Aplicações das técnicas moleculares

Transcrição

1 Aplicações das técnicas moleculares

2 Genética direta e reversa A abordagem tradicional para o estudo da função gênica começa com o isolamento de organismos mutantes. Por ex., busca de genes que afetam a função cardíaca nos mamíferos. Uma primeira etapa seria encontrar indivíduos, talvez camundongos, que tenham defeitos hereditários na função cardíaca.

3 Genética direta e reversa As mutações responsáveis pelos problemas cardíacos nos camundongos poderiam ser mapeadas e os genes envolvidos poderiam ser isolados e sequenciados. As proteínas produzidas pelos genes poderiam ser previstas a partir das sequências de genes e isoladas. A bioquímica das proteínas poderia ser estudada e seu papel na função cardíaca compreendido. Esta abordagem é chamada de genética direta.

4 Genética direta e reversa Uma abordagem alternativa é começar com um genótipo, uma sequência de DNA, e continuar com o fenótipo ao alterar a sequência ou inibir sua expressão. Pode começar com um gene de função desconhecida, induzir mutações nele e então observar que efeito estas mutações têm no fenótipo do organismo. Esta abordagem é chamada de genética reversa. Atualmente, ambas as abordagens de genética direta e reversa são muito usadas para análises de função dos genes. (PIERCE )

5 Criação de mutações aleatórias Mutações que surgiam naturalmente, são raras e podem ser detectadas apenas se forem examinados muitos organismos. A descoberta de agentes mutagênicos forneceu meios para aumentar o número de mutações nas populações experimentais. Um dos primeiros exemplos foi o uso de raios X por Hermann Muller em 1927 para induzir mutações ligadas ao X na Drosophila melanogaster. Ganhou o Nobel de Fisiologia em 1946

6 Criação de mutações aleatórias Atualmente, usam-se radiação, mutágenos químicos e elementos de transposição para criar mutações para análise genética. Para determinar todos os genes que poderiam afetar um fenótipo, é desejável criar mutações em tantos genes quanto possível, ou seja, saturar o genoma com mutações. (PIERCE)

7 Exemplo Para induzir mutações no fungo Aspergillus nidulans, esporos são submetidos à ação da luz ultravioleta e analisados para a detecção de mutantes morfológicos e mutantes revertentes para marcas auxotróficas. Mutante auxotrófico é aquele incapaz de crescer em Meio de Cultura contendo apenas uma fonte de carboidratos e sais minerais, portanto, sem adição de vitaminas, aminoácidos ou ácidos nucleicos.

8 Mutagênese sítio dirigida A genética reversa depende da capacidade de criar mutações, não aleatoriamente, mas em sequências de DNA específicas e depois estudar os efeitos destas mutações no organismo. As mutações são induzidas em locais específicos por meio de um processo chamado de mutagênese direcionada pelo sítio. Em bactérias, é possível cortar uma sequência curta de nucleotídios com enzimas de restrição e substituir com um oligonucleotídio curto sintético que tenha a sequência mutante desejada. O sucesso deste método depende da disponibilidade dos sítios de restrição flanqueadores da sequência a ser alterada.

9 Mutagênese sítio dirigida Pode ser usada a mutagênese direcionada por oligonucleotídio. Neste método, é produzido um oligonucleotídio de fita única diferente da sequência-alvo em uma ou algumas bases. Como eles diferem em apenas algumas bases, o DNA-alvo e o oligonucleotídio vão parear. Ao parear com o DNA-alvo, o oligonucleotídio pode agir como primer ao iniciar a síntese de DNA, que produz uma molécula de fita dupla com um pareamento errado na região do primer. (PIERCE)

10 Exemplo: Mutagênese sítio dirigida Objetivo: analisar o efeito de mutações em parâmetros da cinética enzimática.

11 Foi utilizado o vetor pgs, que contém a região codificadora do gene BCHE. As trocas de nucleotídeos detectadas nas variantes K12R, G75R, V294M, G333C e R470W foram introduzidas no vetor através de mutagênese sítio-dirigida. Para isso foi utilizada a metodologia de PCR em duas etapas.

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13 A primeira PCR contou com um iniciador mutagênico, contendo a substituição em questão, e um outro iniciador que hibridava no início ou no final do gene BCHE, dependendo da localização da mutação. Essa PCR visava à produção de um fragmento, cujo tamanho variou de 200 a 412 pb entre as diferentes variantes, e que serviu como um mega iniciador para a segunda PCR.

14 1) vetor com a mutação 2) vetor sem a mutação

15 Animais transgênicos Outra forma que pode ser usada para analisar a função do gene é adicionar sequências de DNA de interesse ao genoma de um organismo que normalmente não tem tais sequências e então observar o efeito que a sequência introduzida tem sobre o fenótipo do organismo.

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17 Aplicações: Doença de Alzheimer Fonte: Sasaguri et al. (2017)

18 Aplicações: Doença de Alzheimer Fonte: Sasaguri et al. (2017)

19 Aplicações: Doença de Alzheimer Fonte: Sasaguri et al. (2017)

20 Camundongos knockout Uma variante útil da abordagem transgênica é produzir camundongos nos quais um gene normal não sofreu apenas uma mutação, mas foi totalmente desativado. Estes animais, chamados de camundongos knockout, são particularmente úteis para determinar a função de um gene: um genótipo do camundongo knockout fornece uma boa indicação da função do gene ausente (PIERCE)

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22 A superexpressão de BChE leva a baixos níveis de grelina na corrente sanguínea e reduz a agressão e o estresse social em camundongos

23 Brimijoin et al (2016)

24 Referências PIERCE, Benjamin A.. Genética - Um Enfoque Conceitual, 5ª edição. Guanabara Koogan, 04/2016. VitalBook file. Souza, Mikami, Maegawa, & Chautard-Freire-Maia. (2005). Four new mutations in the BCHE gene of human butyrylcholinesterase in a Brazilian blood donor sample. Molecular Genetics and Metabolism, 84(4), Mikami, L. R., Wieseler, S. L., Souza, R. M., Schopfer, L. A., Lockridge, O., & Chautard-Freire-Maia, E. (2007). Expression of three naturally occurring genetic variants (G75R, E90D, I99M) of the BCHE gene of human butyrylcholinesterase. Pharmacogenetics and Genomics, 17(9), Sasaguri, H., Nilsson, P., Hashimoto, S., Nagata, K., Saito, T., De Strooper, B.,... Saido, T. (2017). APP mouse models for Alzheimer's disease preclinical studies. EMBO Journal, 36(17), Duysen, Li, Darvesh, & Lockridge. (2007). Sensitivity of butyrylcholinesterase knockout mice to ( )- huperzine A and donepezil suggests humans with butyrylcholinesterase deficiency may not tolerate these Alzheimer's disease drugs and indicates butyrylcholinesterase function in neurotransmission. Toxicology, 233(1), Li, B., Duysen, E., Carlson, M., & Lockridge, O. (2008). The butyrylcholinesterase knockout mouse as a model for human butyrylcholinesterase deficiency. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 324(3), Brimijoin, Chen, Pang, Geng, & Gao. (2016). Physiological roles for butyrylcholinesterase: A BChEghrelin axis. Chemico-Biological Interactions,259(Pt B),