Sêmen refrigerado e congelado para inseminação artificial em ovinos

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS Sêmen refrigerado e congelado para inseminação artificial em ovinos EDUARDO MAZON CORANDIN Orientador: Benedito Dias de Oliveira Filho GOIÂNIA 2011

2 ii EDUARDO MAZON CORANDIN SÊMEN REFRIGERADO E CONGELADO PARA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM OVINOS Seminário apresentado junto à Disciplina Seminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás Nível: Mestrado Área de Concentração: Produção Animal Linha de pesquisa: Biotecnologia e eficiência reprodutiva animal Orientador Prof. Dr. Benedito Dias de Oliveira Filho UFG Comitê de Orientação Profª. Dra. Maria Lúcia Gambarini UFG Profª. Dra. Eliane Sayuri Miyagi UFG GOIÂNIA 2011

3 iii SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA Características do sêmen ovino Refrigeração seminal Diluentes utilizados para refrigeração do sêmen Métodos para refrigeração seminal Temperatura de armazenamento Inseminação artificial com sêmen refrigerado Criopreservação do sêmen Diluentes utilizados para criopreservação seminal Métodos para criopreservação seminal Descongelamento do sêmen Inseminação artificial com sêmen criopreservado Estresse oxidativo Antioxidantes CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS... 26

4 iv LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - Características de um espermatozóide bovino sem a membrana plasmática. A cabeça com o capuchão acrossomático e a cauda com suas quatro divisões anatômicas. Cortes transversais da peça intermediária, peça principal e peça da cauda mostram o núcleo do axonema central de microtúbulos, as nove fibras grossas externas, a bainha mitocondrial, as colunas longitudinais ventral e dorsal e as costelas circulares FIGURA 2 Proporção de espermatozóides vivos após 72 horas da colheita e armazenagem a 5 C ( ) ou 15 C ( ) em diluidor a base de leite desnatado ( ), OviPro ( ), AndroMed ( ), ou INRA 96 ( ) FIGURA 3 Taxa de prenhez com inseminação artificial cervical usando sêmen armazenado por 0, 24, 48 e 72 h (barra vertical representa 95% de intervalo de confiança para as médias)... 10

5 v LISTA DE TABELAS TABELA 1 - Características seminais (média ± desvio padrão) de carneiros das raças Santa Inês, Dorper e mestiços, na região leste do Rio Grande do Norte... 4 TABELA 2 - Diluente Gema de Ovo-Tris Frutose para sêmen de carneiro... 6 TABELA 3 - Média e desvio-padrão da motilidade individual progressiva (MIP) de acordo com o diluente e o tempo de armazenamento do sêmen ovino... 9 TABELA 4 - Taxa de fertilidade de ovelhas após inseminação cervical ou intrauterina com sêmen refrigerado, após 12 horas da detecção de cio 11 TABELA 5 - Médias e erro padrão dos parâmetros da motilidade espermática avaliada pelo sistema computadorizado (CASA) e integridade de membrana plasmática e acrossomal (IP+DIC) do espermatozóide ovino no sêmen fresco (SF) e no sêmen congelado nos diluidores: TRIS, TRIS 0,5 e TRIS TABELA 6 - Motilidade progressiva média do sêmen de carneiros, no estado nativo (Mpi), após diluição com a fração A (Mp1), após 2 horas da diluição com a fração A (Mp2), após diluição com a fração B (Mp3), após 14 horas da diluição com a fração B (Mp4), apó s a exposição ao vapor de nitrogênio líquido (Mp5) e 30 dias após o congelamento (Mp6), submetido a três diluentes (Dil.): Tris-Gema (TG), Leite-Gema (LG) e Tris-Gema-Leite(TGL) TABELA 7 - Valores após descongelamento de sêmen ovino criopreservado com três diluentes... 17

6 vi TABELA 8 - Valores médios após descongelamento de sêmen ovino criopreservado com quatro combinações de agente crioprotetores permeáveis e não-permeáveis TABELA 9 - Média e desvio-padrão da motilidade espermática pré e pós a criopreservação e integridade de membrana plasmática de sêmen criopreservado com diluidor a base de Tris-gema contendo glicerol, diferentes proporções de DMF/GLY e somente DMF TABELA 10 - Média e desvio padrão de motilidade, motilidade progressiva, velocidade média de percurso (VMP) e velocidade linear (VLN) de sêmen ovino acrescido de diferentes antioxidantes e submetidos a criopreservação TABELA 11 - Média e desvio padrão da integridade de membrana espermática, integridade acrossomal e atividade mitocondrial de sêmen ovino acrescido de diferentes antioxidantes e submetidos a criopreservação TABELA 12 - Média e desvio padrão da motilidade progressiva e integridade acrossomal de sêmen ovino criopreservado com diferentes concentrações de antioxidantes... 23

7 1 INTRODUÇÃO A ovinocultura representa uma importante atividade sócio-econômica em muitos continentes. Em países como Nova Zelândia, Austrália e Uruguai, essa atividade significa importante fonte de receita, com valores produtivos expressivos e grande participação nas exportações. O Brasil apresentou, de 2006 a 2009, 17,8% de crescimento no rebanho ovino (IBGE, 2006; IBGE, 2009), com destaque para as regiões nordeste e sul. No ano de 2009, o Estado de Goiás detinha cabeças, o que representava 17% do efetivo da região Centro-Oeste (IBGE, 2009). Devido à melhoria do poder aquisitivo do brasileiro o consumo de carne ovina vem crescendo, principalmente nos grandes centros urbanos, concomitantemente os consumidores também se tornam mais exigentes, e por isso, a qualidade do produto ofertado torna-se primordial para alavancar e consolidar a carne ovina no mercado interno e abrir novas opções de exportação. Para isso, é necessário ações tanto na parte de manejo, com o uso de confinamentos na terminação, como na melhoria genética do rebanho nacional, com programas de melhoramento e utilização de biotécnias reprodutivas. Além da melhoria da qualidade, também é importante a manutenção da continuidade e da regularidade na oferta do produto, e para isso, é necessário a organização de todos os envolvidos nessa cadeia produtiva (SORIO, 2009). A introdução e utilização de raças mais especializadas, e, utilização de biotécnias reprodutivas como avaliação da qualidade seminal, inseminação artificial (IA), transferência de embriões (TE) e fertilização in vitro (FIV), devem ser desenvolvidas e implementadas para a melhoria da ovinocultura, através da disseminação genética de indivíduos superiores. O desempenho reprodutivo dos animais dita a velocidade com que se obtém o produto final e possui influência direta na rentabilidade do sistema e no retorno econômico da atividade, por isso, as biotécnicas da reprodução não são utilizadas somente para a melhoria da carga genética dos animais, mas também constitui, juntamente com programas de melhoramento genético, importantes ações para o incremento e intensificação da produção. Os programas reprodutivos são bem difundidos e utilizados na bovinocultura nacional, mas no

8 2 cenário ovino apresenta-se bastante atrasado. O fato de a ovinocultura ainda apresentar um caráter extrativista ou secundário, pode explicar a pouca difusão e utilização de biotécnicas reprodutivas entre os produtores. O uso de sêmen conservado na ovinocultura nacional é uma prática pouco difundida, pelo caráter extrativista, e ainda apresenta resultados insatisfatórios, principalmente quando se utiliza sêmen congelado com a inseminação convencional. Um dos agravantes é a dificuldade de transpor a cérvix devido a sua anatomia, assim, é necessário o uso de laparoscopia para a deposição do sêmen dentro do útero, tornando essa técnica muito laboriosa. Quando se utiliza sêmen fresco ou refrigerado, pode-se optar pela inseminação artificial com a deposição do sêmen na entrada da cérvix, simplificando a técnica e viabilizando a sua utilização. É necessária a difusão de programas reprodutivos entre os produtores de ovinos para que haja o desenvolvimento desse setor através da melhoria genética dos rebanhos nacionais, e, o estudo da conservação do sêmen se torna primordial para a evolução e padronização das técnicas de inseminação artificial e também para determinar a capacidade reprodutiva do macho. O conhecimento de antioxidantes que sejam eficientes na manutenção da qualidade seminal após o processamento, também é um fator que necessita de estudos, pois está diretamente relacionado com a melhoria dos índices produtivos. Assim, objetiva-se com essa revisão discutir e discorrer sobre a utilização de sêmen ovino refrigerado e congelado para inseminação artificial, e aspectos relacionados à manutenção da qualidade seminal após as etapas de refrigeração e criopreservação.

9 3 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Características do sêmen ovino O sêmen pode ser caracterizado como suspensão celular líquida que contém gametas masculinos altamente especializados (espermatozóides) e também secreções dos órgãos acessórios do aparelho reprodutor masculino. O plasma seminal é constituído pela porção fluida dessa suspensão, que é liberada na ejaculação. Os espermatozóides (Figura 1) são provenientes dos túbulos seminíferos localizados no interior dos testículos, os quais contêm uma série de complexas células germinativas em desenvolvimento, que dão origem aos espermatozóides, através de uma sequência de eventos denominada espermatogênese (HAFEZ & HAFEZ, 2004). FIGURA 1 - Características de um espermatozóide bovino sem a membrana plasmática. A cabeça com o capuchão acrossomático e a cauda com suas quatro divisões anatômicas. Cortes transversais da peça intermediária, peça principal e peça da cauda mostram o núcleo do axonema central de microtúbulos, as nove fibras grossas externas, a bainha mitocondrial, as colunas longitudinais ventral e dorsal e as costelas circulares. Fonte: HAFEZ & HAFEZ (2004).

10 4 O plasma seminal é a porção fluida do sêmen, incorporada durante a ejaculação, provenientes das glândulas sexuais acessórias, epidídimos, testículos e ductos deferentes. Atua como transportador e protetor da células, por isso é um componente essencial na cobertura natural, principalmente para os ovinos e bovinos, pois o ejaculado é depositado na vagina (HAFEZ & HAFEZ, 2004). O núcleo corresponde aproximadamente 35% do peso da célula espermática, sendo os ácidos nucléicos, proteínas e lipídeos os principais componentes químicos do espermatozóide, que ainda é rico em fósforo, nitrogênio e enxofre (HAFEZ & HAFEZ, 2004). O sêmen do carneiro possui volume do ejaculado relativamente pequeno, variando de 0,5 a 2,0 mililitros (ml) e concentração espermática entre dois e cinco bilhões de espermatozóides por ml de ejaculado, sendo comum nessa espécie encontrar 90% de motilidade (MAIA et al., 2011). Diferenças entre raças têm sido encontradas na maioria dos parâmetros seminais de ovinos, principalmente devido à variação no diâmetro testicular. Em levantamento realizado por MAIA et al. (2011) sobre as características seminais de carneiros criados no Rio Grande do Norte, observa-se uma estreita diferença entre raças (Tabela 1). TABELA 1 - Características seminais ( média ± desvio padrão) de carneiros das raças Santa Inês, Dorper e mestiços, na região leste do Rio Grande do Norte Variáveis Raça Dorper (n = 5) Santa Inês (n = 5) Mestiços (n = 6) Volume (ml) 1,1 ± 0,2 0,98 ± 0,6 1,2 ± 0,4 Concentração (x10 6 /ml) 2250 ± 426, ± 1405,4 3108,3 ± 2097,1 Motilidade (%) 72,0 ± 26,8 77,0 ± 26,4 74,2 ± 22,9 Vivos (%)* 82,4 ± 17,4 81,0 ± 14,2 85,2 ± 6,9 MM (0-5) 4,0 ± 1,4 4,0 ± 0,7 3,8 ± 1,5 Vigor (0-5) 4,2 ± 1,1 4,4 ± 0,9 4,2 ± 0,9 TDEF (%) 22,6 ± 9,9 24,2 ± 9,3 18,5 ± 10,4 DMA (%) 16,6 ± 7,8 19,4 ± 9,5 15,2 ± 9,2 DME (%) 6,2 ± 3,4 4,8 ± 2,8 3,3 ± 3,2 PE (cm) 34,5 ± 1,2 34,2 ± 2,14 34,4 ± 4,1 *Coloração vital, P > 0,05. MM: motilidade massal, TDEF: total de defeitos espermáticos, DMA: defeitos maiores, DME: defeitos menores. Fonte: MAIA et al. (2011).

11 5 PACHECO et al. (2009) trabalhando com carneiros da raça Santa Inês na região sul do Espírito Santo, observaram idade média à puberdade de 210,8 ± 50,8 dias, peso corporal de 36,3 ± 9,2 quilogramas (kg) e perímetro escrotal de 25,2 ± 3,0 centímetros (cm), contudo, ALVES et al. (2006) observaram idade à puberdade mais precoce (194,6 dias) com animais da mesma raça, criados no Distrito Federal. Com isso, exalta a necessidade de programas de melhoramento genético para produção de animais mais precoces. 2.2 Refrigeração seminal Diluentes utilizados para refrigeração do sêmen Devido ao pouco volume (0,5 a 2,0 ml) e alta concentração espermática (2 a 5 x 10 9 sptz/ml), utiliza-se diluente para aumentar o volume total do ejaculado e assim obter maior proporção de doses inseminantes. Os diluidores visam primeiramente o aumento de volume, mas devem também favorecer a sobrevivência dos gametas masculinos e ser livres de materiais tóxicos para minimizar o desperdício de células (GONÇALVES et al., 2001). De acordo com HAFEZ & HAFEZ (2004), um diluente deve fornecer para os espermatozóides nutrientes e energia, como glicose, proteger as células do choque térmico, proporcionar um meio tampão e uma pressão osmótica adequada, inibir a proliferação bacteriana e aumentar o volume do ejaculado. Para melhores resultados, deve-se adicionar o diluente ao sêmen e, após a mistura cuidadosa promover a avaliação do sêmen diluído para confirmar a sua viabilidade espermática. Normalmente os diluentes utilizados para preservação de sêmen de carneiro apresentam ph, capacidade de tamponamento e osmolaridade adequados, e promovem proteção aos espermatozóides de lesões criogênicas (SALAMON & MAXWELL, 2000). Os diluidores mais utilizados são a base de Tris (hidroximetil aminometano) (MAIA et al., 2008) e leite desnatado (HAFEZ & HAFEZ, 2004). A gema de ovo (Tabela 2) é comumente adicionada aos diluidores, devido a sua fração lipoproteíca de baixa densidade e alto peso molecular, promove proteção

12 6 aos espermatozóides contra o choque térmico, reduz a perda de enzimas acrossomais e previne alterações de membrana durante o armazenamento (SALAMON & MAXWELL, 2000). Nos diluidores a base de leite desnatado esse mecanismo de proteção deve-se também a sua fração protéica (MEDEIROS et al., 2002). TABELA 2 - Diluente Gema de Ovo-Tris Frutose para sêmen de carneiro Componente Quantidade Tris (hidroximetil) aminometano 3,634 g Frutose 0,50 g Ácido cítrico, monoidrato 1,99 g Gema de ovo 14 ml Água destilada 100 ml q.s.p. Fonte: HAFEZ & HAFEZ (2004). MACHADO et al. (2006) avaliaram o diluidor à base de água de coco em pó (ACP-102 ) para inseminação artificial em ovinos da raça Santa Inês com sêmen refrigerado à 4 graus Celsius ( C),e, obtiveram taxa de fertilidade de 48% na inseminação cervical e 70,3% quando utilizaram laparoscopia. Segundo ANEL et al. (2006), a evolução da tecnologia nos diluidores seminais tem mostrado que a sobrevivência dos espermatozóides por períodos prolongados é inversamente proporcional à sua atividade metabólica. Várias substâncias orgânicas e sintéticas (SALAMON & MAXWUEL, 2000) são utilizadas e lançadas pela indústria para promover proteção aos espermatozóides durante a diluição, porém, o balanço entre concentração e interação desses agentes com o meio celular deve ser sempre mensurado Métodos para refrigeração seminal A refrigeração do sêmen ovino diluído é utilizada como principal método de armazenamento, é caracterizada pela redução da temperatura que originalmente encontra-se em torno de 37 C para temperaturas próximas a zero grau Celsius. Nesse período o espermatozóide sofre inibição reversível de seu metabolismo (CÂMARA & GUERRA, 2011).

13 7 Para promover essa queda na temperatura, pode-se utilizar equipamentos convencionais (refrigerador, garrafas térmicas ou caixas isotérmicas com gelo), ou ainda, equipamentos automatizados. Quando se utiliza refrigerador (geladeira), as palhetas devem ser colocadas primeiramente em frascos com águas a 30 C, e posteriormente levadas ao refrigerador e mantidas até a estabilização da temperatura. No uso de caixas isotérmicas com gelo ou água gelada, as palhetas devem ser protegidas com algodão hidrofóbico para evitar o choque térmico devido ao contato direto com o gelo. A refrigeração do sêmen, de 30 C a 0 C realizada de forma abrupta, pode ocasionar um estresse letal a algumas células, caracterizado como choque térmico (WATSON, 2000). O dano as células causados pela queda da temperatura está relacionado com alterações no arranjo dos constituintes da membrana devido a mudanças na viscosidade do meio (MEDEIROS et al., 2002). Uma queda de temperatura lenta também promove tensão na membrana celular (WATSON, 2000), por isso a curva de refrigeração deve ser monitorada e padronizada. Bolsas plásticas contendo água são utilizadas com eficiência para controlar a queda de temperatura quando se utiliza refrigeradores convencionais (RODELLO, 2006) ou balcão (LIMA et al., 2010). RODELLO (2006) comparou um equipamento automatizado com geladeira para refrigeração do sêmen ovino, porém, as palhetas do sêmen foram colocadas na geladeira entre bolsas plásticas contendo água, a fim de proporcionar um resfriamento gradativo até estabilização a 5 C. Para a refrigeração automatizada, utilizou-se o equipamento de fabricação nacional TK 3000, programado para executar uma queda de temperatura de -0,5 C/minuto. Ao comparar os dois sistemas, não foi possível encontrar diferença estatística para os critérios avaliados, ambos apresentaram uma queda de -0,5 C/minuto e um tempo de 90 minutos para reduzir a temperatura de 32 para 5 C. Vários métodos podem ser utilizados para promover essa queda de temperatura, sejam eles automáticos ou manuais, a curva de queda da temperatura deve ser promovida de maneira constante e homogênea, evitando variações bruscas que culminam em choque térmico e redução da viabilidade espermática (WATSON, 2000; MEDEIROS et al., 2002).

14 Temperatura de armazenamento A redução da temperatura a níveis baixos é utilizada para deprimir o metabolismo dos espermatozóides e prolongar a sua vida fértil (ANEL et al., 2006), possibilitando o seu armazenamento e utilização por um maior período de tempo. O armazenamento do sêmen na forma líquida apresenta facilidade no seu processamento, mas, possui um tempo hábil bastante limitado. Utilizam-se várias temperaturas no armazenamento do sêmen refrigerado, entretanto as temperatura de 15 C (Y ÁNIZ et al., 2005; DRUART et al., 2009), 5 C (BUCAK & TEKIN, 2007; ROJERO et al., 2009; LIMA et al., 2010) e 4 C (SOUSA et al., 2010) são as comumente utilizadas. O armazenamento do sêmen na temperatura de 4 C promove a redução no metabolismo dos espermatozóides, economia das reservas energéticas e boa conservação da motilidade, enquanto a preservação seminal a C mantém o atividade celular, tornando os espermatozóides mais sensíveis aos metabólicos tóxicos (DECUADRO-HANSEN, 2004). Quando se utiliza o sêmen fresco, esse deve ser mantido à temperatura em torno de 30 C e utilizado no menor tempo possível, pois nessa condição a motilidade e viabilidade seminal reduzem rapidamente. Quando se refrigera o sêmen, este pode ser armazenado e utilizado até 48 horas após a colheita (ROJERO et al., 2009), porém ocorre uma queda acentuada na fertilização após 24 horas na inseminação artificial cervical (ANEL et al., 2006; O HARA et al., 2010). O sêmen mantido a temperatura de 15 C possui um tempo útil bastante inferior aqueles acondicionados a 4-5 C, e para que tenha índices satisfatórios recomenda seu uso até 8 horas após o processamento (ANEL et al., 2006). Por isso, os diluentes são empregados no intuito de aumentar o tempo de armazenamento seminal. SOUSA et al. (2010) compararam diluentes comerciais ao tradicional Tris-Gema sobre a viabilidade in vitro de células espermáticas de ovinos da raça Dorper submetidos ao processo de refrigeração à 4 C e armazenados por um período de até 48 horas. Nota-se, na Tabela 3, uma grande diferença nos valores de motilidade individual progressiva para os tratamentos Equimix e Equimix-

15 9 Gema, sendo que, o tratamento à base de Tris-Gema proporcionou proteção às células até 24 horas de armazenamento, e, como se trata do mesmo diluente comercial os autores atribuíram o fato devido à adição de 20% de gema de ovo. No entanto, a utilização de gema de ovo pode diferenciar os tratamentos devido à grande variabilidade da sua composição (ANEL et al., 2006), dificultando a padronização dos diluentes. Nota-se que o diluente tradicional Tris- Gema pode ser utilizado para conservação do sêmen a 4 C por um período de até 48 horas, corroborando com ROJERO et al. (2009). TABELA 3 - Média e desvio-padrão da motilidade individual progressiva (MIP) de acordo com o diluente e o tempo de armazenamento do sêmen ovino Tempo (horas) Equimix Equimix-Gema Tris-Gema 0 76,67±10,41 80,00±5,00 81,67±2, ,00±8,66 75,00±5,00 80,00±5, ,00±5,00 65,00±13,23 78,33±2, ,67±2,89 36,67±15,28 73,33±2, ,67±2,31 10,33±12,86 68,33±2,89 Fonte: Adaptado de SOUSA et al. (2010). O HARA et al. (2010) avaliaram a viabilidade espermática de sêmen de carneiros refrigerados nas temperaturas 5 C e 15 C no armazenamento até 72 horas após a colheita, e observaram que a viabilidade permaneceu relativamente constante entre 24 e 72 horas para o sêmen refrigerado a 5 C, enquanto que no armazenamento do sêmen a 15 C a viabilidade declinou linearmente (Figura 2). FIGURA 2 Proporção de espermatozóides vivos após 72 horas da colheita e armazenagem a 5 C ( ) ou 15 C ( ) em diluidor a base de leite desnatado ( ), OviPro ( ), AndroMed ( ), ou INRA 96 ( ). Fonte: O HARA et al. (2010).

16 10 A taxa de prenhez após a inseminação artificial cervical com sêmen refrigerado a 5 C utilizando o diluidor INRA 96 também apresentou queda com o aumento do tempo de armazenamento (Figura 3), mas, obteve um índice satisfatório (52,2%) quando a sua utilização foi em até 24 horas, se mostrando uma alternativa viável. FIGURA 3 Taxa de prenhez com inseminação artificial cervical usando sêmen armazenado por 0, 24, 48 e 72 h (barra vertical representa 95% de intervalo de confiança para as médias). Fonte: O HARA et al. (2010) Inseminação artificial com sêmen refrigerado O sêmen de carneiros, assim como nas demais espécies, pode ser utilizado para inseminação artificial na forma fresca, refrigerado ou congelado (ROJERO et al., 2009). As técnicas para a inseminação artificial incluem deposição do sêmen no canal vaginal, transcervical e intra-uterina. A inseminação artificial mais utilizada em ovinos é a vaginal e transcervical, e, se consegue resultados satisfatórios quando utiliza sêmen fresco ou refrigerado a 15 C, porém é necessário considerar o curto prazo de armazenamento e a necessidade de uma alta concentração de espermatozóide por dose (ANEL et al., 2006). Por outro lado, a utilização de sêmen fresco ou refrigerado reduz a eficiência do carneiro, pela necessidade de uma dose elevada de sêmen, e carece de maior organização no manejo reprodutivo da propriedade. De acordo com O HARA et al. (2010), em situações peculiares o uso de sêmen refrigerado a 5 C pode ser utilizado até três dias após a colheita e processamento, porém a taxa de prenhez reduz drasticamente com o passar do tempo (Figura 3).

17 11 Ao avaliar a inseminação artificial intra-uterina ou cervical em ovelhas no sul do México, ROJERO et al. (2009) encontraram valores aceitáveis na taxa de prenhez quando utilizaram inseminação artificial cervical (43,7%) com sêmen armazenado por 12 horas à temperatura de 5 C, porém, os valores foram bem superiores (75,0%) quando utilizaram inseminação artificial intra-uterina através de laparoscopia (Tabela 4). TABELA 4 - Taxa de fertilidade de ovelhas após inseminação cervical ou intrauterina com sêmen refrigerado, após 12 horas da detecção de cio Inseminação n Ovelhas prenhes Taxa de fertilidade (%) Cervical ,7 b Intra-uterina ,0 a a,b Letras minúsculas indicam diferenças (p<0,05) entre locais de inseminação Fonte: ROJERO et al. (2009). DRUART et al. (2009) analisaram o trânsito espermático no trato genital feminino após inseminação artificial com sêmen armazenados sob refrigeração a 15 C por 24 horas, utilizando microscopia confocal in situ e observaram que a proporção de espermatozóides móveis com deslocamento linear e sua migração da cérvix em direção à tuba uterina foi afetada pela refrigeração e armazenamento do sêmen. Com isso, mostra-se a necessidade de estudos a fim de melhorar as técnicas de refrigeração do sêmen, objetivando o aumento da fertilidade e consequente melhora nos índices zootécnicos. 2.3 Criopreservação do sêmen Diluentes utilizados para criopreservação seminal O glicerol é o crioprotetor mais utilizado, possui a capacidade de penetrar a membrana celular e diminuir o estresse osmótico intracelular causado pela desidratação, entretanto, dependendo da concentração utilizada, sua toxidade pode ocasionar danos na membrana e consequente redução da motilidade espermática (MEDEIROS et al., 2002). A adição de gema de ovo e/ou antioxidantes é utilizada para reduzir a concentração do glicerol e minimizar seu efeito tóxico (SALAMON & MAXWELL,

18 ). Segundo ANEL (2006), adição de glicerol em duas etapas com diferentes temperaturas representa o melhor balanço entre citotoxidade e criopreservação. Por apresentarem características crioprotetoras, a gema de ovo é comumente utilizada nos diluidores de sêmen para minimizar os efeitos deletérios do choque térmico. Segundo MAIA et al. (2008), a adição de surfactantes ao diluidor à base de gema de ovo melhora significativamente a qualidade seminal e fertilidade após o processo de criopreservação, devido à manutenção da motilidade e integridade das membranas. A gema de ovo atua no meio extracelular protegendo a membrana plasmática das crioinjúrias (SALAMON & MAXWELL, 2000). O efeito da interação entre as lipoproteínas de baixa densidade (LDL) da gema de ovo com a membrana celular promove diminuição na perda de fosfolipídeos da membrana e aumenta sua tolerância ao processo de criopreservação (ANEL et al., 2006). Outras substâncias como: dimetilsulfóxido (DMSO), etilenoglicol, albumina, açúcares, surfactantes, proteínas de peixe, etc. têm sido avaliadas como agentes crioprotetores, entretanto nota-se efeito inferior ao glicerol (SALAMON & MAXWELL, 2000). Em trabalho realizado por MAIA et al. (2008), os autores estudaram o efeito da adição do detergente lauril sulfato de sódio (OEP) ao diluente Tris contendo 20% de gema de ovo, sob a viabilidade seminal após o congelamento e descongelamento do sêmen de carneiros da raça Santa Inês. Foi utilizado três diluidores, o diluidor controle (Tris) sem adição de OEP, e dois diluidores a base de Tris adicionado OEP nas concentrações de 0,5 e 1,0% (TRIS 0,5 e TRIS 1). Conforme observado na Tabela 5, o processo de criopreservação causou efeito deletério à integridade da membrana plasmática e acrossomal do espermatozóide ovino, diminuindo a qualidade seminal em relação ao sêmen fresco. A adição de OEP nos níveis de 0,5 e 1,0% promoveu melhora significativa na motilidade espermática, motilidade progressiva e integridade de membrana em relação ao diluidor sem adição de OEP (Tabela 5). A queda da motilidade do espermatozóide é uma característica encontrada frequentemente em sêmen congelados, isso se deve principalmente ao estresse da criopreservação que a célula é submetida, por isso, recorre-se a utilização de crioprotetores como a gema de ovo e glicerol.

19 13 TABELA 5 - Médias e erro padrão dos parâmetros da motilidade espermática avaliada pelo sistema computadorizado (CASA) e integridade de membrana plasmática e acrossomal (IP+DIC) do espermatozóide ovino no sêmen fresco (SF) e no sêmen congelado nos diluidores: TRIS, TRIS 0,5 e TRIS 1 Sêmen Congelado Parâmetro SF TRIS TRIS 0,5 TRIS 1 MT (%) 93,7 ± 0,7 a 34,3 ± 2,5 c 65,0 ± 3,7 b 69,9 ± 5,0 b MP (%) 55,4 ± 2,0 a 24,4 ± 1,9 c 38,9 ± 2,6 b 39,1 ± 3,6 b VAP (μm/s) 158,0 ± 5,9 a 116,1 ± 3,6 b 121,3 ± 3,7 b 120,4 ± 3,4 b VSL (μm/s) 115,2 ± 4,4 a 102,5 ± 3,4 b 96,6 ± 3,1 b 92,0 ± 3,3 b VCL (μm) 286,5 ± 12,1 a 187,5 ± 5,0 c 214,6 ± 7,1 b 210,9 ± 6,5 b ALH (Hz) 10,4 ± 0,4 a 6,6 ± 0,2 c 8,6 ± 0,2 b 8,1 ± 0,3 b LIN (%) 41,2 ± 1,1 a 55,1 ± 0,7 a 46,8 ± 0,8 b 45,3 ± 0,5 b IM (%) 70,0 ± 2,3 a 13,8 ± 2,3 c 28,8 ± 2,3 b 32,4 ± 2,3 b Média seguida de letras diferentes na mesma linha difere entre si a P<0,05. MT: motilidade total; MP: motilidade progressiva; VAP: velocidade de trajeto; VSL: velocidade progressiva; VCL: velocidade curvilinear; ALH: amplitude de deslocamento lateral de cabeça; LIN: linearidade e IM: membrana plasmática intacta. Fonte: MAIA et al. (2008). O efeito crioprotetor dos diluidores Tris-gema aditivado com OEP tem efeito direto sobre as membranas espermáticas, reduzindo o estresse osmótico da adição do glicerol devido ao aumento da permeabilidade da membrana, o que explica a maior motilidade do TRIS 0,5 e TRIS 1, em relação ao grupo controle (MAIA et al., 2008). O grupo sem adição de OEP sofreu maior estresse osmótico e maior desidratação celular, reduzindo a motilidade devido à maior lesão da membrana. Esse fato reflete a importância da utilização de crioprotetores que promovem a máxima proteção dos espermatozóides à crioinjúria. Estudando a influência do leite em pó desnatado sobre a motilidade progressiva e integridade de membrana plasmática, CARVALHO et al. (2008) também verificaram redução gradual da motilidade progressiva dos espermatozóides, submetidos ao processo de criopreservação, para três diluidores testados (Tris -Gema, Leite-Gema e Tris-Gema-Leite), conforme observado na Tabela 6. Nota-se que o diluente convencional à base de Tris- Gema possui efeito crioprotetor nas etapas de congelamento e descongelamento do sêmen, por isso se mostrou mais eficiente na manutenção da motilidade

20 14 espermática progressiva após a exposição do sêmen ao vapor de nitrogênio líquido (Mp5) e 30 dias após o congelamento (Mp6). TABELA 6 - Motilidade progressiva média do sêmen de carneiros, no estado nativo (Mpi), após diluição com a fração A (Mp1), após 2 horas da diluição com a fração A (Mp2), após diluição com a fração B (Mp3), após 14 horas da diluição com a fração B (Mp4), após a exposição ao vapor de nitrogênio líquido (Mp5) e 30 dias após o congelamento (Mp6), submetido a três diluentes (Dil.): Tris -Gema (TG), Leite-Gema (LG) e Tris-Gema-Leite(TGL) Dil. Mpi Mp1 Mp2 Mp3 Mp4 Mp5 Mp6 TG 68,4 ± 65,6 ± 63,1 ± 60,3 ± 52,5 ± 29,1 ± 46,5 ± 9,5 a 11,0 a 12,3 a 11,2 a 12,7 a 13,6 a 21,7 a LG 68,4 ± 61,1 ± 56,6 ± 50,3 ± 41,4 ± 18,8 ± 26,1 ± 9,5 a 10,4 a 11,5 a 10,2 a 12,8 b 10,7 b 17,1 b TGL 68,4 ± 63,7 ± 60,3 ± 56,9 ± 49,1 ± 22,8 ± 32,1 ± 9,5 a 12,1 a 12,3 a 12,6 a 12,3 a 9,9 b 17,5 b a,b Médias seguidas das mesmas letras na coluna não diferem entre si (P<0,05). Fonte: CARVALHO et al. (2008) Métodos para criopreservação seminal A criopreservação é um processo que envolve as fases de redução de temperatura, desidratação celular, congelamento e descongelamento do sêmen (MEDEIROS et al., 2002). A criopreservação pode ser realizada de várias maneiras, contudo, para o sucesso do processo todas as etapas devem ser realizadas de forma harmoniosa. Para a criopreservação pode-se utilizar caixas isotérmicas com nitrogênio líquido (N 2 ), porém, mesmo que viável esse método possui difícil padronização das curvas de queda de temperatura. Por isso, a indústria especializada investe em pesquisas a fim de lançar aparelhos automatizados que apresentem uma curva homogênea e padronizada (RODELLO, 2006). Atualmente, existem dois métodos para a criopreservação de gametas: congelamento lento e a vitrificação. Segundo ARAV et al. (2002) o congelamento lento possui a vantagem de utilizar uma baixa concentração de crioprotetores em relação a vitrificação, porém por ser um método rápido e simples, a vitrificação reduz o choque térmico sofrido pela diminuição gradual da temperatura.

21 15 A primeira parte da amostra a congelar é a água intracelular, por isso a taxa de queda de temperatura no congelamento lento é o principal fator que determina a sobrevivência dos espermatozóides. No caso da vitrificação, utilizavase a imersão direta no N 2 (-196 C), hoje com o avanço tecnológico o nitrogênio pode chegar a temperaturas de -210 C, aumentando a taxa de congelamento, porém essa queda de temperatura drástica pode ocasionar fraturas na membrana com redução no potencial de fertilização dos espermatozóides (ARAV et al., 2002). A temperatura entre -5 C e -50 C é definida como um ponto crítico, pois nessa temperatura a taxa de congelamento determina se a célula permanece em equilíbrio com seu meio extracelular ou torna progressivamente super congelada, elevando a possibilidade de desidratação e formação de gelo intracelular (KUMAR et al., 2003). Também se utilizam suspensão no vapor de nitrogênio líquido, com posterior imersão no líquido para o congelamento do sêmen, nesse caso, o que determina a velocidade da queda da temperatura é à distância com o nitrogênio líquido e o tamanho das palhetas (LEBOEUF et al., 2000). Segundo SALAMON & MAXWELL (2000), a curva de queda de temperatura ideal para o congelamento é uma parábola, conseguida com uma distância de 4-6 centímetros entre as palhetas e o nitrogênio líquido. RODELLO (2006) obteve bons resultados ao comparar um sistema automatizado (TK 3000 ) para congelamento de sêmen com um sistema manual utilizando geladeira/vapor de nitrogênio líquido. Para o congelamento em vapor de nitrogênio líquido as palhetas com o sêmen, após atingirem a temperatura de 5 C, eram transferidas para um caixa de polietileno (isopor) contendo 5,5 litros de nitrogênio líquido. As palhetas eram expostas na posição horizontal a três centímetros do vapor de nitrogênio líquido, por 20 minutos, e posteriormente submersas no nitrogênio líquido e armazenadas em raques em botijão criogênico. Para análise da qualidade seminal, os seguintes tratamentos foram avaliados: refrigeração em geladeira e congelamento em vapor de nitrogênio líquido, refrigeração em geladeira e congelamento automatizado, refrigeração automatizada e congelamento em vapor de nitrogênio líquido, refrigeração e congelamento automatizado. Ao analisar o sêmen in vitro após o

22 16 descongelamento, não foi possível detectar diferenças entre os sistemas analisados quanto aos parâmetros avaliados. KUMAR et al. (2003) utilizaram uma taxa de criopreservação lenta (-1 C/min) e duas rápidas ( -30 C/min e -50 C/min) para avaliar o efeito da criopreservação sob os parâmetros qualitativos do sêmen de bovinos, ovinos e caprinos. Segundo os autores, a peça intermediária e cauda dos espermatozóides ovinos (envolvidos na geração e propagação do movimento) podem ser vulneráveis a taxas de congelamento lento, enquanto os espermatozóides caprinos possuem a motilidade espermática prejudicada pela criopreservação rápida. Contudo, independente da espécie, a taxa de -30 C/minuto foi mais eficiente na contra a crioinjúria, sendo recomendada entre as temperaturas de - 5 C e -50 C. Conclui-se que a criopreservação do sêmen, assim como a refrigeração, podem ser realizadas de maneira eficiente no campo, e com resultados semelhantes aquelas realizadas em laboratórios automatizados, porém, destreza e atenção são decisivos no resultado final. A comprovação da eficácia de métodos simples faz com que essa biotecnologia seja passível de utilização em todos os criatórios, e, sem a necessidade de um alto investimento em equipamentos a técnica é atrativa e com benefícios em curto prazo Descongelamento do sêmen Na utilização do sêmen criopreservado, a fase de aquecimento é tão importante para a sobrevivência dos espermatozóides quanto o processo de congelamento, os espermatozóides que sobreviveram à temperatura de -196 C são submetidos ao aquecimento e atravessam novamente a zona crítica de -15 C a -60 C (SALAMON & MAXWELL, 2000). A fim de melhorar os índices de fertilidade, vários sistemas de descongelamento foram elucidados. O descongelamento em altas temperaturas (60-75 C) é semelhante a C, quanto à motilidade, integridade de acrossoma e fertilidade dos espermatozóides (SALAMON & MAXWELL, 2000). Porém, segundo LEBOEUF et al. (2000), o descongelamento do sêmen a 37 C é mais adequado em condições práticas por excluir o risco de superaquecimento.

23 17 Um método simples e comumente utilizado para o descongelamento de sêmen é utilizando água em banho maria na temperatura de 37 C, de 20 a 30 segundos (ÇOYAN et al., 2011; MOUSTACAS et al., 2011). Para minimizar os efeitos nocivos da criopreservação e posterior descongelamento sob os gametas masculinos, são utilizados diluentes, crioprotetores e antioxidantes. SANDOVAL et al. (2007) avaliaram três diluidores e quatro combinações de agentes crioprotetores para a criopreservação de sêmen de ovinos. O experimento foi dividido em duas etapas: na primeira avaliaram o efeito protetor de dois diluentes à base de Tris (224 mm e 150 mm) e um diluente a base de leite desnatado. Nota-se (T abela 7) que os diluentes à base de Tris, proporcionaram maior proteção em comparação com o diluidor à base de leite desnatado, principalmente na concentração de 224 mm. As diferenças observadas entre os dois primeiros foram atribuídas às concentrações de Tris, ácido cítrico e frutose, utilizados em cada diluidor. TABELA 7 - Valores após descongelamento de sêmen ovino criopreservado com dois diluentes a base de Tris e um diluente à base de leite desnatado Diluentes Motilidade progressiva Espermatozóides vivos 2 Tris (224 mm) 69,29 ± 6,76 a 63,12 ± 4,64 a Tris (150 mm) 37,40 ± 5,76 b 34,86 ± 6,50 b Leite desnatado 23,39 ± 6,58 c 23,22 ± 8,23 c Sêmen fresco 1 89,05 ± 3,76 86,58 ± 6,08 1 Sem diluir Com acrossoma intacto a,b,c Letras diferentes dentro da mesma coluna indicam diferenças significativas (p<0.05) Fonte: Adapatado de SANDOVAL et al. (2007). Na segunda etapa os autores testaram quatro combinações de agentes crioprotetores, sendo um permeável e outro não permeável: Glicerol Trealose, Glicerol Sacarose, Etilenoglicol Trealose e Etilenoglicol Sacarose. Observase que, independentemente do tipo de crioprotetor não permeável (Trealose ou Sacarose), a qualidade seminal após o descongelamento foi estatisticamente maior para os grupos que utilizaram o glicerol como crioprotetor permeável (Tabela 8). Segundo os autores, o fato dos espermatozóides ovinos apresentarem

24 18 uma maior susceptibilidade aos efeitos tóxicos do etilenoglicol pode ter sido devido à concentração utilizada (2,25%). TABELA 8 - Valores médios após descongelamento de sêmen ovino criopreservado com quatro combinações de agente crioprotetores permeáveis e não-permeáveis Motilidade Espermatozóides Integridade de Crioprotetores progressiva vivos 2 membrana Glicerol+Trealose 64,1 ± 4,8 a 57,8 ± 6,9 a 62,5 ± 2,8 a Glicerol+Sacarose 64,2 ± 5,4 a 55,7 ± 6,1 a 59,6 ± 1,3 a Etilenoglicol+Trealose 44,1 ± 4,3 b 37,5 ± 3,9 b 40,3 ± 8,3 b Etilenoglicol+Sacarose 48,5 ± 3,5 b 41,5 ± 4,1 b 37,5 ± 3,6 b Sêmen fresco 1 83,6 ± 7,8 82,5 ± 2,7 66,9 ± 3,6 1 Sem diluir Com acrossoma intacto a,b,c Letras diferentes dentro da mesma coluna indicam diferenças significativas (p<0.05) Fonte: Adaptado de SANDOVAL et al. (2007). Em contrapartida, MORAES et al. (1998) e BRISOLA et al. (1999) avaliaram o efeito do etilenoglicol em substituição ao glicerol como agente crioprotetor e concluíram que o sêmen ovino criopreservado com etilenoglicol na concentração de 0,5 mm proporciona motilidade e vigor semelhante ao glicerol, porém é mais eficiente para preservar a integridade das membranas espermáticas. O etilenoglicol apresenta melhor proteção às membranas espermáticas devido à sua maior velocidade de penetração celular, proporcionando uma diminuição da alta concentração de sais no interior do espermatozóide (MORAES et al., 1998). SILVA et al. (2006) avaliaram o efeito da dimetilformamida, associada ou não ao glicerol, como crioprotetor para congelamento de sêmen de caprinos, e não observaram diferença estatística entre os tratamentos (7% de glicerol; 3,5% de glicerol e 3,5% de dimetilformamida; 5% de dimetilformamida) para motilidade espermática e vigor, analisados em testes in vitro. Os tratamentos também tiveram a mesma eficiência na manutenção da integridade celular, indicando que a DMF pode ser utilizada como agente crioprotetor em sêmen de caprinos. Ao testar a influência da dimetilformamida (DMF), associada ou não ao glicerol (GLY), na efetividade da criopreservação de sêmen de ovinos, MOUSTACAS et al. (2011) observaram que, com o aumento da concentração de

25 19 DMF, houve redução significativa na qualidade seminal in vitro (motilidade, parâmetros cinéticos e integridade de membrana) após a criopreservação, conforme demonstrado na Tabela 9. A dimetilformamida não produziu efeitos tóxicos imediatamente ao ser adicionado, porém, após a descongelação a motilidade espermática foi significativamente reduzida nos tratamentos que continham DMF em relação ao tratamento controle (5% Glicerol). TABELA 9 - Média e desvio-padrão da motilidade espermática pré e pós a criopreservação e integridade de membrana plasmática de sêmen criopreservado com diluidor a base de Tris-gema contendo glicerol, diferentes proporções de DMF/GLY e somente DMF Crioprotetor (%) Motilidade précongelamento (%) Motilidade póscongelamento (%) Integridade de Membrana Plasmática (%) 5GLY 1 73,3 ± 3,2 43,9 ± 6,4 16,6 ± 5,3 4GLY-1DMF 2 71,1 ± 4,8 26,9 ± 3,1* 8,0 ± 2,6 3GLY-2DMF 3 73,9 ± 3,9 2,6 ± 0,9* 3,1 ± 0,8* 2GLY-3DMF 4 70,0 ± 5,8 1,4 ± 0,5* 8,7 ± 6,4 1GLY-4DMF 5 70,0 ± 4,7 0,7 ± 0,3* 1,4 ± 0,3* 2DMF 6 75,0 ± 2,6 1,2 ± 0,5* 3,0 ± 0,8* 3DMF 7 73,3 ± 4,9 0,4 ± 0,1* 1,0 ± 0,5* 4DMF 8 75,6 ± 3,7 0,4 ± 0,1* 1,2 ± 0,5* 5DMF 9 64,4 ± 7,2 0,1 ± 0,1* 1,0 ± 0,2* 1 5% GLY (Controle); 2 4%GLY/1%DMF; 3 3%GLY/2%DMF; 4 2%GLY/3%DMF; 5 1%GLY/4%DMF; 6 2%DMF; 7 3%DMF; 8 4%DMF; 9 5%DMF. Asterisco na mesma coluna significa diferença entre os tratamentos e o grupo controle (p<0,05). Fonte: Adaptado de MOUSTACAS et al. (2011). Segundo MOUSTACAS et al. (2011), a DMF não possui efeito crioprotetor satisfatório sobre o sêmen de ovinos como em outras categorias animais (caprinos, caninos, eqüinos e suínos) devido às diferenças existentes na estrutura da membrana espermática Inseminação artificial com sêmen criopreservado Apesar de encontrar no mercado equipamentos modernos para criopreservação de sêmen, a inseminação artificial com sêmen congelado só apresenta resultados satisfatórios de fertilização quando o sêmen é depositado diretamente no útero através de laparoscopia (LIMA et al., 2010). São vários os

26 20 fatores que afetam a sobrevivência do espermatozóide ovino criopreservado como: diluidor, concentração do crioprotetor, embalagem para o envasamento do sêmen, velocidade de congelação e descongelação, e, qualidade do sêmen destinado ao processo de criopreservação (SALAMON & MAXWELL, 2000). CRUZ JÚNIOR (2006) d escreveu as características morfológicas da cérvix de ovelhas da raça Santa Inês e encontrou cinco tipos de orifício externo, anéis com diâmetro pequeno e formato de funil e presença de fundos de saco entre os anéis, o que mostra a grande variação entre animais e a impossibilidade de transpor a cérvix com aplicadores convencionais. A cérvix constitui a primeira barreira no trânsito espermático, e apresenta como um fator limitante na migração dos espermatozóides da vagina até o útero (DRUART et al., 2009). Quando se utiliza a criopreservação associada à sincronização de estro em ovelhas, é necessário ultrapassar a cérvix e depositar o sêmen em região profunda do útero para se conseguir taxas de prenhez aceitáveis (ANEL et al., 2006). De acordo com ANEL et al. (2006), a inseminação artificial por laparoscopia possui limitação devido à sua complexidade, custo elevado (em comparação com o valor do animal), necessidade de técnicos treinados e problemas relacionados com o bem-estar animal, assim, a laparoscopia deve ser uma técnica utilizada até que as limitações da inseminação transcervical sejam contornadas. 2.4 Estresse oxidativo A perda de motilidade após o processamento do sêmen é decorrente principalmente do estresse oxidativo, o qual leva a formação de radicais livres, oxidantes e espécies reativas do metabolismo do oxigênio (ROS), e, a diluição ou lavagem do sêmen causa diminuição da concentração natural de antioxidantes, promovendo menor resistência das células a essas substâncias (MAIA & BICUDO, 2009). O manejo reprodutivo adotado na propriedade converge diretamente na capacidade produtiva dos animais, pois a permanência dos animais em condições de estresse e uma nutrição desbalanceada levam a um aumento da produção de

27 21 ROS e/ou redução da disponibilidade de antioxidantes, levando à redução nos índices reprodutivos (ANDRADE et al., 2010). Todos os sistemas biológicos formam os ROS quando na mitocôndria o oxigênio sofre redução tetravalente para a formação de H 2 0, formando os intermediários reativos como: superóxido (O - 2 ), hidroxiperoxila (HO + 2 ), hidroxila (OH + ), peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) e óxido nitroso (NO - ). Os organismos aeróbios forma e degradam às ROS, pois, pequenas quantidades são necessárias para o funcionamento das células e processo de fertilização, porém, quando produzidos em excesso sobrecarregam as defesas antioxidantes dos espermatozóides, prejudicando o funcionamento fisiológico das células devido ao estresse oxidativo (NORDBERG & ARNÉR, 2001). A produção de ROS ocorre normalmente nos indivíduos, por isso a manipulação do sêmen deve ser criteriosa para minimizar a produção de radicais oxidativos e proporcionar também proteção celular contra essas substâncias. A redução do estresse oxidativo e controle dos danos causados pela queda de temperatura devem ser elucidados para o aumento do potencial reprodutivo na espécie ovina. 2.5 Antioxidantes O plasma seminal ovino é um dos responsáveis pela manutenção da qualidade, pois possui substancias como proteínas (MOURA et al., 2010) e antioxidantes que protegem os espermatozóides de injúrias (HAFEZ & HAF EZ, 2004). Porém a lavagem realizada durante o processamento do sêmen reduz a capacidade protetora do plasma, assim, a adição de antioxidantes sempre é valida e necessária para manter e preservar a qualidade seminal. A célula possui dois sistemas de defesa antioxidante para se proteger dos efeitos deletérios da formação de ROS, um sistema enzimático e outro não enzimático. O complexo enzimático é formado pelas enzimas: a) superóxido dismutase (SOD), b) catalase (CAT), c) peroxiredoxinas (Prx), d) glutationa (GSH), e) glutationa redutase (GR) e f) glutationa peroxidase (GPx). O sistema não enzimático é conhecido por substâncias sintéticas e que são suplementados através da dieta, formados por compostos de baixo peso molecular, como

28 22 vitaminas C e E, selênio, ubiquinonas, ácido úrico e ácido lipóico (NORDBERG & ARNÉR, 2001). Os antioxidantes endógenos podem ser insuficientes contra os efeitos nocivos de ROS durante o armazenamento prolongado do sêmen, então, a adição de antioxidantes tem sido utilizado para melhorar a motilidade espermática e a integridade da membrana em sêmen manipulados (BUCAK & TEKIN, 2007). Em estudo realizado com caprinos por BUCAK et al. (2009), os autores observaram que a adição dos antioxidantes glutamina e ácido hialurônico melhoraram a motilidade espermática e integridade de membrana plasmática após o congelamento e descongelamento do sêmen. ÇOYAN et al. (2011) avaliaram o efeito da adição de dois antioxidantes, cisteína e ergotioneína, em diferentes concentrações (1 mm, 2 mm e 4 mm) sobre os parâmetros espermáticos após o descongelamento de sêmen de ovinos. De acordo com a Tabela 10, a adição de ergotioneína aumentou a motilidade, velocidade média de percurso (VMP) e velocidade linear (VLN), enquanto a adição de cisteína se mostrou mais eficiente na manutenção da integridade da membrana espermátcia e atividade mitocondrial (Tabela 1 1). De acordo com os dados, os autores concluíram que a ergotioneína e cisteína melhoraram, respectivamente, os parâmetros de motilidade e atividade mitocondrial após a criopreservação, porém, elucida que os efeitos dos antioxidantes devem ser estabelecidos também in vivo. TABELA 10 - Média e desvio padrão de motilidade, motilidade progressiva, velocidade média de percurso (VMP) e velocidade linear (VLN) de sêmen ovino acrescido de diferentes antioxidantes e submetidos a criopreservação Grupos Motilidade % Motilidade Progressiva % VMP (μm/s) VLN (μm/s) Controle 69,0 ± 2,3 bc 19,6 ± 1,1 a 109,7 ± 2,6 a 97,6 ± 2,8 bc Cisteína 1 mm 74,3 ± 2,0 abc 20,7 ± 1,7 ab 105,6 ± 3,2 a 90,0 ± 3,1 cd Cisteína 2 mm 72,5 ± 2,8 abc 15,3 ± 1,8 bc 103,5 ± 1,8 a 87,1 ± 1,4 d Cisteína 4 mm 67,5 ± 4,3 c 16,1 ± 1,8 d 105,3 ± 3,7 a 85,8 ± 3,5 d Ergotioneína 1 mm 78,1 ± 2,5 ab 25,9 ± 2,2 d 117,2 ± 2,0 b 103,7 ± 2,4 ab Ergotioneína 2 mm 81,3 ± 2,3 a 31,0 ± 2,7 cd 123,5 ± 1,1 b 108,8 ± 1,0 a Ergotioneína 4 mm 80,6 ± 2,9 a 32,4 ± 2,2 d 121,7 ± 1,6 b 105,6 ± 1,7 a P <0,05 <0,05 <0,001 <0,001 a,b,c,d Letras diferentes na mesma coluna demonstram diferenças significativas. Fonte: ÇOYAN et al. (2011).

29 23 TABELA 11 - Média e desvio padrão da integridade de membrana espermática, integridade acrossomal e atividade mitocondrial de sêmen ovino acrescido de diferentes antioxidantes e submetidos à criopreservação Grupos Integridade de Integridade Atividade Membrana % Acrossomal % Mitocondrial % Controle 60,4 ± 1,8 bc 36,42 ± 2,6 35,3 ± 7,0 bc Cisteína 1 mm 67,6 ± 3,8 ab 39,2 ± 2,6 66,6 ± 10,6 a Cisteína 2 mm 72,8 ± 6,9 a 34,5 ± 3,8 67,4 ± 6,1 a Cisteína 4 mm 60,7 ± 1,7 bc 40,0 ± 7,4 57,7 ± 19,3 ab Ergotioneína 1 mm 50,5 ± 3,6 c 36,6 ± 5,3 26,9 ± 5,8 c Ergotioneína 2 mm 51,6 ± 3,3 c 32,3 ± 5,8 28,5 ± 8,8 c Ergotioneína 4 mm 52,0 ± 2,8 c 28,7 ± 4,3 18,7 ± 6,6 c P <0,001 - <0,05 a,b,c Letras diferentes na mesma coluna demonstram diferenças significativas. Fonte: ÇOYAN et al. (2011). RUIZ et al. (2007) também avaliaram o efeito de dois antioxidantes para a criopreservação de sêmen de ovino. Foi utilizado um diluidor a base de Tris, acrescido dos antioxidantes Tempo (2,2,6,6 tetrametil -1-piperidiniloxil) e Tempol (4 -hidroxi 2,2,6,6 tetrametil-1-piperidiniloxil) em diferentes concentrações (0,5 mm; 1,0 mm e 2,5 mm). Conforme Tabela 12, a adição de 0,5 mm do antioxidante Tempo reduziu a perda de motilidade progressiva (78,9 ± 4,7) e integridade de acrossoma (69,9 ± 6,4) em relação ao grupo controle (66,9 ± 4,8 e 58,4 ± 5,6), contudo esse efeito não pode ser observado com o uso do antioxidante Tempol, que inclusive ocasionou redução na qualidade seminal. TABELA 12 - Média e desvio padrão da motilidade progressiva e integridade acrossomal de sêmen ovino criopreservado com diferentes concentrações de antioxidantes Tratamentos Motilidade Progressiva Integridade Acrossomal Sem antioxidante 66,9 ± 4,8b 58,4 ± 5,6b Tempo 0.5 mm 78,9 ± 4,7a 69,9 ± 6,4a Tempo 1.0 mm 66,1 ± 8,0b 57,5 ± 6,7b Tempo 2.5 mm 48,9 ± 4,5c 43,8 ± 5,0c Tempol 0.5 mm 45,1 ± 5,7c 40,4 ± 5,8c Tempol 1.0 mm 34,5 ± 4,7d 31,8 ± 4,9d Tempol 2.5 mm 21,7 ± 5,0e 22,7 ± 3,6e a,b,c,d,e Indicam diferenças significativas dentro da coluna (p<0,005) FONTE: RUIZ et al. (2007).