AVALIAÇÃO DE REPARO ÓSSEO POR MEIO DE ENXERTO DE TECIDO ADIPOSO INTRADÉRMICO EM CALVÁRIA DE COELHOS: ESTUDO PILOTO.

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1 1 AVALIAÇÃO DE REPARO ÓSSEO POR MEIO DE ENXERTO DE TECIDO ADIPOSO INTRADÉRMICO EM CALVÁRIA DE COELHOS: ESTUDO PILOTO. Evaluation of the bone repair using subcutaneous adipose tissue grafting: A pilot study Daniel Xavier CERCI 1 Luiz Fernando de Moura SAK 1 Allan Fernando GIOVANINI 2 Tatiana Miranda DELIBERADOR 2 Endereço correspondência: Universidade Positivo Rua Professor Pedro Viriato Parigot de Souza, Campo Comprido Curitiba Paraná CEP danielxcerci@gmail.com; luifsak@yahoo.com.br; 1 Alunos do curso de Odontologia - Universidade Positivo, Curitiba, Brasil. 2 Professores do curso de Odontologia - Universidade Positivo, Curitiba, Brasil.

2 2 RESUMO A procura de um biomaterial autógeno que possua capacidade osteoindutora e osteocondutora é de suma importância para as áreas médica e odontológica na finalidade reconstruir e reparar deficiências ósseas que foram perdidas por trauma, neoplasia ou lesões císticas. Enxerto de tecido adiposo intradérmico, tem sido considerado como uma alternativa plausível para a reconstrução óssea, uma vez que este tecido constitui uma fonte importante de células tronco mesenquimais. O objetivo deste estudo foi avaliar o reparo óssea produzidos em calvária de coelho associado ao enxerto de tecido adiposo autógeno. Um defeito ósseo crítico de 15 mm de diâmetro e 2,0 mm de profundidade foram produzidos na calota craniana de 6 coelhos. Os defeitos cirúrgicos foram preenchidos com tecido adiposo intradérmico e avaliação histológica e histomorfométrica foram realizados para avaliar o reparo e o volume de tecido ósseo neoformado no período de 40 dias pós-cirúrgico. Os resultados deste estudo demonstraram que o grupo preenchido por tecido adiposo mostrou maior deposição de matriz mineral (13,0±1,6mm 2 ) quando comparado ao grupo controle (2,7±0,77mm 2 ). Desta forma conclui-se que o tecido adiposo pode ser considerado um alternativa para o reparo de defeito critico craniofacial. Palavras chave: células-tronco; tecido adiposo, regeneração óssea. ABSTRACT The search for autogenous biomaterial that has osteoinductive and osteoconductive capacity is of paramount importance for the medical and dental care in order to rebuild and repair bone defects that were lost by trauma, cancer or cystic lesions. Intradermal adipose tissue grafting has been considered as a plausible alternative to bone reconstruction, since this tissue is an important source of mesenchymal stem cells. The

3 3 aim of this study was produced in bone repair of rabbit calvarial associated with autogenous fat graft. A critical bone defect of 15 mm in diameter and 2.0 mm in depth were produced in the skull of 6 rabbits. The surgical defects were filled with adipose tissue intradermal, histological and histomorphometric analysis were performed to assess the repair and the volume of newly formed bone tissue within 40 days after surgery. The results present herein demonstrated that the group filled with adipose tissue showed increased deposition of mineral matrix (13.0 ± 1.6 mm 2 ) when compared with the control group (2.7 ± 0.77 mm 2 ). Thus it is concluded that adipose tissue may be considered an alternative for craniofacial repair in critical defects. Key-words: stem-cells; adipose tissue; bone regeneration. INTRODUÇÃO Inúmeros trabalhos na literatura continuam a busca por um substituto ósseo biológico que seja capaz de promover de forma mais rápida e densa a regeneração óssea craniofacial 1. Recentemente, terapias baseadas no uso de células tronco para reparo de diferentes tecidos e órgãos tem contribuído como uma importante alternativa terapêutica na área da regeneração tecidual. 2 A utilização destas células tronco como biomaterial viável parte do princípio que estas são multipotentes e estão presentes em diversos tecidos adultos, incluindo a medula óssea, o osso e tecido adiposo, e podem se diferenciar em inúmeros diferentes tecidos mesenquimais. 3 O tecido adiposo tem provado ser uma fonte rica em células-tronco adultas multipotentes que compartilham a mesma origem das células ósseas e hematopoiéticas. A diferenciação de uma células tronco para possível fenótipo ósseo, adiposo ou hematopoiético deriva de uma possível indução de fatores de crescimento intrínsecos da medula óssea ou originário do periósteo. Ainda mais, por haver uma intima relação

4 4 entre desenvolvimento de lipoblasto e osteoblasto, células adiposas maduras também podem sofrer trans-diferenciação para tecido ósseo perdendo sua expressão protéica original passando a expressar um caráter fenotípico celular de tecido ósseo. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo experimental em coelhos para o estudo de defeitos críticos e analisar o reparo ósseo craniofacial associado ao enxerto de tecido adiposo subcutâneo por meio de análise histológica e histomorfométrica, e comparando estes resultados ao reparo somente induzido pelo coágulo. MATERIAIS E MÉTODOS Modelo experimental Para a realização do presente estudo foram utilizados 6 coelhos com idade média de 6 meses, machos e com peso de aproximadamente 4 kg, tendo sido obtida a aprovação do Comitê de Ética no uso de animais da Universidade Positivo, Curitiba/PR, Brasil, respeitando-se as devidas recomendações de proteção aos animais segundo a instituição e as leis nacionais do uso de animais em laboratórios. Os animais foram mantidos no biotério desta Universidade, sob temperatura controlada de 22 C e alimentação com ração e água mineral. Procedimento cirúrgico Para a realização do procedimento cirúrgico todos os animais receberam medicação pré-anestésica de Butorfanol (0,1 mg/kg) administrada via intra-muscular e medicação anestésica com a associação de Cloridrato de Quetamina 35 mg/kg e de Cloridrato de Xilazina 5mg/Kg administradas via intra-muscular. Após anti-sepsia, uma incisão semi-lunar foi realizada na calvária rebatendo-se o retalho, seguindo-se posteriormente de uma incisão no periósteo, o qual também foi afastado na mesma direção. 4 Um defeito de tamanho crítico (DTC) de 15 mm de diâmetro qual incluiu uma porção da sutura sagital foi criado com uma trefina acoplada em uma peça de mão de baixa rotação, sob irrigação abundante com solução salina estéril. 5 Com auxílio de um guia cirúrgico previamente confeccionado, uma marcação no formato de L foi realizada a 2 mm anterior e outra 2 mm posterior às margens do

5 5 defeito cirúrgico com uma broca carbide tronco-cônica. O longo eixo de cada L localizou-se sobre uma linha imaginária longitudinal que dividia o defeito cirúrgico ao meio. As marcações foram, então, preenchidas com amálgama (Figura 1) para posterior identificação do meio do defeito cirúrgico original durante o processamento laboratorial e, também, para localização das suas margens ósseas originais durante as análises histológica, histométrica. Deforma randomizada, Os defeitos foram prenchidos, somente com coágulo sanguíneo caracterizando o Grupo C (controle). Outros, como no grupo TAM, o defeito foi preenchido com tecido de tecido adiposo macerado. Para cada grupo n=3 coelhos foram analisados. Obtenção de tecido Adiposo Para a obtenção do tecido adiposo, a metodologia descrita por Torres et al. 6 foi utilizada. Com auxílio de uma lâmina 15, uma incisão com cerca de 5 cm foi realizada na parte posterior a base do crânio ao longo da linha dorsal- medial no sentido craniocaudal com tamanho de aproximadamente 2 a 3 cm. O tecido adiposo da região exposta foi removido cuidadosamente com tesouras e pinças estéreis. No Grupo TAM um fragmento do tecido adiposo removido foi macerado com o auxílio de 2 lâminas de bisturi 15c para então ser enxertado no defeito ósseo cirurgicamente criado. Os tecidos moles foram, então, reposicionados e suturados para obter um fechamento primário da ferida (Vycril 4-0, Ethicon, São Paulo, SP, Brasil para suturas internas e Seda 4-0, Ethicon, São Paulo, SP, Brasil para suturas externas). Cada animal recebeu injeções intramusculares diárias de enrofloxacino (5 ml/kg de peso corporal) uma vez ao dia durante cinco dias. Já a analgesia foi mantida com o uso de Paracetamol diluído em água (200mg/Kg) 3 vezes ao dia durante 5 dias. Todos os animais foram eutanasiados através de injeção endovenosa com Tiopental (10 mg/kg) no quadragésimo dia pós-cirúrgico. Processamento tecidual A área do defeito cirúrgico original e os tecidos circunjacentes foram removidos em bloco. As peças foram fixadas em solução de formol neutro a 10%, lavadas em água corrente e descalcificadas em solução de ácido etilenodiaminotetracético a 18%. Após descalcificação inicial, cada peça foi longitudinalmente hemi-seccionada em dois blocos, exatamente ao longo do centro do defeito cirúrgico original, usando-se o longo

6 6 eixo de cada marcação de amálgama em formato de L como referência. Foram realizados, também, cortes transversais que tangenciaram o eixo menor de ambas as marcações em L, de modo que cada espécime ficasse com 19 mm de extensão no sentido longitudinal. Assim, tornou-se possível a determinação precisa dos limites do defeito cirúrgico original para realização das análises histológica e histomorfométrica (Fig. 2). Após um período de descalcificação adicional, as peças foram processadas e incluídas em parafina. Foram realizados cortes seriados longitudinais, com 6 µm de espessura, iniciados a partir do centro do defeito cirúrgico original. Os cortes serão corados pelas técnicas de Hematoxilina e Eosina (H.E.) ou Tricrômico de Masson para análises com microscopia de luz. Análise histomorfométrica Foram selecionados 2 cortes histológicos, representando o centro do defeito cirúrgico original, para as análises histológica e histométrica. As imagens dos cortes histológicos foram capturadas por uma câmera digital acoplada a um microscópio óptico, com um aumento de 32 e salvas em um computador (extensão tiff). A análise histomorfométrica foi realizada com o auxílio do software Image tool 2 (UCLA). Os seguintes critérios, foram usados para padronizar a análise histomorfométrica das imagens digitalizadas: 1) A Área Total (AT) a ser analisada correspondia à área total do defeito cirúrgico original. Esta área foi determinada, primeiramente, pela identificação das superfícies externa e interna da calvária original nas margens direita e esquerda do defeito cirúrgico. Estas superfícies foram conectadas com linhas desenhadas seguindo suas respectivas curvaturas. Foram então medidos, a partir de ambas as extremidades do espécime, 2 mm em direção ao centro do defeito para estabelecer os limites do defeito cirúrgico original. A Área de Osso Neoformado (AON) será delineada dentro dos limites da AT. 2) A AT foi medida em mm 2 e considerada 100% da área a ser analisada. A AON também foi medida em mm 2 e calculada como uma porcentagem da AT. Os valores de AON de cada animal foram representados pela porcentagem média dos 2 cortes histológicos. Os dados foram submetidos para análise estatística. (FIG. 4)

7 7 RESULTADOS Uma breve descrição das características histológicas entre os grupos são apresentadas abaixo, enquanto dados histomorfométricos são apresentados na Tabela 1. Grupo Controle: Ao quadragésimo dia pós cirúrgico foi verificado uma fina camada de tecido conjuntivo composto por intensa quantidade de fibroblastos e vascularização (Figura 3A). Notou-se deposição óssea apenas na interface osso tecido conjuntivo, áreas da borda do defeito (Figura 3B). Grupo Tratados com enxerto de tecido adiposo: Na eutanásia após o quadragésimo dia a área do defeito criado artificialmente demonstrou intensa quantidade de tecido adiposo maduro, circundado por área de deposição fibrótica. Notou-se ainda deposição de matriz óssea esparsada mimetizando ossificação intramenbranosa de um osso haversiano (Figura 3C), e foi verificado também produção intracelular de formação mineral no interior de células gordurosas maduras (Figura 3D e 3E). DISCUSSÃO O reparo ósseo constitui um processo biológico complexo de neoformação da arquitetura e função do tecido ósseo perdido ou danificado. 7 Este fenômeno ocorre frente a uma renovação óssea controlada, nas áreas onde existe um defeito ósseo, através da osteogênese e osteoindução, restabelecendo as características funcionais e estruturais dos tecidos lesados. 8, 9 Para o estudo de regeneração óssea craniofacial in vivo o principal modelo utilizado na literatura é por meio de defeitos críticos confeccionados em calota craniana (calvária) de coelhos. 9, 10 Mesmo sendo a enxertia óssea um método reconstrutivo amplamente utilizado por cirurgiões e pesquisadores, alguns defeitos ósseos, que são

8 8 considerados críticos não se regeneram ou reparam espontaneamente e requerem tratamento com biomateriais, que possuam propriedades osteocondutora e/ou osteoindutora, na tentativa de influenciar seletivamente a formação de um novo tecido ósseo, controlando a qualidade e a quantidade de osso no interior do defeito a ser 11, 12, 13, 14 reconstituído. A procura por biomateriais capazes de substituir e induzir o reparo ósseo é alvo de muitas pesquisas contemporâneas, contudo, a pesquisa do material de enxerto ideal no reparo ainda persiste como um dos maiores desafios da odontologia e medicina moderna. 15 Terapias baseadas a partir de células tronco para a reparação e regeneração de diferentes tecidos e órgãos vem oferecendo uma mudança considerável nas alternativas terapêuticas que possam fornecer soluções satisfatórias para uma série de doenças. 2,16 Com o intuito de desenvolver novas técnicas para a regeneração do tecido ósseo, as células tronco estão sendo utilizadas em ensaios experimentais 17 e clínicos. 18 Segundo Boyne 19, um material de enxerto ideal, deve promover osteogênese, não apresentar resposta imunológica hipersensível ao hospedeiro, estimular neoangiogênese e a osteoindução, promovendo osteocondução e ser substituído completamente por tecido ósseo maduro em quantidade e qualidade semelhante ao do hospedeiro. Neste sentido, o tecido adiposo autógeno tem provado servir como uma importante e abundante fonte de células-tronco adultas multipotentes, possuindo propriedades adequadas para engenharia de tecidos e regeneração tecidual de aplicações ortopédicas 2. Ainda mais, estudos sugerem que por ocorrer uma intima relação entre os tecidos estudados (uma vez que osso e gordura compartilham um mesmo clone celular) o nicho medular pode se comportar como um playground ou uma gangorra'' que pode balançar para trás e para frente entre o desenvolvimento ósseo e/ou a formação de

9 9 gordura. 20 Assim sendo, essas células gordurosas, tronco ou maduras, podem mudar seu caráter fenotípico uma vez estimulada por fatores intrínsecos/extrínsecos e diversos fatores de crescimento. 21 Uma vez estimulada, devido ao seu caráter pluripotente, a expressão protéica vai se perdendo, começa a imunoexpressar caráter fenotípico celular e tecidual a diversos tecidos, tornando-se diferenciada. 22 Nesse contexto este trabalho objetivou-se a enxertia de tecido gorduroso subcutâneo como possível biomaterial osteocondutor e os resultados apresentados aqui demonstraram que tecido gorduroso promoveu tanto um maior volume tecidual desencadeado no leito cirúrgico, quanto uma satisfatória neoformação óssea. Contudo no presente trabalho foi verificado processos distintos de formação mineral quando comparamos enxerto de tecido adiposo e controle. Quando enxertia de tecido adiposo foi usada, os resultados histológicos demonstraram moderada deposição óssea nas regiões periféricas do defeito, delimitando áreas periostais e endostais, simulando um sandwich de formação óssea intramenbranosa. Em contrapartida, deposição de tecido ósseo no grupo controle foi verificada apenas nas bordas do defeito em contigüidade ao remanescente ósseo concentrado na parede lateral do leito cirúrgico. Com estes resultados, podemos sugerir que o tecido adiposo pode ser um importante biomaterial para o processo de reparo ósseo, e por meio de análise histológica, podemos especular que esta mineralização desenfreada por este tecido enxertado pode ocorrer por duas vias diferentes. A primeira via ou hipótese a ser considerada é a possível diferenciação óssea advindas de células tronco mesenquimais adultas. Uma vez que o tecido adiposo constitui uma importante fonte de células tronco mesenquimais, estas células podem formar osso e medula óssea em um micro-ambiente definido, suportando tanto a osteoneogênese quanto a hematopoiese. 23

10 10 Corroborando com esta hipótese, inúmeros estudos in vitro e in vivo demonstram a evidência que células tronco mesenquimais clonadas da medula óssea humana foram capazes de diferenciação em múltiplas linhagens, tais como adipócitos, condrócitos e osteoblastos. 20, 24, 25, 26 Neste sentido, Gimble 27 descreve que o tecido adiposo é uma fonte abundante e acessível de células tronco as quais podem ser isoladas de tecido do tecido de origem por meio de lipoaspiração, digestão com colagenase e centrifugação diferencial. Os autor ainda adiciona que estas tronco adultas são multipotentes, diferenciando-se ao longo dos adipócitos em linhagem osteoblástica, e pode servir em outras funções, tais como o fornecimento de suporte hematopoiético e transferência de genes. Desta forma, esta hipótese pode ser construída no presente trabalho uma vez que a mineralização e formação de tecido ósseo ocorreram em regiões de matriz fibrosa associadas com células de morfologia fusiforme, ou estrelária. Um fato notável a ser relatado neste trabalho foi à presença de possível mineralização na região citoplasmática de células gordurosas maduras. Esse resultado sugere também que estas células gordurosas maduras enxertadas na calvária dos coelhos possuem a capacidade de sofrer transdiferenciação celular. 20 O termo transdiferenciação refere-se à mudança fenotípica de um tipo de célula diferenciada para outra de linhagem funcionalmente diferente. Pesquisas in vitro demonstram que esta transdiferenciação ocorrem principalmente entre adipócitos e osteoblastos por fatores de crescimento e ação hormonal, similarmente a um efeito de osteoporose, ou osteoporose as avessas. 28 Estudos como de Gimble 20 demonstram que o fenômento de trans-diferenciação possui importantes implicações terapêuticas, mas sugere cautela na sua confecção, uma

11 11 vez que compromisso prévio com a diferenciação, de uma ou outra linhagem particular é um evento aleatório. Os relatórios de pesquisa de Nuttall et al. 24 argumenta que, talvez, as células possam manter um fenótipo intermediário, que é capaz de expressar um misto de características de ambos tecidos adiposo e ósseo. CONCLUSÃO Os resultados apresentados aqui sugerem que o enxerto de tecido gorduroso pode ser considerado um biomaterial de enxerto viável, contudo ainda mais pesquisas devem ser realizadas para que se tenham resultados mais substanciais de como se comporta este tecido durante o reparo ósseo. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1- Cheryl TG, Karen JLB. Stem cells and adipose tissue engineering. Biomaterials 2006 (27) Mizuno H. adipose-derived Stem cells for tissue repair and regeneration: Ten year of research and literature review. Journal Nippon medic school; Song L, Tuan RS. Transdifferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow - The FASEB Journal express article /fj fje. 4- Vikjaer D, Blom S, Hjorting-Hansen E, Pinholt EM. Effect of platelet-derived growth factor-bb on bone formation in calvarial defects: an experimental study in rabbits; Euro Journal Science, 1997 feb;105(1): Hollinger JO, Kleinschmidt JC The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials; Journal Craniofacial Surgery 1990 Jan;1(1):60-8.

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15 15 ANEXOS Tabela 1: Análise histomorfométrica dos grupos analisados Grupo Área Tecidual Neoformada (mm 2 ) Área de deposição óssea (mm 2 ) Controle 16,46±3,12 2,7±0,77 Enxerto Tec. Adiposo Masserado 26,05±2,88 13,0±1,6 Figura 1. Defeito crítico na calvária de coelhos. Figura 2 (A) Corte longitudinal ao longo da linha central (y) do DTC; (B) cortes transversais (x); (C) espécime histológico pronto para inclusão em parafina.

16 Figura 3. (A) Grupo Controle: Ao quadragésimo dia pós cirúrgico foi verificado uma fina camada de tecido conjuntivo composto por intensa quantidade de fibroblastos e vascularização; (B) Notou-se deposição óssea apenas na interface osso tecido conjuntivo, áreas da borda do defeito; (C) Notou-se ainda deposição de matriz óssea esparsada mimetizando ossificação intramenbranosa de um osso haversiano; (D e E) Foi verificado também produção intracelular de formação mineral no interior de células gordurosas maduras. (Coloração HE, magnificação 40, exceto figures B e E em 100 ) 16

17 Figura 4 Gráfico estatístico comparando o critério "área de matriz mineral" entre os grupos con32trole e TAM. 17