EFEITOS DA FUMONISINA B1 E DO MANANOLIGOSSACARÍDEO (MOS) SOBRE A INERVAÇÃO MIOENTÉRICA DO ÍLEO DE RATOS

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1 EFEITOS DA FUMONISINA B1 E DO MANANOLIGOSSACARÍDEO (MOS) SOBRE A INERVAÇÃO MIOENTÉRICA DO ÍLEO DE RATOS Raiane dos Santos Guidi (PIBIC/Fundação Araucária), Fernando Carlos de Sousa, Christiano Rodrigues Schamber, Maria Raquel Marçal Natali, João Paulo Ferreira Schoffen (Orientador), e- mail: raianeguidi_13@hotmail.com Universidade Estadual do Norte do Paraná/Campus Luiz Meneghel Universidade Estadual de Maringá/Departamento de Ciências Morfológicas Área: Morfologia; sub-área: Histologia Palavras-chave: micotoxina, prebiótico, neurônios mioentéricos. Resumo Fumonisinas são metabólitos secundários produzidos por espécies de fungos pertencentes à Fusarium que ingeridos levam a inibição da biossíntese dos esfingolipídios, promovendo efeitos deletérios ao intestino, fígado e sistema nervoso. O mananoligossacarídeo (MOS) pode exibir efeitos prebióticos, com ação adsorvente de micotoxinas. Este trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos da micotoxina fumonisina B1 (FB1) e do prebiótico MOS sobre a população total de neurônios do plexo mioentérico do íleo de ratos. Ratos Wistar machos com 21 dias de vida foram alimentados durante 42 dias com seis dietas experimentais variando quanto à ausência ou presença de FB1 (0, 1 e 4 mg/kg ração) combinadas com a ausência ou presença de MOS (0 e 0,2%). Ao final do período experimental, os animais foram mortos e o intestino delgado coletado e fixado. Amostras do íleo foram destinadas à obtenção de preparados de membrana e coloração pelo método de Giemsa para estudo quantitativo e morfométrico neuronal. A concentração de 1 mg/kg de fumonisina demonstrou neurotoxidade, pois provocou perda de neurônios mioentéricos e hipertrofia do corpo celular nos neurônios remanescentes. Entretanto, a concentração de 4 mg/kg não alterou o número e nem o perfil das células nervosas. O prebiótico MOS a 0,2% se mostrou ineficiente na adsorção das fumonisinas, uma vez que este não evitou ou minimizou as alterações sofridas pelos neurônios mioentéricos. Conclui-se que a inervação mioentérica do íleo é sensível aos efeitos das fumonisinas na dose de 1mg/kg, e que o MOS a 0,2% não impede a absorção intestinal destas micotoxinas. Introdução As fumonisinas são micotoxinas produzidas principalmente por Fusarium verticillioides e Fusarium proliferatum, fungos que contaminam colheitas de milho em diversos lugares do mundo (VOSS et al., 2007). A contaminação de colheitas de grãos com micotoxinas tem atraído grande interesse econômico e científico, pois estas colheitas formam a base da alimentação de muitas populações humanas e são amplamente utilizadas na alimentação de animais de produção. As fumonisinas foram caracterizadas em 1988 com a descrição das fumonisinas B 1 (FB1) e B 2 (FB2). Desde então, outros 26 análogos já foram descritos. FB1 e FB2 são os análogos mais comumente encontrados em grãos e alimentos naturalmente contaminados e por isso são as fumonisinas mais estudadas (RHEEDER et al., 2002).

2 Os estudos já realizados demonstraram que as fumonisinas são tóxicas para todas as espécies animais já testadas, apresentando efeitos hepatotóxicos, nefrotóxicos, cancerígenos, teratogênicos, imunotóxicos e neurotóxicos em diferentes intensidades de acordo com a dose, tempo de exposição e espécie estudada (VOSS et al., 2007; STOCKMANN-JUVALA; SAVOLAINEN, 2008). Os mecanismos pelos quais estas toxinas exercem seus efeitos não estão totalmente esclarecidos, porém sabe-se que as fumonisinas levam a inibição da biossíntese dos esfingolipídios componentes das membranas celulares, podendo alterar a concentração e a proporção entre a esfiganina e a esfingosina, diminuindo a biossíntese de esfingosina e acumulando esfinganina (CARRATÙ et al., 2003). O prebiótico mananoligossacarídeo (MOS), é constituído por glucomanoproteínas derivadas da parede celular de leveduras, sendo responsável em aumentar o estado funcional de macrófagos e neutrófilos e por consequência a resistência para infecções por bactérias gram-negativas, apresenta atividade antioxidante, antitumoral, antimutagênica, tendo como função adsorver as micotoxinas, inativando os efeitos deletérios da fumonisina ao organismo (SCHAMBER et al., 2013). Diversos trabalhos já foram realizados sobre os efeitos de fumonisinas sobre a sobrevivência de neurônios, entretanto, em geral, estes trabalhos têm usado abordagens in vitro ou outras vias não naturais de inoculação e doses muito altas, não encontradas em situações reais. Além disso, as pesquisas trazem foco para o sistema nervoso central, poucos trabalhos investigam os efeitos das fumonisinas sobre o sistema nervoso entérico (SOUSA et al., 2014), que representa o principal mecanismo neural de controle das funções do trato gastrointestinal. Pesquisas que investiguem os possíveis efeitos benéficos do MOS sobre o comportamento da inervação intrínseca intestinal frente a uma dieta contendo fumonisinas, ainda não são detectados na literatura. Este trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos da micotoxina fumonisina B1 (FB1) e do prebiótico MOS sobre aspectos morfoquantitativos da população total de neurônios do plexo mioentérico do íleo de ratos em crescimento. Material e métodos Animais e tratamento Foram utilizados 30 ratos Wistar (Rattus novergicus) machos com 21 dias de idade. Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno, com iluminação de claro e escuro de 12 horas e temperatura de 22 ± 2 ºC, durante um período de 42 dias. Três dietas isocalóricas (aproximadamente 4100 kcal de energia bruta EB/kg de dieta) e isoprotéicas (22% de proteína bruta) foram elaboradas, variando apenas quanto à ausência ou presença de FB1 (0, 1 e 4 mg/kg ração) combinadas com a ausência ou presença de MOS (0 e 0,2%), como componente prebiótico. Durante o período experimental os animais receberam ração e água ad libitum. Para o preparo da dieta base (Tabela 1) o milho, farelo de trigo e o farelo de soja foram moídos, sendo misturados manualmente aos demais ingredientes. Logo após o montante total da dieta base foi dividido em três partes onde duas delas recebeu a incorporação do meio de cultivo do fungo Fusarium moniliforme fornecido pelo Laboratório de Análises Micotoxicológicas da Universidade Federal de Santa Maria. As três dietas foram novamente repartidas em porções idênticas recebendo ou não a inclusão de MOS (Safmannan - Lesafre Feed Additives) resultando desta forma em seis grupos denominados de F0M0 (controle), F1M0 (com fumonisina 1mg/kg sem MOS), F4M0 (com fumonisina 4mg/kg sem MOS), F0M0,2 (controle e MOS), F1M0,2 (com fumonisina 1mg/kg e MOS) e F4M0,2 (com fumonisina 4mg/kg e MOS). Análises qualitativas e quantitativas de fumonisinas nas dietas experimentais foram realizadas por cromatografia líquida de alta performance no Laboratório de Análises Toxicológicas da Universidade Estadual de Maringá (UEM). Ao final do período experimental os ratos foram anestesiados intraperitonealmente com Tiopental sódico (Thionembutal ) na concentração de 40mg/kg do peso corporal e, após

3 laparotomia, o íleo foi coletado e fixado. Os procedimentos deste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UEM. Tabela 1 - Composição da dieta base fornecidas aos ratos durante o período experimental Ingrediente (%) Milho 33,63 Farelo de soja 33,10 Farelo de trigo 27,20 Óleo de soja 2,30 Calcário calcítico 2,07 Fosfato bicálcio 0,73 Sal comum (iodado) 0,50 Premix vitamínico 1 0,10 Premix mineral 2 0,35 BHT 3 0,02 1 Suplemento vitamínico, composição por kg: ác. Fólico 200 mg; ác. nicotínico mg; biotina 20 mg; pantotenato de cálcio mg; piridoxina HCl 700 mg; riboflavina 600 mg; tiamina HCl 600 mg; vitamina a UI; vitamina B mg; vitamina D UI; vitamina e UI; vitamina K1 75 mg. 2 Suplemento mineral, composição por kg: boro 14,26 mg; cálcio 142,94 g; cloro 44,9 g; cobre 72,41 mg; cromo 28,65 mg; enxofre 8,6 g; ferro mg; flúor 28,72 mg; fósforo 56,9 g; iodo 5,95 mg; lítio 2,85 mg; magnésio 14,48 g; manganês 300 mg; molibdênio 4,32 mg; níquel 14,31 mg; potássio 102,86 g; selênio 4,28 mg; silício 143,26 mg; sódio 29,38 mg; vanádio 2,87 mg; zinco 860 mg. 3 Botuil Hidroxi Tolueno. Análise morfoquantitativa neuronal Preparados totais da túnica muscular do íleo foram obtidos através da remoção da túnica mucosa, submucosa e da túnica muscular circular, por meio de dissecção sob estereomicroscópio. Em seguida, foram corados por 24 horas pelo método de Giemsa em tampão fosfato de Sorensen 0,1M (ph 6,9), desidratados em etanol, diafanizados em xilol e montados entre lâmina e lamínula. Para a quantificação da população neuronal mioentérica foram realizadas contagens dos corpos celulares neuronais em 50 gânglios por animal/preparado de membrana, em imagens microscópicas capturadas nas regiões intermediária e antimesentérica da circunferência ileal (25 imagens/região), com auxílio de uma câmera digital de alta resolução acoplada ao microscópio de luz, utilizando objetiva de 40X. Para a análise morfométrica neuronal, a partir das imagens capturadas, foi mensurada a área ( m 2 ) de corpos celulares de 150 neurônios (75 neurônios/região) do íleo de cada animal, perfazendo um total de 750 células por grupo. As análises morfoquantitativas foram realizadas com auxílio do software de análise de imagem Image-Pro Plus 4.5. O software GraphPad Prism 5.0 foi utilizado para análise estatística, sendo os dados numéricos submetidos à Análise de Variância (one-way ANOVA) e pós-teste de Tukey, com nível de significância de 5% e resultados expressos como média erro padrão. Resultados e Discussão A concentração de 1mg/kg de fumonisina ocasionou redução significativa (20,66%) no número de células nervosas (Fig.1a) e hipertrofia (29,68%) dos corpos celulares dos neurônios remanescentes nos gânglios mioentéricos do íleo (Fig.1b), quando comparado ao grupo controle. No jejuno de ratos Wistar o consumo de dietas contendo fumonisinas nas doses de até 3 mg/kg provoca atrofia do corpo celular neuronal, mas não causa redução na população total de neurônios mioentéricos (SOUSA et al., 2014). O fato de encontrarmos redução na quantidade de neurônios no íleo de ratos alimentados com dieta contendo 1mg/kg de fumonisinas demonstra que o comportamento quantitativo da inervação mioentérica apresenta diferentes respostas conforme o segmento intestinal investigado (SCHOFFEN et al., 2014). A hipertrofia do corpo celular

4 Neurônios/gânglio Área (µm 2 ) observada na dose de 1mg/kg de fumonisina indica que, com a perda neuronal, os neurônios remanescentes tentam manter suas atividades funcionais (PHILLIPS et al., 2003). a-número * * b-corpo celular * * Figura 1 Número médio de neurônios mioentéricos por gânglio (a) e média das áreas dos corpos celulares neuronais (b) no íleo de ratos alimentados com dieta sem adição de fumonisinas (F0M0), com adição de 1 mg/kg (F1M0), com adição de 4 mg/kg (F4M0), sem adição de fumonisinas e com 0,2% de MOS (F0M0,2), com adição de 1 mg/kg e 0,2% de MOS (F1M0,2) e com adição de 4 mg/kg e 0,2% de MOS (F4M0,2). Média erro padrão (n=5). (*) p<0,05 quando comparado a F0M0 e ( ) p<0,05 quando comparado a F0M0,2. Contrariamente aos resultados obtidos com a dieta de 1mg/kg, a ingestão de fumonisina na concentração de 4mg/kg não alterou o número e o perfil dos corpos celulares dos neurônios nos gânglios mioentéricos do íleo, quando comparamos F4M0 a F0M0 (Fig. 1a e 1b). Ressalte-se que estudos sobre o comportamento da população total de neurônios mioentéricos frente à dieta contaminada com 4mg/kg de fumonisinas não são encontrados atualmente na literatura científica. Uma hipótese que poderia justificar a manutenção da quantidade e tamanho neuronal com a dose de 4mg/kg, é que a maior quantidade de fumonisina possa ter aumentado a motilidade intestinal, diminuindo o tempo de contato da micotoxina com a mucosa, assim reduzindo sua absorção e, consequentemente a neurotoxidade. Outra hipótese é que as micotoxinas absovidas no epitélio intestinal entrariam na circulação porta, passando pelo fígado, sendo biotransformadas e secretadas no intestino, donde seriam excretadas pelas fezes, reduzindo a biodisponibilidade e a ação da fumonisina no organismo. Uma última consideração que pode ser apontada, é que a fumonisina nesta dosagem deixaria de atuar sobre os neurônios mioentéricos, passando a agir em outras células ou órgãos corporais, como o rim, que retém a maior parte das fumonisinas absorvidas (WILLIAMS et al., 2003). Com relação ao prebiótico MOS, a concentração de 0,2% deste mananoligossacarídeo não apresentou o efeito adsorvente esperado para o controle da ação da fumonisina sobre os neurônios do plexo mioentérico ileal. Fato que pode ser comprovado ao compararmos os grupos com ausência e presença de fumonisinas (F0M0, F1M0 e F4M0) aos seus respectivos grupos com ausência e presença de fumonisina suplementados com MOS (F0M0,2, F1M0,2 e F4M0,2), bem como ao relacionarmos F1M0,2 X F0M0 (Fig. 1a e 1b). Estudos com concentrações maiores deste prebiótico e sua relação com o sistema nervoso entérico na presença de dietas contendo fumonisinas devem ser incrementados. Conclusões Revelamos que a população total de neurônios mioentéricos do íleo é sensível aos efeitos das fumonisinas, apresentando redução numérica significativa e alterações celulares plásticas em

5 ratos alimentados com dieta contendo dose de apenas 1mg/kg, e que a suplementação com MOS a 0,2% não foi capaz de evitar ou minimizar estas alterações. Além disso, fica evidente a necessidade de se compreender o mecanismo de absorção intestinal e distribuição das fumonisinas no organismo, visto que maiores concentrações dessa micotoxina neste estudo não causou neurotoxidade, como constatado em menores concentrações. Agradecimentos À Fundação Araucária, UEM e UENP. Referências CARRATÙ, M.R.; CASSANO, T.; COLUCCIA, A.; BORRACCI, P; CUOMO, V. Antinutritional effects of fumonisin B1 and pathophysiological consequences. Toxicology Letters, v , p , PHILLIPS, R.J.; KIEFFER, E.J.; POWLEY, T.L. Aging of the myenteric plexus: neuronal loss is specific to cholinergic neurons. Autonomic Neuroscience, v. 106, n. 2, p , RHEEDER, J.P.; MARASAS, W.F.O.; VISMER, H.F. Production of fumonisin analogs by Fusarium species. Applied and Environmental Microbiology, v. 68, n.5, p , SCHAMBER, C.R. A toxicidade das fumonisinas FB1+FB2 e efeitos prébiotico e adsorvente do mananoligossacarideo (MOS) expresso em características nutricionais, sanguíneas e morfofisiológicas intestinais, diferem entre espécies: análise em ratos Wistar e tilápias do Nilo f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Estadual de Maringá, Maringá, SCHOFFEN, J.P.F.; SANTI RAMPAZZO, A.P.; CIRILO, C.P.; ZAPATER, M.C.U.; VICENTINI, F.A.; COMAR, J.F.; BRACHT, A.; NATALI, M.R.M. Food restriction enhances oxidative status in aging rats with neuroprotective effects on myenteric neuron populations in the proximal colon. Experimental Gerontology, v. 51, p , SOUSA, F.C.; SCHAMBER, C.R.; AMORIN, S.S.S.; NATALI, M.R.M. Effect of fumonisincontaining diet on the myenteric plexus of the jejunum in rats. Autonomic Neuroscience, v. 185, p , STOCKMANN-JUVALA, H.; SAVOLAINEN, K. A review of the toxic effects and mechanisms of action of fumonisin B 1. Human & Experimental Toxicology, v. 27, p , VOSS, K.A.; SMITH, G.W.; HASCHEK, W.M. Fumonisins: toxicokinetics, mechanism of action and toxicity. Animal Feed Science and Technology, v. 137, p , WILLIAMS, L.D.; BACON, C.W.; MEREDITH, F.I.; FRANZLUEBBERS, A.J.; WYATT, R.D.; SMITH, M.A.; RILEY, R.T. Leaching and biding of fumonisins in soil microcosms. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 51, n. 3, p , 2003.