Análise genética de comportamentos emocionais através de modelos animais

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1 Roteiro de Estudos G1 Tópicos Especiais em Processos Psicológicos Básicos Professor: Vitor de Castro Gomes Análise genética de comportamentos emocionais através de modelos animais Sumário O objetivo deste capítulo é introduzir o leitor no universo das abordagens experimentais disponíveis para o estudo genético da emocionalidade, sendo o foco no uso de modelos animais. Primeiramente, alguns conceitos preliminares serão discutidos, e então será apresentada uma visão geral dos principais métodos para medir e interpretar os chamados comportamentos emocionais. Finalmente nós apresentaremos estratégias clássicas e modernas para determinar as bases genéticas para a variância em traços relacionados a emocionalidade. Introdução Estudar os aspectos genéticos das emoções, tanto em humanos quanto em modelos animais, é uma tarefa particularmente desafiadora, devido três principais razões: emoções são difíceis de definir; emoções são difíceis de medir; e emoções são difíceis de serem analisadas geneticamente. Estes três tipos de dificuldades, assim como alguns dos métodos experimentais desenvolvidos para superar tais dificuldades, serão discutidos aqui. Sem a intenção de sermos exaustivos, nós iremos introduzir através deste capítulo alguns achados relacionados à procura de genes que influenciam as diversas respostas emocionais em roedores de laboratório. Definições A interpretação dos termos derivados da palavra emoção pode variar entre os autores, mas a maioria dos pesquisadores concorda que emoções são experiências subjetivas, que aparecem sob circunstâncias nãoordinárias, e que envolvem mudanças fisiológicas e comportamentais. No campo da Psicobiologia Experimental, o conceito de emocionalidade que tem sido extensivamente usado para animais de laboratório foi fornecido por Hall: O termo emocionalidade é definido como o estado de ser emocional. Este estado consiste de um grupo de reações orgânicas, experienciais e expressivas e denota um aumento geral ou uma condição excitada do animal. Emocionalidade pode ser entendida como um traço... O leitor é advertido a não interpretar emocionalidade como uma coisa ou faculdade. É meramente um conceito conveniente para descrever um complexo de fatores... O termo emoção é conveniente usado para designar a experiência que resulta de uma estimulação emocional. Pelo caráter intrinsecamente subjetivo, emoção e emocionalidade não podem ser diretamente medidas. Assim sendo, cientistas muitas vezes tentam inferir tais estados subjetivos através de suas manifestações comportamentais. Em termos operacionais, a taxa de defecação no teste do campo aberto (ver abaixo) tem sido há muito tempo usada como a medida de emocionalidade no rato. Devido ao fato da atividade locomotora neste teste covariar negativamente com a taxa de defecação, um animal com alta taxa de defecação e baixa locomoção no campo aberto é usualmente considerado altamente emocional. Todavia, vários resultados experimentais mostram que tal correlação entre estas duas variáveis não é sempre confirmada, e que indivíduos ou linhagens específicas podem apresentar, por exemplo, uma alta taxa de defecação juntamente com uma alta taxa locomotora. Além disso, estudos farmacológicos não fornecem suporte incondicional para o uso de medidas do campo aberto como índices satisfatórios de ansiedade, um traço psicológico ou estado que sejam relacionados com emocionalidade.

2 Por esta razão, apesar do termo emocionalidade, assim como estresse, possa ser conveniente para se descrever uma larga categoria de processos biológicos e psicológicos, diferenças inter-individuais ou inter-linhagens devem ser definidas de uma maneira mais analítica. Estas diferenças não são somente quantitativas (mais ou menos emocionais), mas suas expressões comportamentais e neuroendócrinas podem variar em natureza (diferenças qualitativas). Por exemplo, animais altamente emocionais podem demonstrar tanto respostas de congelamento ou comportamento de fuga, dependendo da circuitaria existente entre o estado central emocional e as saídas comportamentais. Por esta razão, existe um maior consenso entre os pesquisadores de que emocionalidade possui, de fato, diversas dimensões diferentes, ao invés de ser um constructo linear e unitário. Medidas Um bom número de paradigmas tem sido usado para se medir comportamentos emocionais em animais de laboratório. Basicamente, estes paradigmas experimentais consistem na exposição dos animais a estímulos aversivos, ao mesmo tempo em que se observa e se analisa seus comportamentos. O estímulo aversivo pode variar em natureza, podendo ser essencialmente físico (choques elétricos nas patas, privação de comida, submersão na água etc) ou então predominantemente psicológico (ambientes novos, áreas intensamente iluminadas, espaços abertos, exposição ao cheiro de predadores, altura, instabilidade social). Outra variável importante é a habilidade do animal de evitar ou escapar de estímulos aversivos. Muitas situações experimentais usam respostas incondicionadas a uma quantidade de novos ambientes, ou paradigmas de aprendizagem. Respostas de Estresse Incondicionadas, Exposição Forçada. O Teste do Campo Aberto é altamente usado em pesquisas comportamentais. Tal aparato consiste de uma larga arena, circular ou quadrática, com diâmetro geralmente de um metro para o teste com ratos, e cercada por paredes para prevenir a fuga dos animais; o piso é usualmente marcado com linhas para permitir uma quantificação da locomoção. A iluminação é variável, e freqüentemente intensa para provocar uma aversividade. Medidas comportamentais incluem locomoção (periférica ou central), rearings (encostar as patas nas paredes ou no espaço vazio), auto-limpeza, congelamento, assim como defecação ou urinação (que são medidas de ativação do sistema nervoso autonômico). A associação de baixa locomoção com uma alta taxa de defecação, como mencionado acima, tem sido a definição operacional de emocionalidade no rato, mas esta medida unitária de emocionalidade tem sido criticada. De fato, muitos estudos mostram que o constructo da emocionalidade, do jeito que vem sendo medida no campo aberto, é composto por diversos fatores ou componentes independentes, sendo que os dois principais fatores são a descarga motora ou atividade (incluindo locomoção e rearing ) e equilíbrio autonômico ou reatividade emocional (medidas através da contagem do número de bolos fecais). A urinação, primariamente, poderia ser considerada como um índice de demarcação territorial. Locomoção pode ser ainda dividida em central (longe das paredes) e periférica (quando os animais podem encostar-se à parede), sendo o primeiro mais relacionado com medo e ansiedade e o último com atividade geral do animal. Diferenças nas linhagens relacionadas a defecação e atividade locomotora são descritas em camundongos e ratos (Figura 20.1) Muitos outros testes de novidade são usados para caracterizar a reatividade emocional dos animais. Alguns deles são menores, com um baixo nível de iluminação para reduzir a aversividade do ambiente, o que favorece a atividade locomotora dos animais. Estes são conhecidos como gaiolas de atividade, e usualmente possuem equipamentos para um registro automático do movimento dos animais. A atividade motora geral pode ser ainda registrada através de vários outros recursos, como por exemplo, pulsos de infravermelho, bobinas de indução etc. De forma alternativa, o ambiente experimental pode ser ainda mais complexo para favorecer outros aspectos do comportamento e permitir a análise de diferentes componentes de atividade em testes de novidade, como por exemplo, a atividade exploratória (caixa-vazada, introdução de objetos no campo aberto, paredes perfuradas etc), ou conflitos motivacionais (presença de comida, água, ou de coespecíficos). Um destes testes é o chamado Teste de Interação Social. Neste teste é possível observar que o tempo despendido por pares de ratos machos interagindo socialmente varia de acordo com a aversividade do aparato experimental. O teste da Hiponeofagia é um teste de conflito aonde ratos com fome são expostos a bolotas de comida localizadas no centro de um ambiente novo e intensamente iluminado. Espera-se que ratos altamente emocionais demonstrem uma maior latência para abordar a

3 comida, e, por conseguinte, que tenham um menor consumo desta mesma comida. Estes testes vêm sendo especialmente desenvolvidos para o estudo do mecanismo de ação de diversos compostos ansiolíticos. Juntamente com outros testes de reatividade, nós podemos citar o Reflexo de Sobressalto Acústico e as Vocalizações Ultra-sônicas de filhotes. Este último teste, por exemplo, é feito nas duas primeiras semanas de vida de filhotes, após o isolamento de suas respectivas mães, e o registro de suas vocalizações através de um aparelho especializado. Mas é importante lembrar que esta lista de modelos ainda está longe de estar completa. Respostas de Estresse Incondicionadas, Testes de Escolha. Tais testes consistem de dois (ou mais) compartimentos que diferem entre si nos seus níveis de aversividade. O animal pode se movimentar livremente de um compartimento para outro(s). Por exemplo, temos a caixa de transição claro-escuro ( Black-White Box ), que é composta por um compartimento pequeno e escuro, juntamente com uma área larga e altamente iluminada, conectadas por uma pequena passagem (ou porta) por onde o animal pode se movimentar livremente. Transições entre os compartimentos e a locomoção geral são registradas. Drogas ansiolíticas, de uma forma geral, aumentam essas duas medidas (transição e locomoção geral), e antidepressivos se mostram inativos. Muitas variantes desse teste têm sido descritos como testes de emergência, com o animal sendo introduzido num compartimento seguro (usualmente pequeno e escuro, onde o animal pode sair por um tempo para se habituar) e o tempo para emergir para um compartimento mais aversivo (usualmente maior, altamente iluminado e não-explorado previamente) é medido. O Labirinto em Cruz Elevado foi desenvolvido a partir de estudos que mostram que ratos demonstram mais medo quando expostos a espaços abertos e elevados do chão, do que quando expostos a espaços fechados. Este é o teste mais popular nos dias de hoje para a classificação de drogas ansiolíticas em ratos. Tal aparato consiste de quatro braços elevados 45 cm do chão, com 50 cm de comprimento e 10 cm de largura. Tais braços estão arranjados numa disposição de cruz, com dois braços opostos fechados com paredes altas e dois braços opostos abertos. Em sua intersecção, uma plataforma central permite acesso para qualquer um dos quatro braços. Os ratos são colocados na plataforma central, e por 5 minutos, a locomoção total ou exploração total é medida através do número total de entradas em todos os braços, aonde a porcentagem de entradas nos braços abertos é inversamente proporcional ao medo, já que tal porcentagem é aumentada após certos tratamentos com ansiolíticos (benzodiazepínicos, mas não ansiolíticos com ação na serotonina) e reduzida por drogas ansiogênicas como cafeína, yohombina, e anfetamina. De fato, ratos passam maior tempo nos braços fechados e demonstram mais sinais fisiológicos e comportamentais de medo quando confinados nos braços abertos do que quando estão nos braços fechados: locomoção reduzida, maior taxa de defecação e maior resposta de corticosterona no plasma sanguíneo. Experimentos de Condicionamento Muitos destes experimentos são baseados na administração de um estímulo aversivo, mais freqüentemente um choque elétrico nas patas. Nos paradigmas de esquiva ativa, animais experimentais podem escapar ou evitar o estímulo incondicionado através de uma resposta adequada programada pelo experimentador: por exemplo, pressionar uma barra ou então a troca de um lado da caixa por outro. A aprendizagem da resposta pode ser dificultada pela administração prévia de choques inescapáveis. Este paradigma, conhecido como desamparo aprendido, é usado como um modelo de depressão em estudos farmacológicos ou patofisiológicos. Outro paradigma popular para estudos psicofarmacológicos é o chamado teste do nado forçado, aonde o rato aprende numa primeira exposição que não existe escapatória possível de um pequeno tanque com água e eventualmente exibe um comportamento depressivo (maior tempo de flutuação na água) nos testes subseqüentes. Interpretando Emocionalidade através de uma abordagem multivariada. Entender o significado psicológico de um dado comportamento emocional não é simples. Muito freqüentemente, diferentes indivíduos variam numa série de comportamentos de uma maneira

4 visivelmente inconsistente, ou seja, um animal (ou grupo de animais) pode parecer altamente medroso em relação a um específico comportamento (por exemplo, defecação), mas não em outros tipos (por exemplo, locomoção). Como um exemplo, observe o comportamento dos ratos Brown Norway na figura 20.1 e Por este motivo, para aumentar a confiabilidade do estudo da reatividade emocional em animais de laboratório, diferentes comportamentos podem ser medidos num teste somente (situações de testes simples), ou uma bateria de diferentes testes pode ser aplicada para o mesmo grupo de animais (situações de testes múltiplos). Em ambos os casos, resultados normalmente sugerem que diferentes reações comportamentais e diferentes contextos experimentais podem estar associados a diferentes dimensões da emocionalidade. Situações de testes simples: a análise fatorial ou multivariada tem sido aplicada de forma bem sucedida para distinguir diversas dimensões da reatividade emocional em animais experimentais em situações de testes simples. O paradigma do labirinto em cruz elevado servirá de exemplo, pois provavelmente é o teste mais bem documentado da literatura. Cruz e colaboradores mediram 13 variáveis comportamentais no labirinto em cruz elevado de 30 ratos Wistar machos. Os primeiros e mais importantes dois fatores representam variáveis de ansiedade e locomoção. Porcentagem de entradas nos braços abertos, tempo nos braços abertos, e tempo nos braços fechados (negativamente relacionados) são as variáveis com os maiores carregamentos no primeiro fator. Estas medidas mudaram numa direção através da administração de drogas ansiolíticas e numa direção oposta após a administração de drogas ansiogênicas, sendo consideradas assim medidas de ansiedade. O segundo fator reflete principalmente o número de entradas nos braços fechados (locomoção). O número total de entradas nos braços abertos, que normalmente é usado como o principal índice de locomoção no labirinto em cruz elevado, é uma medida ambígua, já que esta variável carrega simultaneamente tanto no fator ansiedade quanto no fator locomoção. Esta ambigüidade parece ser devido a uma maior contaminação de respostas emocionais em comparação com o fator número de entradas nos braços fechados. Finalmente, tempo despendido no centro do labirinto carregou como terceiro fator. Situações de testes múltiplos: Este tipo de análise é mais poderosa para se investigar os dados obtidos dos mesmos animais utilizados em situações experimentais diferentes. Por exemplo, Trullas e Skolnick estudaram o comportamento de 16 linhagens Inbred (uma linhagem Inbred é obtida após 20 gerações de cruzamentos consangüíneos, ou seja, irmão-irmã; uma linhagem Outbred, por sua vez, é obtida evitando-se cruzamentos consangüíneos) de camundongos no campo aberto e no labirinto em cruz elevado. As variáveis que saturaram no fator 1 (44,5% da variância total) foram todas relacionadas com o tempo despendido ou com o número de cruzamentos ( Crosses ) entre os braços abertos do labirinto em cruz elevado. Já que o tempo despendido nos braços abertos correlacionou-se tanto com o reflexo do sobressalto acústico e a hiponeofagia num ambiente novo, o fator 1 foi interpretado como um reflexo do nível de ansiedade do animal. Variáveis relacionadas com locomoção, ambas no campo aberto e no labirinto em cruz elevado, carregaram no fator 2 (27,5% da variância total), o que nos parece ser uma medida de atividade geral. Novamente, o terceiro fator (10,3% da variância total) foi definido exclusivamente como o tempo gasto na plataforma central do labirinto em cruz elevado. Uma análise similar foi conduzida em nosso laboratório em cima dos dados obtidos de 19 variáveis de 4 testes comportamentais: campo aberto, labirinto em cruz elevado, caixa de transição claro-escuro e interação social. Os sujeitos empregados foram machos e fêmeas de seis linhagens inbred. O primeiro fator (36,6% da variância total) foi ainda definido por variáveis classicamente associadas com ansiedade (locomoção na parte central do campo aberto, entradas e tempo gasto nos braços abertos do labirinto em cruz elevado, comportamento na caixa de transição claro-escuro). O segundo fator (30,3% da variância total) foi definido por medidas de locomoção (locomoção total e locomoção na parte externa do campo aberto, locomoção nos braços fechados do labirinto em cruz elevado). De forma muito interessante, o tempo de interação social num ambiente novo carregou como terceiro fator (18,3% da variância total), junto com a taxa de defecação no campo aberto e na caixa de transição claro-escuro. Esta independência entre comportamentos medidos em diferentes testes de ansiedade, como o labirinto em cruz elevado e a interação social, já havia sido anteriormente descrita por File. Tais dados mostram que estas 3 medidas comportamentais no campo aberto locomoção na parte externa, locomoção na parte interna e defecação carregaram em diferentes fatores e foram independentes na maior parte do tempo. A abordagem multifatorial nos traz um bom número de conclusões interessantes. Por exemplo, em muitos desses experimentos, os dois principais eixos de variabilidade são relacionados, respectivamente, ao nível de estimulação emocional e a quantidade de ativação locomotora do aparato. Isto nos lembra os dois principais fatores extraídos por Eysenck após numerosos estudos descritivos sobre a personalidade humana: estabilidade emocional vs instabilidade emocional(neuroticismo) e extraversão vs introversão.

5 Obviamente, esta abordagem ainda é uma super-simplificação da realidade, como mostrado, por exemplo, pela independência dos resultados obtidos em diferentes testes de ansiedade. A complexidade salta aos olhos no exato momento em que nós a encaramos. Análise Genética Uma grande variabilidade pode ser encontrada em comportamentos emocionais entre animais individuais. Diferentes estratégias experimentais têm sido usadas nos últimos 50 anos para se analisar esta variabilidade e identificar suas causas. No restante deste capítulo, estas estratégias serão apresentadas aqui com alguns exemplos ilustrativos de resultados experimentais. Diferenças entre linhagens inbred criadas no mesmo ambiente, experimentos de seleção e estudos de genética quantitativa vêm mostrando que fatores genéticos possuem uma grande influência em diferenças inter-individuais, embora tais fatores de fato possuam uma interação com outros fatores ambientais, especialmente durante o período neonatal e pós-natal. Estudos de genética Molecular, por outro lado, estão agora florescendo e devem, em pouco tempo, desembaraçar as bases moleculares destas diferenças nos vários aspectos da reatividade emocional. Experimentos de Seleção Nós mostramos diversos exemplos de diferenças entre linhagens para comportamentos emocionais nas figuras 20.1 e Se estes traços são herdáveis, criações selecionadas deveriam ser efetivas em modificar o valor de um determinado caráter de uma população. Muitos exemplos nos mostram que, de fato, este é o caso para numerosos traços de reatividade, como medidos: - No Campo Aberto: Maudsley Reativos (MR) e Maudsley Não-Reativos (MNRA) linhagens de ratos, selecionados a partir de sua taxa de defecação; ratos Floripa H e L, seletivamente criados para alta ou baixa taxa de locomoção na área aversiva central; linhagens de camundongos (selecionadas a partir de sua atividade locomotora divergente) criadas de uma geração F3, resultado de um cruzamento entre as cepas BALB/c e C57BL/6; - No Labirinto em Cruz Elevado: linhagens de ratos com Alto Comportamento Ansioso ( High Anxiety Behavior HAB ) e Baixo Comportamento Ansioso ( Low Anxiety Behavior LAB ); - No teste de vocalização ultra-sônica (Ultra Sonic Vocalization): linhagens de ratos com Alta ou Baixa Vocalização Ultra-sônica ( High and Low USV ), a partir de suas taxas contrastantes de vocalização ultra-sônica em resposta a um isolamento materno aos 10 dias de idade; - Em testes de Atividade: Naples com alta-excitabilidade ( Naples High-Excitability ) e Naples com baixa excitabilidade ( Naples Low Excitability ); Linhagem de ratos Wistar Kyoto hiperativos, linhagens de ratos Tsukuba com alta emocionalidade ( Tsukuba high-emotional THE ) e Tsukuba com baixa emocionalidade ( Tsukuba low-emotional TLE); - No teste da Esquiva Ativa: Ratos Romanos com alta ou baixa esquiva ( Roman high and low avoidance RHA/RLA ); Linhagens de ratos Siracuse com alta ou baixa esquiva ( Syracuse high and low avoidance SHA/SLA ); Koltushi alta ou baixa esquiva ( Koltushi high and low avoidance KHA/KLA ); linhagens de ratos com alta ou baixa esquiva ( High and Low Avoidance animals HAA/LAA ). Estas linhagens têm sido extensivamente usadas para análises genéticas quantitativas, e agora começarão a ser empregadas em estudos de genética molecular. (Tradução livre do Capítulo 20 Genetic Analysis of Emotional Behaviors Using Animal Models, de André Ramos e Pierre Mormède, págs do livro Neurobehavioral Genetics, Methods and Applications, Editora Taylor & Francis, 2007)

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