evidente que a ligação e a internalização do vírus da dengue é um processo de múltiplas etapas, envolvendo o reconhecimento e a ligação ordenada e sequencial de várias moléculas da superfície da célula alvo por múltiplos epítopos da proteína de envelope (McBride & Bielefeldt-Ohmann, 2000). Um exemplo de receptor celular já elucidado é o sulfato de heparan, uma glicoproteína de carga negativa, que é expressa em diversos tipos celulares e é utilizado como fator de baixa afinidade de ligação por vários flavivírus. Porém vários outros receptores para DENV em mamíferos já foram identificados tais como proteínas de choque térmico (HSP 90 e 70), neolactotetraosylceramido, CD14 em células mielóides, DC-SIGN (em células dendríticas) o receptor de manose, e o domínio C da família 5 das lectinas (Smith et al., 2011). Todos os flavivírus têm grupos comuns de epítopos nas proteínas de envelope, o que resulta em extensa reação cruzada em testes serológicos, esta interferência cruzada geralmente sugere uma via comum de receptores celulares (Dasika & Letchworth, 2000) A relação DENV HIV As infecções virais alteram a homeostase da célula hospedeira podendo interferir na replicação de outros microrganismos em hospedeiros co-infectados. Em trabalhos recentes (como de Watt et al., 2002 e Mendes et al., 2006) tem sido observado que os vírus DENV diminuem a carga viral do HIV em pacientes co-infectados, isto está associado a uma redução da replicação do vírus do HIV (Figura 2). No estudo de caso relatado por Watt et al., 2003, o soro obtido de um paciente em observação (na fase aguda da infecção por DENV- 1) foi capaz de inibir a replicação do vírus do HIV em células linfocitárias, in vitro, porém nem o soro controle nem uma amostra de soro da fase convalescente, obtidas a partir do mesmo paciente, inibiram a replicação do HIV, indicando que a infecção por DENV induziu fatores solúveis que inibiram esta replicação (McLinden et al., 2008; Watt et al., 2003). Ensaios realizados com linhagens de célula T CD4 + que expressam a proteína DENV viral NS5, mostram que a replicação do HIV diminuiu aproximadamente 90% em comparação com células controles, isto se deve à diminuição do co-receptor do vírus HIV, o CXCR4. Este achado de que a proteína viral NS5 inibe a replicação do HIV in vitro, pode, possivelmente explicar a redução da infecciosidade de HIV em pacientes co-infectados por dengue (Xiang et al., 2009; McLinden et al., 2008). 21

23 Introdução Outro vírus da família Flaviviridae que possui interferência na viremia do HIV é o vírus da hepatite G (GBV-C), vários estudos encontraram uma associação entre a co-infecção GBV-C/HIV e uma sobrevivência prolongada em pessoas infectadas pelo HIV (Tillmann et al., 2001). O vírus GBV-C se replica em linfócitos B e T incluindo células T CD4 +, e a replicação desse vírus em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) diminui a expressão de co-receptores do HIV, como os receptores de quimiocinas CCR5 (receptor de quimiocina cisteína-cisteína tipo 5) e CXCR4, na superfície dessas células, e também aumenta a expressão de quimiocinas que funcionam como inibidores competitivos dos co-receptos de HIV. A estrutura geral do genoma DENV é semelhante a do vírus da hepatite G (GBV-C), com algumas exceções; nos vírus DENV a fosfoproteína NS5 não é processada em dois polipeptídeos (NS5A e NS5B), como é no vírus da hepatite G. A porção amino-terminal das proteínas NS5 dos DENV tem atividade metil-transferase, enquanto que o GBV-C usa um local de entrada interno ao ribossomo para tradução direta da poliproteína viral. Apesar das diferenças, as sequências de aminoácidos da NS5 dos DENV e da NS5A do GBV-C são 15% idênticas (Xiang et al., 2009; McLinden et al., 2008). O co-receptor de HIV CCR5 é um membro da família de receptores acoplados à proteína G, sendo expresso, majoritariamente, na superfície de uma ampla variedade de células que podem ser infectadas por HIV, como as células T e macrófagos que também são permissivas aos vírus DENV (Miranda et al., 2010). Uma das drogas utilizadas no tratamento do HIV é o maraviroque (MrV), que atua como um antagonista de receptores CCR5, tendo como alvo os receptores de quimiocina CCR5, presentes nos linfócitos T, as principais células do hospedeiro infectadas pelo HIV (Miranda et al, 2010). Apesar de vários receptores para os vírus DENV já terem sido elucidados, ainda não foi verificado se o CCR5 é um deles. Como há diminuição da viremia do HIV em pacientes coinfectados por dengue pode-se especular que o CCR5, que é importante para a infecção do vírus HIV tenha participação na infecção por dengue, já que, interferências cruzadas sugerem uma via comum de infecção (Dasika & Letchworth, 2000). 22

24 Introdução Figura 02: Medições longitudinais da carga viral de HIV-1 em um paciente com dengue ( ) na fase aguda e durante 4 semanas. A carga de vírus mediana para seis indivíduos infectados com HIV-1 sem coinfecção ( ). Modificado de Watt,

25 Objetivos

26 Objetivos 2. Objetivos O objetivo do presente trabalho é a determinação da possível atividade antiviral do MrV sobre o vírus DENV 2 através da inibição do receptor CCR5 em cultura de células U937 (linhagem celular monocítica humana), visando avaliar conjuntamente a participação deste receptor na infecção pelos DENV 2. Para isto foram realizados ensaios de redução da carga viral por PCR quantitativa (qrt-pcr) em diferentes concentrações da droga, e em diferentes tempos de adição desta, pretendendo mensurar a atividade do receptor CCR5 na infecção de células U937 por DENV 2. 25

27 Material e métodos

28 Material e métodos 3. Material e métodos 3.1. Células Inicialmente as células sugeridas para a realização dos experimentos envolvendo os vírus da dengue e a droga maraviroque foram as células mononucleares humanas do sangue periférico (PBMC), porém seriam necessários muitos mililitros de sangue para a obtenção de células suficiente para realização dos experimentos. Além disso, para uma maior fidelidade dos experimentos seria necessário que essas células fossem retiradas do sangue periférico de uma mesma pessoa, para que não houvesse variação da quantidade e na natureza dos receptores em estudo. Como alternativa para este problema passou-se a utilizar as células U937 (não aderentes), derivadas de uma linhagem de monócitos humanos que também possui o receptor CCR5 (Rossi et al., 2011). As células U937 foram cultivadas a 37 C em garrafas de 75 ml com densidade entre 1x10 5 e 2x10 6 em meio RPMI (Meio Roswell Park Memorial Institute) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SFB), antibióticos (penicilina 100 U/ml, estreptomicina 1 mg/ml) e L-Glutamina. No preparo dos estoques virais foram utilizadas células de mosquito Aedes albopictus (C6/36), cultivadas em estufa a 28 C em meio Leibowitz L-15, suplementado com 10% de SFB), L-Glutamina e antibióticos. Já para os ensaios de plaque foram empregadas células de rim de macaco verde africano (Vero), cultivadas em estufa a 37 o C em meio essencial de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementadas com SFB a 10% (manutenção das células) ou 2% (durante o cultivo do vírus), L-Glutamina e antibióticos Estoque viral As cepas padrão utilizadas para a realização do primeiro estoque foram DENV-2 TR1751 (Trinidad R 1751) e New Guinea C. As culturas foram inoculadas, separadamente, a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10, adsorvidas por 90 minutos a 37 C, em estufa, e cultivadas por 5 dias. O estoque viral foi centrifugado por 5 minutos a 5000 G e o sobrenadante congelado a -20 C com 20% do SFB. 27

29 Material e métodos No preparo de um segundo estoque viral, devido à dificuldade da obtenção de títulos adequados, utilizou-se a técnica de ultracentrifugação para concentração dos vírus. A cepa TR1751 foi cultivada, como descrito anteriormente, entretanto num volume de cultura quatro vezes maior, seguido de arraste do vírus com polietilenoglicol (PEG 8000). Oito por cento de PEG foram dissolvidos no sobrenadante sob agitação overnight a 4 C que, em seguida foi centrifugado a G por 1 h a 4 C. O pellet formado foi ressuspendido em 2ml de DMEM, aplicado sobre um cushion de sacarose a 30%, e ultracentrifugado a G por 3h. Finalmente o pellet foi ressuspendido em tampão TNE com ph Extração de RNA Para a extração de RNA foi utilizado o kit QIAamp Viral RNA mini kit (QIAGEN Califórnia, USA) através do qual extraiu-se o RNA de 140 µl do sobrenadante das culturas, conforme instruções do fabricante, sendo posteriormente eluídos em um volume final de 50 µl e estocado em freezer -70 C até o momento do uso RT-PCR Utilizou-se o RNA extraído dos estoques virais para realização da RT-PCR e determinação do sorotipo segundo Lanciotti, et al, 1992, na qual utilizou-se o QIAGEN One step RT-PCR kit (QIAGEN, Alemanha) e primers específicos, previamente descritos por Harris et al em 1998 (Tabela 1). As etapas de ciclagem foram 50 C por 30 minutos para realização da transcrição reversa, 95 C por 15 minutos para inativação da transcriptase reversa, seguidos de 40 ciclos de 94 C por 1 minuto, 55 C por 1 minuto e 72 C por 1 minuto. O resultado das amplificações foi detectado por eletroforese em gel de agarose 2%, corado com GelRed (Biotium, USA) e visualizado sob ação de luz ultravioleta. Tabela 01: Primers para Multiplex RT-PCR, segundo Harris et al., Primer Seqüência D1 TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G TS1 CGT CTC AGT GAT CCG GGG G TS2 CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG TS3 TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAG C DEN4 TGT TGT CTT AAA CAA GAG AGG TC 28

30 Material e métodos 3.5. Titulação viral por ensaio de plaque Para o preparo das placas utilizadas nesta titulação 1x10 6 células Vero foram semeadas em placa de 24 poços e cultivadas por aproximadamente 24 h a 37 C e 5% de CO 2. Em seguida foram preparadas diluições seriadas do DENV 2 em meio DMEM sem SFB. O meio de cultivo foi removido e 100 µl de cada diluição do vírus foram inoculados em triplicata. O inóculo foi adsorvido por 1 h agitando-se a placa a cada 15 min, e em seguida retirado, e a cada poço foi adicionado 1 ml de meio semisólido DMEM com 2% de carboximetilcelulose (CMC) e 2% de SFB. Posteriormente a placa foi incubada por 7 dias e finalmente as células foram fixadas por 1 h com solução de formaldeído tamponado a 10% e coradas com cristal violeta 2% para contagem dos plaques Citotoxicidade A citotoxicidade da droga maraviroque foi testada pelo ensaio da atividade da desidrogenase mitocondrial com 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazólio (MTT, Acros Arganics, USA). A droga foi preparada a partir de dois comprimidos triturados de Celsentri, com 150 mg de MrV cada, e em seguida, o pó obtido foi misturado à 10 ml de meio RPMI não suplementado com SFB até que fosse dissolvido ao máximo, depois, esta solução foi agitada por 10 min no vortex e posteriormente centrifugada por 10 min à 2500 G. Por fim, a solução foi filtrada de maneira asséptica com filtro de 0,2 µm, aliquotada e congelada a -20 C. No final obtivemos uma solução de MrV à 30mg/ml. Para a determinação da citotoxicidade foram preparadas placas de 96 poços com 0,3x10 6 células U937 em 50 µl por poço com meio RPMI suplementado com 10 % SFB. Essas placas foram incubadas por 24 h a 37 C e em seguida foram acrescentadas as concentrações teste de MrV. Nos primeiros ensaios foram avaliadas as concentrações de 0,11 mg/ml a 7,5 mg/ml, com três dias de contato das células com a droga. Para a obtenção dessas concentrações foram realizadas diluições 1:2 a partir da solução de estoque suplementada com 2 % de SFB. Em ensaios posteriores foram avaliadas as concentrações de 0,05 mg/ml a 7 mg/ml, aumentando o tempo de contato entre as células e a droga para sete dias. Cada concentração e o controle eram dispostos na placa em replicata. Após os três ou sete dias de incubação foram adicionados 50 µl de solução de PBS com 2 mg/ml de sal de MTT e em seguida as placas 29

31 Material e métodos foram novamente incubadas a 37 C por quatro horas. Depois foram adicionados 100 µl de isopropanol acidificado com HCl (0,08 mol/l) e as placas foram agitadas por 30 min para dissolução dos cristais de Formazan. Por fim foi realizada a leitura das placas em espectrofotômetro a 540 nm e com filtro de referência de 620 nm. A absorbância obtida é diretamente proporcional à viabilidade celular que é determinada pela seguinte fórmula: % Curva de crescimento do DENV-2 TR1751 em células U937 Para a realização deste experimento foram preparadas placas de 96 poços com 0,3x10 6 células U937 por poço em meio RPMI suplementado com 10% de SFB, incubadas por 24 h em estufa a 37 C. Após o período de incubação as células de cada poço foram recolhidas e centrifugadas a 2000 G por 5 min. Em seguida, as células foram resuspensas em meio RPMI com 2% de SFB. No primeiro ensaio deste experimento as células foram inoculadas com o vírus DENV 2 TR1751 em MOI de 0,1 e 1,0. Para cada MOI de cada dia foi realizada uma diluição seriada até a concentração de As replicatas foram colhidas a cada 24 h a partir do primeiro dia de infecção até o sétimo dia e depois congeladas a -20 C. Porém, neste primeiro experimento, o inóculo foi deixado em contato com as células de modo que não obtivemos resultados claros, por isto, no segundo ensaio as células foram inoculadas com MOI de 1,0 e o inóculo permaneceu em contato com as células por apenas 1 hora. Após este tempo as células foram coletadas, centrifugadas à 2500 G por 5 min (retirando-se o inóculo), ressuspensas em meio RPMI com 2% de SFB e mantidas em estufa a 37 C por 7 dias. As replicatas também foram coletadas a cada 24 h a partir do primeiro dia de infecção até o sétimo dia e depois congeladas a -20 C. Em seguida foi realizado um ensaio de plaque e uma qrt-pcr Avaliação da carga viral da curva de crescimento Obtenção da curva padrão A metodologia referente à padronização da técnica de RT-PCR em tempo real foi desenvolvida por pesquisadores do laboratório segundo Castro,

32 Material e métodos RT- PCR em tempo real Os oligonucleotídeos e sondas utilizados na RT-PCR em tempo real estão descritos na Tabela 2. Tabela 02: Características dos oligonucleotídeos utilizados na avaliação da carga viral. Oligonucleotídeos Sequência Sonda Sorotipo Tamanho (pb) FD2 5'CTAAATGAAGAGCAGGACAAAAGGT3' TGCAAACACTCCATGGTA DENV RD2 5'ATCCATTTCCCCATCCTCTGT3' As reações de amplificação foram realizadas utilizando-se 3µL de RNA, 2µL do reagente QuantiTect Virus Master Mix (QIAGEN, Germantown, EUA), 0,1µl do reagente QuantiTect Virus RT Mix, 0,38µL dos oligonucleotídeos (10 pmol) e 0,38 µl da sonda (10 pmol), e água para completar o volume final de 10 µl. As condições de amplificação foram: 50 C por 30 min e 95 C por 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 C por 15 segundos e 60 C por 60 segundos. A reação foi executada no aparelho 7500 FastReal-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Os resultados foram analisados com o software 7500 Software v (Applied Biosystems, City, EUA), tendo como base o valor de CT (cycle threshold), que corresponde ao ciclo no qual é atingido o limiar da detecção da fluorescência emitida pelo fluoróforo liberado da sonda durante a reação de PCR em tempo real. A curva padrão possibilitou, por extrapolação, o cálculo do número de cópias em 3µL de RNA. Para obter o número de cópias/ml de cultura o valor obtido foi multiplicado por 142, (conversão para 60µL de RNA eluído, extraído de 140µL de cultura celular) Imunoflorescência Em todos os experimentos envolvendo as curvas de crescimento houve acompanhamento da infecção viral por imunoflorescência indireta na qual foram coletados 100 µl da suspensão celular de cada poço da placa. Em seguida as células foram lavadas duas vezes pela adição de 1ml de PBS 1x e posteriormente centrifugadas a 2500 G por 5 min. As células foram ressuspensas, e 15 µl destas células foram colocados em duplicata em uma lâmina de imunoflorescência, que permaneceu sobre a bancada até que estivesse seca, e logo depois foi imersa em acetona gelada (-20 C) por 30 min, sendo novamente deixada sobre a bancada até secar. Logo depois, 15 µl de anticorpos monoclonais (Millipore MAB 8705) 31

33 Material e métodos diluídos 1:400 foram adicionados sobre as células e a lâmina foi incubada em câmara úmida à 37 C por 30 min, depois a lâmina foi lavada por imersão em PBS 1x por 5 min. Posteriormente 15 µl de anticorpos anti-mouse IgG (Sigma F0257) também diluídos 1:400 foram adicionados a cada poço e a lâmina foi novamente incubada em câmara úmida à 37 C por 30 min, depois lavada por imersão em PBS 1x por 5 min. Por último os poços foram cobertos com glicerol 10% tamponado e cobertos com lamínula para visualização em microscópio de florescência Atividade antiviral do Maraviroque Ensaio de tempo de adição da droga Na realização dos experimentos envolvendo a atividade antiviral do Maraviroque foram preparadas placas de 96 poços com 0,3x10 6 células U937 por poço. A placa foi incubada em estufa úmida a 37 C por 24h e depois do período de incubação, foi adicionada a droga MrV nas concentrações de 0,2, 0,4, 0,6 e 0,8 mg/ml, 1h antes da adição do vírus. O vírus, com MOI de 1,0, foi adicionado na hora zero em todos os poços da placa, inclusive no controle viral, que não recebeu a droga. Seguidamente a droga (também nas concentrações de 0,4, 0,6 e 0,8 mg/ml) foi adicionada nos tempos 0, 6, 12, 24, 36 e 72 horas após a infecção viral. As triplicatas de cada concentração de cada hora de adição da droga foram juntadas em eppendorfs após 96 horas de infecção, e em seguida extraiu-se RNA das amostras de cada eppendorf, sendo realizada posteriormente a quantificação do RNA viral pelo método de qrt- PCR Análise estatística A análise estatística foi realizada com o auxílio do software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Foi realizado o teste ANOVA dois critérios, sem repetições, seguido pelo teste de Bonferroni para analisar as diferenças das diferentes concentrações da droga em relação ao controle nos diferentes tempos de adição da droga, as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando P < 0,05. 32

34 Resultados

35 Resultados 4. Resultados 4.1. Estoque viral Os estoques virais foram preparados conforme descrito acima, e foi observado que as células começaram a desprender-se a partir do quarto dia, e entre o quinto e o sexto dia, o conteúdo das garrafas foi coletado e congelado. Após RT-PCR, foi constatado que as duas cepas NGC e TR1751 realmente eram DENV-2 e eram puras (Figura 03). 800pb 350pb 119pb Figura 03: Produto de amplificação por RT-PCR dos estoques de DENV-2 segundo Lanciotti et al, 1992 com 119pb, característico dos DENVs 2. Coluna (1), marcador de 50pb invitrogen, (2) branco, (3) DV1 Hawaii, (4) DV 2 NGC, (5) DV2 TR1751, (6), (7), (8) e (9), RNAs controles de DV1, DV2, DV3 e DV4 respectivamente Titulação viral Titulação do estoque viral Inicialmente a titulação viral foi o maior obstáculo encontrado em virtude da dificuldade da obtenção de plaques nítidos e de um título adequado no estoque original de DENV-2 New Guinea C. Embora a proposta inicial fosse de titular o vírus por contagem de foco por imunoperoxidase, uma vez que a cepa padrão dos estoques do laboratório não estava formando plaques, continuamos insistindo no plaque enquanto padronizávamos o ensaio de 34

36 Resultados foco. Iniciamos a titulação por plaque de maneira convencional utilizando-se a linhagem Vero na preparação das placas, porém o título obtido era muito baixo (10 4 PFU/ml) e a nitidez das placas muito ruim, então outras linhagens de culturas celulares, como BHK (Baby Hamster Kidney) e Vero E6 foram utilizadas no preparo das placas. Outras variações como substituição do meio semissólido CMC por meio sólido com agarose a 1,5%, variação do tempo de cultivo das placas, e contagem das células infectadas utilizando-se imunoperoxidase, também foram realizadas. Com essas mudanças, a nitidez da placa tornouse melhor, porém, não houve sucesso em aumentar o título viral. Obteve-se então outra cepa de vírus DENV-2, a TR1751, na qual a titulação passou a funcionar em células Vero e células Vero E6, com meio semissólido CMC, obtendo-se o título de 3,75 x 10 8 PFU em célula C6/36. Em posteriores tentativas, o plaque passou a funcionar também na cepa New Guinea C, utilizada no início dos experimentos de ensaio de plaque. Na preparação do segundo estoque viral da cepa TR1751 a partir de ensaios de plaque (com células Vero e meio semissólido CMC) obteve-se o título de 2,0 x 10 9 PFU Titulação da curva de crescimento A titulação viral dos dias da curva de crescimento foi realizada por ensaios de plaque (Figura 4) e por qrt-pcr obtendo-se os seguintes resultados: Tabela 03: Resultado da titulação viral por plaque da curva de crescimento de células U937 infectadas (com permanência do inóculo) pelo vírus DENV 2 em PFU/ml. MOI 0,1 MOI 1,0 Dia 1 2x10 2 4x10 2 Dia 2 1,9x10 3 1,4x10 3 Dia 3 2,2x10 3 1,25x

37 Resultados Figura 04: Plaque realizado na titulação da curva de crescimento. É possível observar placas de lise viral nos poços que correspondem ao segundo e ao terceiro dia de infecção (1 e 2, controle celular, 3 e 4, 2 dia de infecção com 1,4x10 3 PFU, 5 e 6 3 dia com 1,25x10 3 ). 1,40E+03 Unidades formadoras de 1,20E+03 1,00E+03 8,00E+02 6,00E+02 4,00E+02 2,00E+02 0,00E Figura 05: Resultado da titulação viral por plaque da curva de crescimento de células U937 infectadas pelo vírus DENV 2 (com a retirada do inóculo) em PFU. 36

38 Resultados Número de cópias /ml 3,01E+09 2,51E+09 2,01E+09 1,51E+09 1,01E+09 5,10E+08 1,00E Dias pós Figura 06: Resultado da titulação viral por qrt-pcr da curva de crescimento de células U937 infectadas pelo vírus DENV 2 (com a retirada do inóculo) em número de cópias por ml. Figura 07: Regressão linear entre os valores de Ct (Ciclo threshold) e as concentrações de RNA transcrito em número de cópias/µl. 37

39 Resultados 4.3. Citotoxicidade Como a proposta inicial de titulação era por contagem de foco por imunoperoxidase, que era realizada em três dias pós-infecção, determinamos a citotoxicidade do MrV levandose em conta os três dias de experimento, e a partir das DOs obtidas nas células tratadas com diferentes concentrações de MrV foi determinada a viabilidade em função da concentração que provocava morte em 50% das células (CC 50 ) em função do tempo (Figura 08). A CC 50 foi determinada por análise do gráfico, chegando-se ao valor de 1,05 mg/ml. Porém depois de realizados os ensaios de MTT para determinar as concentrações de trabalho de MrV, levando-se em conta o sucesso com os plaques nas células Vero, decidiu-se modificar o tempo de incubação do experimento de citotoxicidade para 7 dias, uma vez que a técnica de titulação foi modificada para ensaio de plaque (que leva 7 dias) e que é um método ouro para titulação viral, além de ser importante para o estudo de receptores virais. Deste modo, foram realizados outros experimento de citotoxicidade com sete dias de incubação da droga e a CC 50 também foi determinada por análise do gráfico, Figura 09, chegando-se o resultado de 0,7mg/ml (%) Viabilidade ,05 0,11 0,23 0,46 0,93 1,87 3,75 mg/ml Figura 08: Viabilidade celular em função da concentração da droga maraviroque em ensaio de citotoxicidade por MTT com três dias de incubação. A CC 50 de 1,05 mg/ml foi determinada por análise do gráfico. 38

40 Resultados (%) Viabilidade ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 mg/ml Figura 09: Viabilidade celular em função da concentração da droga maraviroque em ensaio de citotoxicidade por MTT com sete dias de incubação. A CC 50 de 0,7 mg/ml foi determinada por análise do gráfico Ensaio de tempo de adição da droga Os resultados obtidos a partir da realização do qrt-pcr com as amostras de RNA viral extraídas das replicatas das diferentes concentrações da droga MrV em diferentes tempos de adição podem ser observados na figura 10. A análise estatística destes dados informa que há uma redução estatisticamente significativa da quantidade de cópias de RNA viral em relação a quantidade de cópias do controle (5,0x10 8 ), porém o tempo de adição da droga não é estatisticamente significativo na redução do números de cópias do RNA viral. Este resultado foi processado por um teste ANOVA dois fatores sem repetição de modo que o software assumiu que as concentrações possuem o mesmo efeito em todos os níveis de tempo. 39

41 Resultados Figura 10: Número de cópias de RNA viral de DENV 2 em relação ao tempo de adição da droga MrV. As diferentes linhas representam as concentrações da droga utilizada no experimento em mg/ml. 40

42 Discussão

43 Discussão 5. Discussão Existem dois casos descritos na literatura de co-infecção do Vírus HIV-1 e do vírus da dengue na forma hemorrágica (FHS) e ambos apresentam diminuição da carga viral do HIV na fase aguda da doença febril (Mendes et al., 2006; Watt et al., 2003). Porém se a dengue tem um efeito inibitório sobre a carga viral de HIV, a natureza deste efeito permanece desconhecida. Utilizando a técnica de qrt-pcr para observar a redução da infecção viral pelo vírus DENV-2 possivelmente induzida pela droga MrV objetivamos elucidar a participação do receptor de quimiocina CCR5 (atuante na infecção de células mononucleares pelo vírus HIV), na infecção viral do vírus DENV. Para experimentos realizados com drogas, a determinação da citotoxicidade é um procedimento importante, sendo fundamental que elas atuem sobre os vírus, porém que sejam inócuas ou pouco tóxicas às células. A citotoxicidade de uma droga pode influenciar nos resultados da atividade antiviral à medida que esta pode ter uma toxicidade alta podendo matar as células, diminuindo a infecção pelo vírus e consequentemente o título viral, dando a impressão de que a droga foi efetiva contra a infecção, desta maneira, é recomendável utilizar concentrações menores do que as que afetam 50% das células em estudo; deste modo as concentrações utilizadas nos ensaios de tempo de adição da droga foram menores que 1,05 mg/ml, que é a CC 50 para as células U937 em contato com a droga por três dias. Na realização da curva de crescimento, encontramos resultados compatíveis com os de O Sullivan & Killen, 1994, em que células U937 foram infectadas com DENV 1 e MOI 1, e o pico liberação de vírus no sobrenadante é no segundo dia, com a diferença que nossa cepa viral é a DENV 2. Porém nos primeiros experimentos que realizamos o inóculo aplicado permaneceu em contato com as células, de modo que não pudemos interpretar se o título viral encontrado era decorrente do inóculo ou de vírus produzidos pelas células U937. Só foi possível a titulação desta primeira curva de crescimento, por plaque, dos dias 1, 2 e 3, pois os outros dias coletados da curva estavam contaminados. Para podermos determinar se os resultados obtidos foram provenientes do inóculo ou dos vírus produzidos pelas células U937 repetimos os experimentos de curva de crescimento removendo o inóculo, de modo que ele não fosse detectado na titulação viral. A partir da observação de que as titulações realizadas pelo método de plaque com MOI de 1,0 e 0,1 no primeiro experimento da curva de crescimento possuíam números muito similares (mesmo 42