EFEITOS DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR SOBRE OS NEURÔNIOS MIOENTÉRICOS E A PAREDE DO JEJUNO E COLO DISTAL DE RATOS WISTAR VELHOS

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1 EFEITOS DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR SOBRE OS NEURÔNIOS MIOENTÉRICOS E A PAREDE DO JEJUNO E COLO DISTAL DE RATOS WISTAR VELHOS Indyanara Inacio Barreto (PIBIC/UENP), Carolina Guarini Marcelino, Paula Cristian Cardoso, Ana Paula de Santi Rampazzo, Carla Possani Cirilo, Maria Raquel Marçal Natali, João Paulo Ferreira Schoffen (Orientador), indyanara_dy@hotmail.com. Universidade Estadual do Norte do Paraná/Campus Luiz Meneghel Universidade Estadual de Maringá/ Departamento de Ciências Morfológicas Área: Morfologia; sub-área: Histologia Palavras-chave: dieta, senescência, sistema nervoso entérico. Resumo O envelhecimento promove mudanças morfofuncionais no trato gastrointestinal, associadas com a neurodegeneração mioentérica. A restrição alimentar (RA) visa diminuir estes efeitos, porém, de forma ainda pouco compreendida, especialmente para os órgãos do sistema digestório. Este trabalho teve por objetivo avaliar a população total de neurônios mioentéricos e a parede do jejuno e colo distal de ratos velhos submetidos à RA. Ratos Wistar adultos foram divididos em dois grupos: controle alimentado ad libitum; e experimental submetido à RA a partir dos 7 meses de vida, recebendo metade da média da ingestão de ração diária dos ratos controles por 11 meses. Aos 18 meses, os animais foram mortos sendo o jejuno e colo distal destinados à obtenção de preparados de membrana e coloração pelo método de Giemsa para estudo morfoquantitativo neuronal, e à processamento histológico para análise morfométrica da túnica mucosa, criptas, muscular da mucosa, túnica muscular externa e parede total. A dieta restritiva não influenciou na densidade dos neurônios nos gânglios em nenhum dos segmentos intestinais. Quanto à área do corpo celular, não houve alteração significativa no colo distal, mas no jejuno ocorreu redução na área do perfil celular, um indicativo de neuroproteção contra a hipertrofia neuronal associada à idade. Sobre a parede intestinal, a RA promoveu alterações morfométricas em ambos os segmentos, com atrofia na túnica mucosa, profundidade das criptas e parede total do jejuno, e redução na muscular da mucosa e muscular externa do colo distal, caracterizando uma adaptação dos órgãos à dieta para melhorar suas funções. Introdução O envelhecimento é caracterizado pela lesão progressiva das estruturas e funções dos sistemas orgânicos, podendo ocorrer por interação entre fatores genéticos, que em conjunto contribuem para aumento na produção de espécies reativas de oxigênio além de senescência e morte celular, que provocam alterações funcionais e estruturais em órgãos, aumentando sua vulnerabilidade a doenças (PEREIRA et al., 2014; SCHOFFEN et al., 2014). No trato gastrointestinal, o controle neural é realizado pelo sistema nervoso entérico, responsável pela coordenação do processo digestivo, incluindo absorção de nutrientes, secreção e motilidade. Estudos indicam redução no número de neurônios mioentéricos com o envelhecimento, que provocam alterações na inervação intrínseca e músculo liso, levando a incidência de disfunções,

2 como constipação, desordens da motilidade, aceleração do trânsito intestinal e diminuição da função de absorção (PORTO et al., 2012; SCHOFFEN et al., 2014). A dieta, entre os fatores incidentes no envelhecimento, possui um papel crucial, pois ela determina as condições adequadas para a longevidade, sendo a restrição alimentar (RA) uma das principais intervenções nutricionais recomendadas. Seu principal benefício é a redução do estresse oxidativo a partir de diminuição na geração de radicais livres, aumento na velocidade da neutralização das espécies reativas de oxigênio, e aumento da regulação nos processos de degradação e reparo, além de reduzir a neurodegeneração mioentérica, estimulando a plasticidade e a capacidade de auto-reparação das células nervosas (SPEAKMAN; MITCHELL, 2011; PORTO et al., 2012). Todavia, pouco se sabe sobre as repercussões que tal comportamento alimentar pode ter sobre a biologia tecidual de animais envelhecidos, sobretudo órgãos do sistema digestório. O objetivo deste estudo foi analisar os efeitos da restrição alimentar sobre a população total de neurônios do plexo mioentérico e a parede do jejuno e colo distal de ratos Wistar velhos. Material e métodos Animais e tratamento Foram utilizados 10 ratos Wistar machos (Rattus novergicus) com 18 meses de idade, mantidos em caixas de polipropileno com iluminação de claro e escuro de 12 horas e temperatura de 22 ± 2 ºC, distribuídos em dois grupos: controle alimentados ad libitum (C); e experimental com RA de 50% dos 7 aos 18 meses (RA). Aos 18 meses os ratos foram anestesiados intraperitonealmente com Tiopental sódico (Thionembutal ) na concentração de 40mg/kg do peso corporal e, após laparotomia, o jejuno e o colo distal foram coletados e destinados à técnica de Giemsa (BARBOSA, 1978) e a processamento histológico, para estudo da população total dos neurônios mioentéricos e análise morfométrica dos estratos da parede intestinal, respectivamente. Os procedimentos deste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UEM. Análise morfoquantitativa neuronal As amostras coletadas foram lavadas em solução salina e armazenadas em fixador de Giemsa. Preparados totais da túnica muscular foram obtidos através da remoção das túnicas mucosa, submucosa e túnica muscular circular do jejuno e colo distal, por meio de dissecção sob estereomicroscópio, e posteriormente corados por 24 horas pelo método de Giemsa em tampão fosfato de Sorensen 0,1N (ph 6.9), desidratados em etanol, diafanizados em xilol e montados entre lâmina e lamínula. Através de imagens microscópicas capturadas em objetiva de 40X, nas regiões intermediária e antimesentérica/antimesocólica, foram realizadas contagens das células nervosas em 50 gânglios mioentéricos aleatórios (25 gânglios/região) e mensuração da área (µm 2 ) de corpos celulares de 100 neurônios/animal (50 neurônios/região) do jejuno e colo distal, perfazendo um total de 500 células por grupo. A análise quantitativa e morfométrica foram realizadas com o software Image-Pro Plus Media Cibernetics. Análise morfométrica da parede intestinal Amostras do jejuno e colo distal foram abertas na borda mesentérica/mesocólica, lavadas com solução salina, fixados em Bouin, desidratadas em etanol, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina para obtenção de cortes histológicos semi-seriados com 6 µm de espessura em micrótomo, sendo corados pelo método de Hematoxilina-Eosina (H.E.).

3 Neurônios/gânglio Área (µm 2 ) A partir de imagens microscópicas capturadas em objetiva de 10X foram mensuradas a túnica mucosa, a profundidade das criptas, camada muscular da mucosa, túnica muscular externa e parede total do jejuno e colo distal a partir de 10 pontos aleatórios/corte, perfazendo 100 mensurações/animal através do software Image Pro-Plus 4.5 Media Cybernetics, Inc. O software GraphPad Prism 5.0 foi utilizado para análise estatística de todos os dados obtidos, aplicando-se o teste t, com nível de significância de 5%, sendo os resultados expressos como média ± erro padrão. Resultados e Discussão A dieta restritiva não influenciou na densidade dos neurônios nos gânglios mioentéricos em nenhum dos segmentos intestinais investigados (Fig. 1a). Perda neuronal associada à idade é resultado frequente e tem sido observada em segmentos dos intestinos delgado e grosso de ratos velhos de diferentes linhagens (PHILLIPS et al., 2003; SCHOFFEN et al., 2014). A redução no consumo de alimentos influencia no padrão de envelhecimento da inervação gastrointestinal, podendo aumentar (SCHOFFEN et al., 2014) ou diminuir (CIRILO et al., 2013) a sobrevivência dos neurônios mioentéricos no colo proximal e duodeno de ratos Wistar, respectivamente. O fato de encontrarmos manutenção na quantidade de neurônios no jejuno e no colo distal de ratos velhos submetidos a RA, demonstra que a inervação mioentérica responde de forma diferente a este quadro nutricional imposto, de acordo com o segmento intestinal. Mudanças na área do perfil celular dos neurônios são relatadas em estudos envolvendo a RA e o envelhecimento (CIRILO et al., 2013; SCHOFFEN et al., 2014). Com a neurodegeneração mioentérica decorrente da idade, os neurônios remanescentes tendem a agir de forma compensatória à atividade neuronal, com aumento progressivo no perfil celular. Neste estudo não ocorreram mudanças significativas sobre a área do perfil celular de neurônios do colo distal, porém, no jejuno houve redução no tamanho do corpo celular dos animais submetidos à RA em 12,62% (Fig.1b), fato que evidencia neuroproteção contra a hipertrofia neuronal, comum no envelhecimento. O efeito neuroprotetor promovido pela RA aumenta a plasticidade e longevidade dos neurônios, e reduz os níveis de radicais livres (SCHOFFEN et al., 2014). a. Número 40 b. Corpo Celular * Colo distal Colo distal Figura 1 - Número médio de neurônios mioentéricos por gânglio (a) e média da área dos corpos celulares neuronais (b) no jejuno e colo distal de ratos normoalimentados (C) e com restrição alimentar (RA). Média ± erro padrão (n=5). (*) p<0,05 quando comparado ao grupo controle. Com relação à parede intestinal, constataram-se alterações morfométricas nos estratos do jejuno e colo distal decorrentes da RA imposta por 11 meses, em comparação ao grupo controle. O jejuno sofreu redução na túnica mucosa (15,54%), profundidade das criptas (30,26%) e na parede

4 total (18,02%), não ocorrendo alteração significativa na muscular da mucosa ou na muscular externa. Resultado semelhante foi observado no íleo dos mesmos animais por Belém et al. (2015). No colo distal houve atrofia da muscular da mucosa (35,27%) e da muscular externa (19,09%), não havendo alterações relevantes na túnica mucosa, profundidade das criptas ou na parede total (Tabela 1). Tabela 1- Espessura da túnica mucosa, profundidade das criptas, camada muscular da mucosa, espessura da túnica muscular externa e da parede total do jejuno e colo distal de ratos velhos do grupo controle (C) e grupo com restrição alimentar (RA). Média ± erro padrão (n=5). Colo Distal Morfometria (µm) C RA C RA Túnica mucosa 709,00±19,18 598,40±31,37* 307,10±9,98 300,10±2,87 Profundidade das criptas 207,20±6,94 144,50±6,51* 270,30±9,88 250,70±1,67 Muscular da mucosa 13,34±0,33 13,05±0,55 34,91±0,74 22,61±1,00* Muscular externa 102,70±9,54 84,03±4,11 214,30±12,68 173,40±5,85* Parede total 844,80±21,43 692,60±25,81* 518,50±26,98 516,70±11,19 * p < 0,05 quando comparado ao grupo controle. A redução na espessura da túnica mucosa, profundidade das criptas e parede total do jejuno pode estar relacionado com o menor aporte de nutrientes disponíveis no lúmen intestinal decorrente da dieta, que atua como fator trófico (CIRILO et al., 2013). A atrofia destes parâmetros também pode ter ocorrido, para contribuir para a redução da superfície de contato com agentes infecciosos, tendo em vista que, durante o processo de envelhecimento, há redução na intensidade da resposta imune (BELÉM et al., 2015). Quanto ao colo distal, a redução da muscular da mucosa e muscular externa pode estar relacionada a menor disponibilidade de aminoácidos pela RA, afetando a síntese proteica, além do possível aumento da sua degradação para disponibilizar aminoácidos endógenos a outros tecidos (MARCELINO et al., 2014). Vale ressaltar que as diferentes respostas obtidas entre os segmentos intestinais devido à imposição da RA, pode também ser justificada a partir de sua função fisiológica no sistema digestório. O jejuno com a menor disponibilidade de nutrientes em seu lúmen reduz a túnica mucosa, de modo a manter sua funcionalidade (absorção). O colo distal por sua vez, é responsável pelo armazenamento e expulsão das fezes, envolvendo ativamente o músculo liso. Tendo em vista a redução na produção de dejetos pela menor quantidade de alimento ingerido, o órgão reduz seu estrato muscular, de modo a realizar satisfatoriamente sua função. Estas alterações contribuem para que não haja gasto energético maior que o necessário. Conclusões A RA imposta não altera a população total de neurônios mioentéricos no jejuno e colo distal de ratos velhos, mas demonstra efeito neuroprotetor sobre a área do corpo celular no segmento do intestino delgado, uma vez que reduz a hipertrofia neuronal, comum no envelhecimento. As diferenças morfométricas observadas nos estratos da parede intestinal indicam um esforço adaptativo dos órgãos analisados à redução alimentar. Contudo, constatou-se diferença regional nas respostas adaptativas do intestino, tanto na parede, quanto na inervação mioentérica, a fim de melhorar a capacidade absortiva e a atividade motora intestinal. Agradecimentos À UENP e UEM.

5 Referências BARBOSA, A.J.A. Técnica histológica para gânglios nervosos intramurais em preparados espessos. Rev. Bras. Pesq. Méd. Biol., v.11, p.95-97, BELÉM, M.O.; CIRILO, C.P.; SANTI-RAMPAZZO, A.P.; SCHOFFEN, J.P.F.; COMAR, J.F.; NATALI, M.R.M.; ARAÚJO, E.J.A. Intestinal morphology adjustments caused by dietary restriction improves the nutritional status during the aging process of rats. Exp. Gerontol., v.69, p.85-93, CIRILO, C.P.; SCHOFFEN, J.P.F.; SANTI-RAMPAZZO, A.P.; ZAPATER, M.C.V.U.; VICENTINI, F.A.; COMAR, J.F.; NATALI, M.R.M. Dietary restriction interferes with oxidative status and intrinsic intestinal innervation in aging rats. Nutrition, v.29, p , MARCELINO, C.G; SANTI-RAMPAZZO, A.P.; CIRILO, C.P.; ZAPATER, M.C.V.U.; VICENTINI, F.A.; NATALI, M.R.M.N.; SCHOFFEN, J.P.F. Análise morfométrica da parede do colo distal de ratos em processo de envelhecimento submetidos a restrição alimentar. In XXIII Encontro Anual de Iniciação Científica, Londrina, PEREIRA, J.N.B.; MARI, R.B.; STABILLE, S. R.; FARIA, H. G.; MORA, T.F.M.; FERREIRA, W. M. Benefits of caloric restriction in the myenteric neuronal plasticity in aging rats. An. Acad. Bras. Cienc., v.86, n.3, p , PHILLIPS, R.J.; KIEFFER, E.J.; POWLEY, T.L. Aging of the myenteric plexus: neuronal loss is specific to cholinergic neurons. Auton. Neurosci., v.106, p.69-83, PORTO, G. S.; PEREIRA, J.N.B.; TIBÚRCIO, V.G.; STABILLE, S.R.; FARIA, H.G.; GERMANO, R.M.; MARI, R.B. Effect of caloric restriction on myenteric neuroplasticity in the rat duodenum during aging. Auton. Neurosci., v.168, p.43-47, SCHOFFEN, J.P.F.; SANTI-RAMPAZZO, A.P.; CIRILO, C.P.; ZAPATER, M.C.U.; VICENTINI, F.A.; COMAR, J.F.; BRACHT, A.; NATALI, M.R.M. Food restriction enhances oxidative status in aging rats with neuroprotective effects on myenteric neuron populations in the proximal colon. Exp. Gerontol., v.51, p.54-64, SPEAKMAN, J.R.; MITCHELL, S.E. Caloric restriction. Mol. Aspects. Med., v.32, p , 2011.