PROTOCOLO DE USO E CUIDADOS COM ANIMAIS

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1 1 PROTOCOLO DE USO E CUIDADOS COM ANIMAIS Prezada O Comite de Ética do CCS já possui o parecer favorável para seu projeto de pesquisa que nos foi enviado para analise, o número de seu protocolo aprovado é : IBCCF 114. att Marcos Dias Protocolo No. 114 PROTOCOLO DE USO E CUIDADOS COM ANIMAIS I. PESQUISADOR E OBJETIVOS: A. Pesquisador principal: Isis Hara Trevenzoli Pessoa(s) participando das experiências: Camilla Pereira Dias da Rocha Luana Pasqualini Mariano Tatiana Fernandes Pontes B. Laboratório: Laboratório de Endocrinologia Molecular Telefone: Localização: Bloco G, subsolo G C. Título do projeto: Efeito da obesidade materna experimental sobre o perfil cardiometabólico da prole: programação metabólica D. O protocolo é: [ X_] Novo [ ] Revisão [ ] Renovação Anterior no. Anterior no. E. Descreva o(s) objetivo(s) da pesquisa.

2 Avaliar o efeito da obesidade materna induzida pela dieta em ratos sobre o desenvolvimento de resistência à leptina e distúrbios do perfil hormonal e metabólico da prole, visando principalmente à reversão das possíveis alterações pelo tratamento com resveratrol. Avaliar o efeito da obesidade materna sobre o desenvolvimento de distúrbios cardiometabólicos, função adrenal e tireoidiana de ratos adultos e sua reversão com o tratamento proposto. F. Colaboradores Carmen Pazos Moura/UFRJ Discussão do projeto Tânia Maria Ortiga Carvalho Discussão do projeto Egberto Gaspar de Moura/UERJ Discussão do projeto II. MODELO ANIMAL A. Descrição: Espécie : rato linhagem/cepa : Wistar Idade: 0 a 180 dias; peso: 6 a 500g [X] macho [_X_] fêmea Porque é necessário usar animais nesse projeto? O estudo da programação metabólica consiste na avaliação dos efeitos de alterações nutricionais durante o período perinatal (gestação e lactação) sobre o desenvolvimento da prole e só é possível de ser realizado em modelos in vivo. Não é possível reproduzir experimentalmente alterações no meio intra-uterino, que reúne uma série de fatores somente observada in vivo, em cultura de células. Assim como não é possível reproduzir a relação entre lactantes (mãe) e lactentes (prole) e comportamento alimentar ao longo da vida dos animais in vitro. Além disso, nosso objetivo é avaliar o impacto desses insultos no início da vida sobre o desenvolvimento de ratos até a idade adulta e tal avaliação temporal só é possível de ser feita em modelos in vivo. As modificações programadas para a vida adulta dependem de uma série de fatores hormonais e bioquímicos produzidos por diferentes tipos celulares que interagem entre si resultando em fenótipos variados, a depender do grau e tipo de insulto empregado no início da vida do animal. Desta forma contribuiremos para a o entendimento de doenças de grande prevalência na população mundial, como a obesidade e patologias associadas, bem como suas consequências sobre futuras gerações. C. Porque esta espécie é utilizada?

3 3 Analogias a seres humanos, tamanho e custo. Os modelos experimentais de programação são muito descritos na literatura em ratos, o que permite maior interação e discussão dos resultados obtidos nos projetos. Além disso, como os experimentos são realizados a longo prazo, ratos fornecem quantidades de amostras mais abundantes do que camundongos, espécie pouco utilizada para este tipo de estudo. D. Número total de animais 300 animais (separe o número de cada grupo experimental na seção VI) Porque esse número é necessário para esse estudo? Devido a grande variabilidade entre ninhadas, um número mínimo de animais (considerando fêmeas e machos para acasalamento e suas proles) é necessário para a validação dos resultados através das análises estatísticas. Trabalhando com um número de 8-10 animais por grupo e cada set experimental deverá ser repetido, de forma independente, 2 vezes. Análises hormonais necessitam de no mínimo 8 animais por grupo considerando as flutuações nas concentrações de hormônios que podem ocorrer por diversas razões como temperatura, horário do dia, estado alimentar, ciclos hormonais entre outros. III. ALOJAMENTO E ALIMENTAÇÃO DOS ANIMAIS: A. Os animais serão alojados: [ X_] Biotério Local/Sala No: LAT e subsolo bloco G. [ ] Laboratório [ ] Outro (especifique): B. Tipo de alojamento: [ ] Quarentena [_X_] Convencional [ ] Outro (especifique): C. Alimentação: [_X ] Convencional [ X_] Outra (especifique): Dieta preparada com alto teor de gordura para induzir obesidade. D. Hidratação: [ ] Automática [ ] Tigela Outra (especifique): Garrafa de água: [ ] autoclavada [_X_] filtrada [ ] clorada [ ] água da rede

4 IV. AGENTES NOCIVOS E RADIOATIVOS USADOS EM ANIMAIS: A. Agente(s) nocivo(s): [ X_] Não [ ] Sim se positivo, liste os agentes: (identifique os agentes utilizados para cada grupo experimental na seção VI) V. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS: A. Contenção (imobilização) 1. A contenção do animal será necessária [ ] Não [ X_] Sim a. para injeção ou coleta de material [X] b. para cirurgia [X] c. para alimentação de insetos d. outros Contenção [ X_] Manual [ ] Mecânica Por períodos [ X_] Curtos [ ] Longos 2. Relaxantes ou paralisantes musculares serão utilizados? [X] Não [ ] Sim se positivo, por favor explique: (indique na seção VI, para cada grupo experimental, o sistema de contenção ou fármaco e dose e tempo máximo que cada animal ficará contido). B. Anestesia (indique todas as respostas apropriadas): [ ] 1. Esse projeto não envolverá dor ou desconforto aos animais e portanto não serão necessários anestésicos, analgésicos ou tranquilizantes. exemplo de procedimentos que não requerem anestesia incluem administração de fluidos, imunização, medicamentos orais, coleta de sangue (exceto intracardíaca e periorbital), procedimentos da prática normal de veterinária e outros envolvendo diagnóstico e tratamento de doenças. [ X_] 2. Para evitar dor ou desconforto serão utilizados fármacos anestésicos, analgésicos, tranquilizantes ou eutanásia. (na seção VI coloque procedimentos, fármacos, doses, via de administração e duração da anestesia para cada grupo experimental). Exemplos de procedimentos que envolvem dor e que requerem anestesia incluem: cirurgia, qualquer agente que induza inflamação excessiva ou necrose, coleta de sangue intracardíaca ou periorbital. [ ] 3. Esse estudo envolve dor e desconforto aos animais sem o uso de um anestésico analgésico ou tranquilizante. (Use uma folha adicional para explicar porque é apropriado se abster de empregar esses fármacos nos animais experimentais) Procedimentos que causam mais do que dor fraca e momentânea e nos quais não se pode aplicar anes-tesia ou analgesia devem ter razões científicas justificáveis. Exemplos incluem procedimentos listados acima se realizados sem analgesia.

5 5 4. Como será avaliado o nível anestésico? [ ] pressão arterial [ X_] reflexo flexor [ ] frequência cardíaca [ ] reflexo da cauda ("tail-flick") [ ] frequência respiratória [ ] reflexo corneano [ ] EEG [ ] outros (especifique): 5. Que outras técnicas serão utilizadas para minimizar dor, desconforto ou sofrimento (p. ex:. eutanásia dos animais com complicações pós-cirurgicas)? As técnicas incluem hipotermia, períodos de condicionamento (ao estímulo ou à contenção), uso de estímulos que possam ser evitados pelo animal. C. Cirurgia: 1. Haverá alguma manipulação cirúrgica dos animais? [ ] Não [ X_] Sim (se positivo faça breve descrição para cada grupo experimental na seção VI). 2. As manipulações cirúrgicas resultarão em sobrevida: [ X_] Sim [ ] Não A cirurgia será realizada no: [ ] laboratório [_X_] biotério [ ] outro local (especifique): 3. Cada animal será submetido a múltiplas cirurgias? [ X ] Não [ ] Sim (se positivo, coloque a explicação na seção VI para cada grupo experimental). 4. Que cuidados e terapias pós-cirúrgicas serão utilizadas? Assepcia do local e observação imediata após a cirurgia. D. Administração de fármacos, reagentes e material radioativo: Serão administrados fármacos, reagentes ou outros materiais (incluindo células) aos animais? [ ] Não [ X_] Sim (inclua substância, dose/via, frequência e qualquer complicação conhecida do material na seção VI). E. Extração de fluidos antemortem: Serão extraidos fluidos (p.ex. sangue, urina, bile, líquor) dos animais? [ ] Não [_X_] Sim

6 (se positivo coloque na seção VI as seguintes informações: tipo de fluido, quantidade da amostra, frequência e método de coleta). F. Outras informações: Quando se aplicar, descreva o procedimento/planejamento de acompanhamento para animais moribundos e o momento no qual será aplicada a eutanásia. G. Eutanásia: Indique o método a ser usado nos animais: [ ] deslocamento cervical [ ] CO2 [ ] dose excessiva de anestesia [ ] outro (especifique): [X] decapitação [X] dessangramento com anestesia [ ] perfusão sob anestesia VI. PROCEDIMENTO: Nas seções anteriores, respostas positivas a textos marcados em negrito requerem informações adicionais. Forneça as informações para cada grupo experimental ou tratamento. O texto deve conter todas as informações necessárias para que os membros da comissão possam seguir a descrição de toda a manipulação do animal desde o início da experiência até a eutanásia e pósmorte. Use páginas adicionais se necessário. Número de Animais Obtenção de 10 ninhadas independentes por grupo experimental: Serão utilizados 10 machos adultos e 20 fêmeas adultas para o acasalamento: proporção 1:2 As ninhadas resultantes serão mantidas até a vida adulta com 6 filhotes cada. Todos os filhotes serão utilizados nos protocolos experimentais para otimização da obtenção de amostras e para minimizar o n amostral. O experimento será repetido uma vez. Total de animais: 300 Experimento 1: 2 filhotes de cada ninhada serão sacrificados após o desmame, aos 21 dias de idade, para avaliação da composição corporal (conteúdo de proteína e gordura corporais) por métodos gravitacionais e análise bioquímica. Antes do sacrifício coletaremos uma gota de sangue da ponta da cauda para aferição de glicemia com medidor automático. O sangue será coletado para análises hormonais e perfil lipídico. Tecidos como fígado, tecido adiposo, coração, músculo, tireóide, adrenais, hipotálamo, hipófise serão coletados para posterior análise bioquímica e para avaliação da expressão de conteúdo e mrna de proteínas envolvidas com a regulação do metabolismo como as proteínas da cascata de sinalização da leptina e da insulina (OBR, JAK2, STAT3, SOCS3, IR, IRS-1, PI3K, Akt, GLUT4).

7 7 Experimento 2: Os 4 filhotes remanescentes das ninhadas após o sacrifício aos 21 dias, serão mantidos no biotério até a idade adulta, com livre oferta de água e ração, e aos 150 dias de idade subdivididos em 2 grupos: um grupo que receberá veículo (carboximetilcelulose, composto inerte) e outro que receberá a substância resveratrol na dose de 30mg/Kg de peso corporal. Esta substância vem sendo testada quando a diversos efeitos benéficos para a saúde como, por exemplo, controle de hiperlipidemia e estresse oxidativo. O tratamento será feito por gavagem durante 30 dias (150 a 180 dias de vida), sem utilização de anestesia. Metade dos animais será submetida à cirurgia estereotáxica para implantação de uma cânula no ventrículo lateral para avaliação de respostas agudas à administração de leptina e resveratrol. Antes do sacrifício, coletaremos uma gota de sangue da ponta da cauda para aferição de glicemia com medidor automático. Todos os animais serão sacrificados por decaptação, utilizando uma guilhotina apropriada para ratos. Avaliaremos a composição corporal (conteúdo de proteína e gordura corporais) por métodos gravitacionais, análise de imagens in vivo e análise bioquímica. O sangue será coletado para análises hormonais e perfil lipídico. Tecidos como fígado, tecido adiposo, coração, músculo, tireóide, adrenais, hipotálamo, hipófise serão coletados para posterior análise bioquímica e para avaliação da expressão de conteúdo e mrna de proteínas envolvidas com a regulação do metabolismo como as proteínas da cascata de sinalização da leptina e da insulina (OBR, JAK2, STAT3, SOCS3, IR, IRS-1, PI3K, Akt, GLUT4). CONTENÇÃO DOS ANIMAIS Os animais serão contidos por curtos períodos para a injeção subcutânea ou intraperitoneal de hormônios ou anestésicos. COLETA DE SANGUE Toda coleta de sangue será feita no momento do sacrifício, por punção cardíaca sob anestesia ou por coleta do tronco após decaptação. CIRURGIA E ANESTÉSICO Ratos com 5 meses de idade serão anestesiadas com uma combinação de cloridrato de ketamina (Dopalen ) e cloridrato de xilasina (Amasedan ) (50 e 5 mg por kg de peso, respectivamente, diluídos em solução salina 0,9% v/v) pela via intra-peritoneal (i.p.). Após o estabelecimento de um bom plano de anestésico, verificados pela ausência de reflexos motores e protetores, serão submetidas à implantação de cânula no ventrículo lateral e animais controle serão submetidos ao estresse cirúrgico. VII. DECLARAÇAO DO PESQUISADOR: Estou familiarizado com os "Princípios Básicos para a Pesquisa Envolvendo o Uso de Animais"aprovados pelo Conselho Departamental do IBCCFO em 09/09/92. Concordo em aceitar essas normas na condução dos estudos descritos anteriormente.

8 Nesse estudo, eu considerei a possibilidade de utilizar métodos alternativos aos modelos animais e concluí que eles não estão disponíveis ou são inadequados por razões científicas. Afirmo que esse estudo não é desnecessariamente duplicativo e tem mérito científico e a equipe que participa desse projeto foi treinada e é competente para executar os procedimentos descritos nesse protocolo. Nome Assinatura Data VII. PARECER:

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