Determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 por imunoafinidade e cromatografia líquida com detecção por fluorescência.

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1 1.0 Objetivos e alcance O MET/LACQSA/BH/001 objetiva descrever os procedimentos analíticos a serem utilizados na determinação de aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2, e no registro dos dados relacionados às análises, para que estes possam ser corretamente seguidos. 1.1 Abreviações As abreviações das micotoxinas são conforme definições do DS/LACQSA/BH/024. CLAE = cromatografia líquida de alta eficiência DPR = RSD =CV =desvio padrão relativo FL = fluorescência LD = limite de detecção LQ = limite de quantificação MC = material crítico p.a. = para análise p.a.r. = para análise de resíduos PBS = solução tampão fosfato salina Rt = tempo de retenção TP = Pool de Trabalho U = incerteza expandida K = Fator de abrangência 2.0 Fundamentos Esta metodologia fundamenta-se na extração das aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2 das amostras por metanol: água (8:2, v/v); desengorduramento, quando necessário, utilizando hexano; purificação do extrato por coluna de imunoafinidade contendo anticorpos específicos para AFB 1, AFB 2, AFG 1 e AFG 2 ; eluição das aflatoxinas com metanol; separação, detecção e quantificação por CLAE-FL com derivatização pós coluna utilizando célula eletroquímica Kobra Cell. 2.1 Características do método Impresso por: Cópia não controlada Página 1/31

2 Este método foi desenvolvido, validado e otimizado pelo LACQSA, baseado nos estudos publicados por AOAC (1994), Stroka et al. (2000), AOAC (2008) e Stroka et al. (2000a). A validação do método foi orientada pelo Plano de Estudo PE 004 Determinação de aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2 por cromatografia líquida de alta eficiência e com derivatização. Os resultados dessa validação estão resumidamente expostos na Tabela 1. Este método foi revalidado utilizando os dados de análises de controles intralaboratoriais e de ensaios de proficiência realizados no período de 2008 a 2012 (ver dados na Análise Crítica AC ), no PE 078 Validação de limites de quantificação dos métodos de análise de micotoxinas e no seu respectivo Relatório e ainda no PE 089 Revalidação dos limites de quantificação dos métodos de análise das micotoxinas AFBG, DON, OTA e ZON e seu respectivo relatório, conforme Tabela 1. Parâmetros de Desempenho Veracidade Tabela 1: Parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de revalidação Critério/requisito Valor obtido Aprovação Ensaio de proficiência e análise de material de referência Ensaios de recuperação: (Critérios de aceitabilidade segundo DE/LACQSA/BH/029). < 1 µg/kg - 50 a 120% 1 a 10 µg/kg - 70 a 110 % e >10 µg/kg -80 a 110 Escore z aceitáveis Resultados encontrados para materiais de referencia do FAPAS e outros ensaios de proficiência dentro da faixa de aceitabilidade.dados de recuperação: de controles intralaboratorial dentro dos critérios de aceitabilidade Valores determinados dentro dos critérios de recuperação Toxina Faixa µg/kg Recuperação (%) AFB 1 0,43 a 15,23 83 a 93 AFB 2 0,096 a 2,83 82 a 96 AFG 1 0,42 a 14,45 85 a 92 AFG 2 0,088 a 2,84 78 a 87 Sim Sim Impresso por: Cópia não controlada Página 2/31

3 Tabela 1 (continuação): Parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de revalidação Precisão Equação de Horwitz Valores obtidos menores que 0,66 (dois terços) do valor de DPR (Repetibilidade) 1 0,5 log C de precisão intermediária em que Precisão intermediaria (Precisão Intermediária) RSD Nível (µg/kg) Horwiitz 2 c C / 10 9 µg kg Critérios de aceitabilidade (DE/LACQSA/BH/029). DPR% (repetibilidade) DPR (precisão intermediária) < > Valores obtidos menores que os previstos pela equação de Horwitz e menores que 22% (Thomson 2000). Toxina Faixa µg/kg DPR % AFB 1 0,43 a 15,23 19 a 11 AFB 2 0,096 a 2,83 24 a 7 AFG 1 0,42 a 14,45 14 a 7 AFG 2 0,088 a 2,84 19 a 5 Sim Sim Horrat Precisão adequada evidenciada por Horrat <1 Precisão intermediária adequada evidenciada por Horrat < 1 Sim Seletividade e Especificidade Ausência de interferentes no tempo de retenção (RT) Uso de coluna de imunoafinidade Ausência de interferentes no tempo de retenção (RT) de AFB 1, AFB 2, AFG 1 e AFG 2. Sim Faixa ótima de trabalho (µg/kg) Faixa da curva de calibração AFB 1 0,41 a 15,23 AFB 2 0,09 a 2,83 AFG 1 0,09 a 14,45 AFG 2 0,09 a 2,84 Aproximadamente: Para AFB 1 e G 1 : 0,00017 a 0.010µg/Ml. Para AFB2 e G2: a µg/ml Limite de detecção (g/kg) (k = 2,0) - AFB 1 AFB 2 AFG 1 0,20 µg/kg 0,05 µg/kg 0,20 µg/kg Sim AFG 2 0,05 µg/kg AFB 1 0,40 ± 0,32 µg/kg Limite de quantificação ± U (g/kg) AFB 2 AFG 1 0,10 ± 0,080 µg/kg 0,40 ± 0,30 µg/kg Sim (k = 2,0) AFG 2 0,10 ± 0,080 µg/kg AFBG U = ± 0,45 µg/kg* *O LQ de AFBG (total) será considerado o menor LQ (0,10 µg/kg) em caso de nenhuma toxina ser detectada em uma amostra. Neste caso, a incerteza (0,45 µg/kg) é a combinação das incertezas dos LQs para AFB 1, AFB 2, AFG 1 e AFG Aplicabilidade Impresso por: Cópia não controlada Página 3/31

4 O método validado é aplicável à determinação de aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2 para os grupos de matrizes e matrizes apresentados no DS/LACQSA/BH/ Reagentes, padrões, materiais e insumos Vidrarias e outros materiais de uso na rotina necessário à análise deverão ser solicitados à Unidade de Preparo de Material pelo preenchimento do formulário FOR/LACQSA/BH/025. Quando for identificada a necessidade da aquisição de materiais indisponíveis em estoque, seguir procedimentos descritos na IS/LACQSA/BH/ Vidraria em geral - conjunto (aparato) para filtração à vácuo com reservatório de 300 ml e base do funil de 47 mm com rolha para conexão ao kitasato; - balão volumétrico de 100 ml pode ser substituído por erlenmeyer ou proveta de 100 ml, pois o balão utilizado é somente para contenção do volume de 70 ml resultante da diluição do extrato da amostra com PBS; - béqueres de 50, 100, 400 e 600 ml; - bico de papagaio com reservatório de 100 ml ou dispositivo capaz de medir 100 ml; - erlenmeyer, com tampa, capacidade de 125 ou 250 ml; - frasco de vidro borossilicato, para padrão, transparente, reutilizável, com fundo duplo, fundo interno cônico capacidade de 5, 10 e 20 ml; - frasco para padrão, de vidro silanizado, âmbar com tampa sólida de rosca revestida com PTFE.capacidade de 2, 4, 7, 15 e 30 ml; - frascos de vidro borossilicato, âmbar ou transparente, capacidade de 1000, 2000 e 4000 ml, com tampas, para armazenamento das fases móveis dos cromatógrafos; - frascos de vidro com capacidade para aproximadamente 1 L, tipo Mason ou equivalente; - funil de haste curta com 7 cm de diâmetro; - kitasatos de 300 ou 500 e 1000 ml ou equivalente; - pipetas de Pasteur; - pipetas volumétrica de 10 ml calibrada, com erro máximo permitido de ± 0,02 (MC); - provetas graduadas de 10 ml; - provetas graduadas de 100 ml (MC); - provetas graduadas de 1000 ml; Impresso por: Cópia não controlada Página 4/31

5 - provetas graduadas de 25 ml; - provetas graduadas de 250 ml (MC); - provetas graduadas de 500 ml (MC); - seringas de polipropileno de 60 ml ou reservatório, tipo luer ou equivalente; - seringas de vidro de 10 ml, tipo luer ou equivalente; - tubo de centrífuga em polipropileno, capacidade de 50 ml, fundo cônico, com tampa de rosca. 3.2 Colunas e unidades filtrantes - colunas de imunoafinidade contendo anticorpos específicos para aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2 Easi Extract Aflatoxin marca R-Biopharm Rhône (MC); - membrana de fibra de vidro com 55 mm de diâmetro, 1 µm, tipo Whatman GF/B ou equivalente (MC); - membrana filtrante HÁ em éster de celulose, de 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa, para filtração de água; - membrana filtrante de poliamida; porosidade: 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa para filtração de solventes orgânicos; - papel de filtro qualitativo pregueado com 24 cm de diâmetro, ou equivalente, para filtração rápida. 3.3 Padrões e materiais de referência - materiais de referência certificados e padrões analíticos de aflatoxinas B 1, B 2, G 1, e G 2 (MC). 3.4 Materiais - adaptadores para tubos de 1, 3 e 6 ml, tipo bond elut ou equivalente; - anel de ferro com mufa; - barra magnética; - bastão, em vidro borossilicato; - bulbos conta-gotas; - cuba para recolher materiais limpos e utilizados; - olocae-te (dispensador); - espátulas; - fita parafinada; - garra para conexão das partes do aparato de filtração; Impresso por: Cópia não controlada Página 5/31

6 - garra com 3 hastes; - gás hélio, 5.0 analítico; - gás nitrogênio, industrial ou ar comprimido seco; - grades para tubos; - hélice de aço inoxidável; - papel alumínio; - papel toalha; - pêra de borracha ou pipetador automático ou equivalente; - pissetas; - pinça dupla; - ponteiras para micropipetas automáticas para as faixas de volumes de 20 a 100, 50 a 250, 100 a 1000 e 200 a 1000, 500 a 5000, 500 a 2500 e 1000 a µl; - torneiras de polipropileno ou teflon, tipo bond-elut, Varian ou equivalente. - coluna C18, 250 x 4,6 mm, partículas de 5 µm, Shimadzu que apresente perfil característico para o sinal de para aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2 e que atenda ao perfil cromatográfico previsto neste MET (MC); - frascos para injetor automático para cromatógrafo líquido de 1 ou 2 ml com tampa snap-cap ou equivalente; - pré-coluna de C18 com partículas de 5 µm ou equivalente, compatível com a coluna (MC); - membrana eletroquímica (kobra cell) para derivatização pós-coluna das aflatoxinas B 1 e G 1, (MC). 3.5 Reagentes, solventes e soluções Os reagentes, solventes e materiais devem ser avaliados e validados segundo a IS/LACQSA/BH/002 e deverão estar de acordo com os critérios de aceitabilidade do MET, conforme Tabela 1. Durante a validação do lote, a solução TP de AFBG a ser utilizada na fortificação deve ser transferida para metanol Reagentes e solventes - acetona p.a.r., anidro; - acetonitrila grau CLAE ou p.a.r (MC); - ácido nítrico, p.a.; - ácido sulfúrico, p.a.; - ácido sulfúrico grau UV (MC); - ácido fórmico p.a.; Impresso por: Cópia não controlada Página 6/31

7 - água tipo I é recomendada. Em caso da não disponibilidade de água tipo I usar tipo II ou água deionizada filtrada em membrana de 0,45 µm; - brometo de potássio p.a.; - cloreto de potássio grau p.a.; - cloreto de sódio grau p.a.; - dihidrogênio fosfato de potássio p.a. (fosfato de potássio monobásico, KH 2 PO 4 ); - etanol (álcool comercial); - hexano grau p.a.; - hidrogênio fosfato dissódio anidro grau p.a. (Fosfato de sódio bibásico, Na 2 HPO 4 ); - hipoclorito de sódio, 10-12%, NaClO; - iodo solúvel p.a.; - metanol grau CLAE ou p.a.r.; - metanol grau p.a.; - tween Soluções - ácido nítrico 4M; - metanol: água deionizada (160:15, v/v); - metanol: água deionizada (8:2, v/v); - metanol: água deionizada (2:3, v/v); - solução tampão PBS 0,1%; - 10% Tween 20 em PBS; Reagentes e soluções para cromatografia líquida - água deionizada: metanol: acetonitrila (60:20:20, v/v/v) + KBr + ácido nítrico (MC) fase móvel para utilização no sistema kobra cell; - solução de água deionizada: metanol: acetonitrila (65:20:15, v/v/v) desgaseificada em ultrassom (MC) fase móvel; - água deionizada: acetonitrila: metanol (6:2:2, v/v/v) fase móvel; - metanol: água deionizada (2:3, v/v) solvente de retomada das amostras e da curva de calibração; - solução de iodo derivatizante; Impresso por: Cópia não controlada Página 7/31

8 - soluções padrão para curva de calibração de AFB 1, AFB 2, AFG 1 e AFG 2 em metanol: água deionizada (2:3, v/v) (MC). 4.0 Equipamentos Utilizar os equipamentos observando os procedimentos descritos em suas respectivas Instruções de trabalho (IT), o status de calibração/qualificação na PLN/LACQSA/BH/001, os requisitos do DS/LACQSA/BH/003 e o fluxo de solicitação de serviços previsto no POP/LACQSA/BH/ Equipamentos críticos - balança de 2 casas decimais, com resolução 0,01g, calibrada; - balança de 4 casas decimais, com resolução 0,0001g, calibrada; - célula eletroquímica Kobra Cell para derivatização pós-coluna; - cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector de fluorescência; - micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 100 a 1000µL ou 200 a 1000µL, com menor divisão de escala de 2 µl; - micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 50 a 250µL ou 20 a 100µL ou 10 a 100µL com menor divisão de escala de 0,2 µl; - micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 500 a 2500µL com menor divisão de escala de 2 µl; - micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 500 a 5000µL com menor divisão de escala de 2 µl; - micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 1000 a 10000µL com menor divisão de escala de 2 µl; - sistema de purificação com controle individual de vácuo, com capacidade de manter um fluxo de 2mL/min; - termômetro ou termopar calibrados. 4.2 Equipamentos de suporte - agitador de tubos; - agitador magnético; - aparelho de ultrassom; - banho de aquecimento com agitação com controle da temperatura 40 C ± 10%; Impresso por: Cópia não controlada Página 8/31

9 - capelas de exaustão; - cronômetro temporizador digital; - freezer capacidade de atingir temperaturas -15 C; - geladeira capacidade de atingir temperaturas de 2 a 8 C; - homogeneizador de amostras com capacidade de atingir 800rpm; - sistema de filtração a vácuo; 5.0 Precauções analíticas Aflatoxinas apresentam toxicidade aguda e crônica, com potencial carcinogênico e genotóxico, relacionada a casos de câncer hepático em humanos (IARC, 1993). Seus padrões sólidos e suas respectivas soluções devem ser manipulados como substâncias tóxicas. Os padrões sólidos devem ser manipulados com extremo cuidado, devido à sua tendência de se dispersarem. Para os procedimentos relacionados às condições ambientais e segurança consultar o POP/LACQSA/BH/003. Todo o procedimento analítico deve ser realizado em local apropriado, com precauções particulares como utilização de equipamentos de proteção individual (luvas, guarda-pó, máscaras, sempre que necessário, e sapatos fechados), evitando qualquer contato de padrões com a pele e/ou os olhos. Em caso de contato com a pele, lavar com solução de hipoclorito de sódio 1%, sabão e água em abundância e procurar assistência médica. Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH/003. Utilizar vidraria limpa, livre de detergente e resíduos e descontaminar o material utilizado ao final da análise, conforme o IP/LACQSA/BH/001. Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras, assim como das soluções padrões, incluindo vials novos utilizados nos cromatógrafos, deve ser tratada com ácido sulfúrico 2 mol/l, de acordo com os procedimentos descritos na IP/LACQSA/BH/001. Em casos de derrames acidentais de soluções padrões, descontaminar a área com solução de hipoclorito de sódio a 1%, deixar em contato por 10 minutos e adicionar solução de acetona a 5%. A manipulação de solventes e/ou reagentes, bem como de resíduos, das análises deve ser realizada com cuidado, considerando a natureza de cada um, a ficha de informação de segurança de produtos químicos (FISPQ) e o POP/LACQSA/BH/004. Impresso por: Cópia não controlada Página 9/31

10 A instalação de colunas cromatográficas deve ser feita utilizando um fluxo de 0,01 ml/min da fase móvel, para evitar a entrada de bolhas de ar nos detectores. Observa-se a saída de bolhas na saída da coluna e somente ao cessar a saída das bolhas e que a coluna pode ser conectada ao detector. Visando aumentar a vida útil das colunas cromatográficas de fase reversa (C18), pode-se usar pré-colunas de C18. Ao término das análises, lavar e armazenar a coluna em solventes orgânicos como metanol ou acetonitrila. Quando se observar anomalias referentes à simetria do sinal cromatográfico, separação e alteração de pressão, avaliar a possibilidade da troca inicial da pré-coluna. Se não, avaliar outros parâmetros cromatográficos. Se necessário, trocar a coluna. A manutenção do desempenho da coluna deve ser observada levando-se em consideração os parâmetros de resolução de pico, número de pratos teóricos e tempo de retenção. O FOR/LACQSA/BH/054 deverá ser preenchido a cada análise e deverá ser arquivado na pasta do cromatógrafo no qual a coluna foi instalada. 6.0 Procedimentos O analista deve verificar quais amostras deverão ser analisadas, inclusive aquelas para fins de controle de qualidade intralaboratorial, em acordo com o Responsável e conforme o POP/LACQSA/BH/009. As amostras devem ser solicitadas à URPA pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/024. Estas serão entregues acompanhadas das respectivas fichas de acompanhamento de amostras FOR/LACQSA/BH/012. O FOR/LACQSA/BH/010 deverá ser preenchido com os dados pertinentes. Caso sejam anexados registros da técnica de detecção ou folhas adicionais, estas deverão ser rubricadas e numeradas ao final da análise de forma que cada folha seja identificada com o número total de folhas e número da folha. No caso de realização de controle de reagente, seguir a IS/LACQSA/BH/002. Utilizar, preferencialmente, equipamentos e materiais listados nesse MET, sendo que outros podem ser utilizados desde que sua aplicabilidade tenha sido comprovada e o seu uso devidamente registrado nos formulários de análise. 6.1 Preparo de Soluções Os volumes e massas propostos para preparo das soluções reagentes podem ser ajustados para atender as necessidades das análises respeitando as devidas proporções Impresso por: Cópia não controlada Página 10/31

11 As soluções utilizadas, como fases móveis nos cromatógrafos, podem ter as proporções preparadas utilizando as bombas ou linhas dos equipamentos Antes de serem transferidas para os cromatógrafos as fases móveis devem ser desgaseificadas em ultrassom por 10 a 15 minutos para retiradas de bolhas de ar adsorvidas nas soluções - Água: metanol: acetonitrila (65:20:15, v/v/v) Adicionar 200 ml de metanol CLAE ou p.a.r e 150 ml de acetonitrila CLAE ou p.a.r em 650 ml de água deionizada, previamente filtrada em membrana de 0,45 m. - Água: acetonitrila: metanol (6:2:2, v/v/v) Adicionar 200 ml de metanol CLAE ou p.a.r., 200 ml de acetonitrila CLAE ou p.a.r. em 600 ml de água deionizada, previamente filtrada em membrana de 0,45 m. - Metanol: água (8:2, v/v) Adicionar 20 ml de água deionizada em 80 ml de metanol p.a. - Metanol: água (160:15, v/v) Adicionar 15 ml de água deionizada em 160 ml de metanol p.a. - Solução tampão (PBS) Transferir quantitativamente com água deionizada 0,20 g de fosfato de potássio monobásico; 1,20 g de fosfato de sódio bibásico anidro; 8,0 g de cloreto de sódio e 0,2 g de cloreto de potássio para um balão volumétrico de 1000 ml. Completar com água deionizada e homogeneizar. - Solução tampão de 10% tween 20 em PBS Adicionar 100 ml de tween 20 a 900 ml de PBS e homogeneizar cuidadosamente para evitar excesso de espuma - Solução de iodo (derivatizante) Dissolver 100 mg de iodo em 2 ml de metanol grau CLAE e transferir quantitativamente para um frasco apropriado âmbar; adicionar 200 ml de água deionizada; homogeneizar em ultra-som por 1 hora e agitador magnético por 30 minutos; filtrar utilizando membrana de 0,45 µm. Impresso por: Cópia não controlada Página 11/31

12 - Ácido nítrico 4 M Preparar a solução de ácido nítrico 4 M considerando a porcentagem e a densidade do ácido nos cálculos. Por exemplo: Para preparo de 100 ml da solução 4M, partindo de um ácido nítrico: d=1,4 g/ml, MM=63,01 e 65 %: Medir 28 ml (27,7 ml) do ácido e adicionar a 72 de água deionizada. - Água: acetonitrila: metanol (6:2:2, v/v/v) + KBr + ácido nítrico Adicionar 400 ml de metanol CLAE ou p.a.r, 400 ml de acetonitrila CLAE ou p.a.r em 1200 ml de água deionizada. Adicionar 240 mg de KBr e 700 µl de ácido nítrico 4M à 2000 ml da fase móvel água: acetonitrila: metanol (6:2:2, v/v/v), filtrar e em seguida desgaseificar em ultrassom por 10 a 15 minutos Preparo da solução padrão de aflatoxinas As soluções padrão de aflatoxinas (estoque, intermediária e trabalho) devem ser preparadas conforme procedimentos descritos no IP/LACQSA/BH/003. Durante a manipulação das soluções padrões: - Retirar os frascos do freezer para ambientação da temperatura, oloca-los em suportes adequados e em ambiente protegidos da luz. - Homogeneizar a solução padrão antes da retirada da alíquota desejada. - Ao abrir o frasco de solução padrão para retirada da alíquota desejada, fazê-lo sempre em capela, com a guilhotina abaixada, porém com a exaustão desligada. - Após retirada da alíquota desejada da solução padrão, selar imediatamente o frasco e retorná-lo para armazenamento no freezer. Os cálculos utilizados no preparo deverão ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/013, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados Curva de calibração CLAE Impresso por: Cópia não controlada Página 12/31

13 Os cálculos utilizados no preparo das soluções para a curva de calibração devem ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/018, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados. Pipetar utilizando micropipeta um volume conhecido da solução trabalho pool e transferir para um frasco apropriado para o preparo da primeira solução da curva de calibração (P 1 ). Evaporar o padrão sob fluxo de N 2 ou ar comprimido seco, cuidando para que o solvente não seque completamente. Observar a proporção do solvente de retomada e adicionar metanol CLAE ou p.a.r., com agitação por 5 minutos em agitador de tubos, seguido de um minuto no ultrassom. Em seguida adicionar água para obtenção da proporção do solvente. Por exemplo: considerando que o padrão será redissolvido em 10 ml de metanol: água (2:3, v/v) deve-se adicionar 4 ml de metanol e depois de devidamente homogeneizado adicionar 6 ml de água, podendo a adição de metanol ser realizado pela adição de 4 alíquotas de 1 ml, sendo realizado agitação por 2 minutos seguida de transferência para outro frasco. O preparo da solução padrão P 1 pode ser realizado 1 dia antes. Antes da injeção dos padrões proceder à avaliação da adequação das condições instrumentais. A aprovação de P 1 é feita conforme instruções contidas na IT/LACQSA/BH/001 para o preenchimento e avaliação da PLN/LACQSA/BH/061. Os demais padrões da curva de calibração (no mínimo 5 concentrações diferentes) serão preparados preferencialmente após aprovação de P 1 pela diluição do mesmo com metanol: água (2:3, v/v) (Tabela 2). Todas as soluções preparadas devem ser cuidadosamente homogeneizadas. Fazer a injeção em triplicata ou duplicata de todas as soluções preparadas de forma aleatória e avaliar a aceitabilidade da curva conforme a IT/LACQSA/BH/001. Tabela 2: Faixas de concentrações aproximadas para o preparo da curva de calibração de AFBG CLAE/FL Padrão preparado Concentração (µg/ml) AFB 1 AFB 2 AFG 1 AFG 2 AFBG P 1 0, , , , ,02400 P 2 0, , , , ,01200 Impresso por: Cópia não controlada Página 13/31

14 P 3 0, , , , ,00510 P 4 0, , , , ,00310 P 5 0, , , , ,00162 P 6 0, , , , ,00094 P 7 0, , , , ,00061 P 8 0, , , , ,00044 A curva de calibração aprovada (as soluções) tem o prazo de validade de um mês para uso nas análises da rotina. Se no período de um mês houver necessidade de preparar uma nova solução padrão trabalho deve-se preparar também uma nova curva de calibração. Durante o prazo de validade de 1 mês, caso não se prepare nova curva analítica, a curva já preparada pode ser usada e deve ser avaliada a cada análise, segundo os critérios descritos na IT/LACQSA/BH/001, à exceção da aprovação de P1, a qual é feito quando de seu preparo. Nota 1: As curvas de calibração de micotoxinas feitas a partir de Materiais de Referência Certificados não serão descartadas mensalmente, desde que sejam avaliadas para demonstração de que as mesmas se mantém estáveis. O procedimento de avaliação das curvas está descrito na IT/LACQSA/BH/001. O preparo de soluções da curva de calibração na faixa de concentração conforme proposto na Tabela 2 resulta na faixa de contaminação de aflatoxinas nas amostras analisadas conforme apresentada na Tabela 3 desde que as amostras sejam processadas exatamente como descrito e considerando as seguintes particularidades: - preparo de amostras: a seco, em pasta na proporção de (1: 1, p/p) e (1:1,5, p/p); - volume do solvente de extração de 300 ml, 250 ml, 260 ml e 100 Ml; - massa de amostra de 25, 50 a seco e de 50 e 40 gramas respectivamente para pasta (1:1, p/p) e pasta (1:1,5, p/p) após descontar a massa da água. Tabela 3: Faixas de contaminação de AFBG na amostra considerando curva de calibração, preparo da amostra e volume de extração 50g amostra Extração 300mL amostra seca 50g amostra Extração 250mL proporção 1:1 AFB 1 e AFG 1 AFB 2 e AFG 2 AFBG 40g amostra Extração 260mL proporção 1:1,5 25g de pimenta amostra Extração 100mL l 50g amostra Extração 300mL amostra seca 50g amostra Extração 250mL proporção 1:1 40g amostra Extração 260mL proporção 1:1,5 25g de pimenta amostra Extração 100mL 50g amostra Extração 300mL amostra seca 50g amostra Extração 250mL proporção 1:1 40g amostra Extração 260mL proporção 1:1,5 25g de pimenta amostra Extração 100mL Impresso por: Cópia não controlada Página 14/31

15 18,00 15,00 19,50 24,25 3,60 3,00 3,90 4,95 43,20 36,00 46,80 58,14 9,00 7,50 9,75 12,12 1,80 1,50 1,95 2,47 21,60 18,00 23,40 29,07 3,60 3,00 3,90 5,10 0,99 0,83 1,07 1,04 9,18 7,65 9,95 12,24 2,16 1,80 2,34 2,85 0,63 0,53 0,68 0,58 5,58 4,65 6,05 6,84 1,01 0,84 1,09 1,42 0,45 0,38 0,49 0,29 2,92 2,43 3,16 3,41 0,60 0,50 0,65 0,83 0,24 0,20 0,26 0,17 1,69 1,41 1,83 2,00 0,42 0,35 0,46 0,57 0,13 0,11 0,14 0,11 1,10 0,92 1,19 1,38 0,31 0,26 0,33 0,42 0,09 0,08 0,10 0,08 0,79 0,66 0,86 1, Determinação de aflatoxinas As etapas para a análise de AFBG estão descritas de forma resumida nos Fluxogramas 1, 2 e 3. Fluxograma 1: Metodologia para análise de AFBG em amostras preparadas em pasta Impresso por: Cópia não controlada Página 15/31

16 Fluxograma 2: Metodologia para análise de AFBG em amostras preparadas a seco Pese 50 g da amostra preparada a seco. Adicione ~5g de NaCl e homogeneíze manualmente Adicione 300 ml de metanol: água (80:20, v/v) e em seguida, para amostras com alto teor de gordura adicione 100 ml de hexano etapa crítica ps: matrizes da categoria amêndoa liofilizadas ou de aspecto desidratado: adicionar a quantidade de água Aprovado prevista por: na solução de extração Eugênia da Azevedo toxina, deixar Vargas em contato por aproximadamente 30 a 60 minutos e, só após, Nilson César Castanheira adicionar o Guimarães solvente orgânico Impresso por: Cópia não controlada Página 16/31

17 Agite imediatamente por 3 min ~800rpm Filtre a mistura utilizando papel de filtro qualitativo pregueado e papel de fibra de vidro (1µm) ou equivalente utilizando um sistema de vácuo etapa crítica Transfira 10 ml do extrato para uma proveta ou balão volumétrico, diluir para 70 ml com tampão (PBS) e homogeneizar etapa crítica Conectar a coluna de imunoafinidade ao reservatório e passar o extrato diluído na coluna de imunoafinidade, previamente condicionada com solução tampão PBS,com um fluxo de 2mL/min etapa crítica Lavar a coluna com aproximadamente 15 ml de água deionizada e m seguida passar ar pela coluna para secar Adicionar 0,5 ml metanol (esperar 1 min) e adicionar 2 x 1,5 ml metanol e deixar eluir por gravidade etapa crítica Evaporar em banho maria com agitação a temperatura de 40 ºC, sob fluxo de nitrogênio ou ar comprimido seco etapa crítica. Retomar o resíduo com 3000 ou 500L de metanol:água (2:3, v/v), homogeneizar etapa crítica Injetar 50 L no CLAE, quantificar utilizando detector de fluorescência com derivatização utilizando kobra cell Fluxograma 3: Metodologia para análise de AFBG em pimenta-do-reino Impresso por: Cópia não controlada Página 17/31

18 Impresso por: Cópia não controlada Página 18/31

19 6.2.1 Extração Durante os procedimentos de extração descritos a seguir, observar atentamente as etapas críticas e os cuidados indicados para as diferentes matrizes. - Pesar as amostras à temperatura ambiente, considerando: 25 ± 0,10 g para amostras de pimenta-do-reino; 50 ± 0,10 g para amostras preparadas a seco; 100 ± 0,10 g para amostras preparadas em pasta, exceto castanha-do-brasil com casca; 50 ± 0,10 g da amostra de castanha-do-brasil com casca, em pasta. - Adicionar aproximadamente 5 g de cloreto de sódio e homogeneizar manualmente. Esta massa pode ser medida utilizando um medidor aferido e marcado para retirada da quantidade aproximada de 5 g de NaCl (Teste realizado e registrado no REL/LACQSA/BH/004 V.1). - Adicionar nas amostras o solvente de extração, considerando as particularidades: matrizes preparadas em pasta: adicionar 200 ml de metanol p.a. para amostras em pasta, exceto castanha-do-brasil com casca; castanha-do-brasil com casca, em pasta: adicionar 185 ml da solução de metanol: água (160:15,v/v); pimenta-do-reino: adicionar 100 ml de metanol: água (8:2, v/v). matrizes preparadas a seco: adicionar 300 ml de metanol: água (80:20, v/v) Para as matrizes da categoria amêndoa liofilizadas ou de aspecto desidratado, adicionar a quantidade de água prevista na solução de extração da toxina, deixar em contato por aproximadamente 30 a 60 minutos e, só após, adicionar o solvente orgânico (mantendo a proporção de solvente orgânico e água descrita acima). Após prosseguir com o procedimento de extração normalmente. Para matrizes com alto teor de gordura (amendoim, castanhas, manteiga de amendoim, pistache dentre outras), adicionar 100 ml de hexano. Impresso por: Cópia não controlada Página 19/31

20 - Homogeneizar por 3 minutos, a velocidade alta (aproximadamente 800 rpm) para todas as matrizes. Para pimenta do reino homogeneizar por 1 minuto. Impresso por: Cópia não controlada Página 20/31

21 - Filtrar o extrato através de papel de filtro qualitativo pregueado e em seguida filtrar à vácuo através de membrana de fibra de vidro Whatman GF/B 1 µm ou equivalente, utilizando aparato de filtração Diluição para todas as amostras, exceto castanha-do-brasil com casca: pipetar 10 ml do filtrado, adicionar 60 ml da solução tampão PBS e homogeneizar. castanha-do-brasil com casca: pipetar 2 ml do filtrado transferir para frasco apropriado e completar o volume para 100 ml com a solução tampão PBS (ver Nota 2). pimenta-do reino: pipetar 5 ml do filtrado, adicionar 50 ml da solução tampão de 10% Tween 20 em PBS e homogeneizar cuidadosamente para evitar excesso de espuma. Nota 2: amostras de pimenta-do-reino, castanha-do-brasil e amendoim somente podem purificadas utilizado coluna de imunoafinidade Easi Extract Aflatoxin marca R-Biopharm Rhône Purificação e eluição utilizando processo manual Purificação - Adaptar um reservatório (seringa de polipropileno de 60 ml) à coluna de imunoafinidade, utilizando um adaptador, e conectá-la a um sistema de vácuo com controle individual de fluxo. - Condicionar a coluna de imunoafinidade com aproximadamente 10 ml de solução tampão PBS com fluxo de aproximadamente 2 ml/min (ver nota 3). Nota 3: O fluxo de aproximadamente 2 ml/min é obtido por controle individual e depende do manifold utilizado. O fluxo de 2 ml/min pode ser obtido pela contagem de gotas por tempo e está devidamente identificado nos manifolds: 1 gota por segundo ou 1 gota a cada 2 segundos, conforme determinado nos Testes: 15 (18/06/13) 16 (28/06/13) e 17 (10/07/13) anexos a este MET. - Transferir o extrato diluído para a seringa (reservatório) conectada à coluna, deixar passar através desta com um fluxo 2 ml/min, mantendo o fluxo do início ao término da análise, não deixando a coluna secar etapa crítica. - Lavar a coluna de imunoafinidade com aproximadamente 15 ml de água deionizada, mantendo o fluxo de 2 ml/min, exceto para pimenta-do-reino. Para análise de pimenta-do-reino: lavar a coluna de imunoafinidade Impresso por: Cópia não controlada Página 21/31

22 com aproximadamente 20 ml de PBS, mantendo o fluxo de 2 ml/min durante a lavagem. - Deixar a coluna secar Eluição de todas as amostras, exceto pimenta-do-reino - Desconectar a coluna, substituir o reservatório (seringa de prolipropileno de 60 ml) por uma seringa de vidro de 10 ml e passar ar. - Adicionar 0,5 ml de metanol grau CLAE na coluna de imunoafinidade e deixar em contato com os anticorpos da coluna por 1 min etapa crítica. - Adicionar duas vezes o volume de 1,5 ml de metanol grau CLAE e deixar eluir manualmente por gravidade etapa crítica. - Passar ar pela coluna aplicando pressão positiva com o êmbolo da seringa. - Coletar o eluato em frasco apropriado (ver Nota 4). - Evaporar o eluato até obtenção de gotículas no fundo do frasco, sob atmosfera de nitrogênio ou ar comprimido, em banho de aquecimento com agitação a 40 o C etapa crítica. Nota 4: os eluatos das amostras devem ser coletados em frascos tratados com ácido ou silanizados, devem ser âmbar ou protegidos da luz com papel alumínio e devidamente identificados Eluição das amostras de pimenta-do-reino - Adicionar 1,5 ml de metanol grau CLAE na coluna de imunoafinidade, fazer pressão positiva para que o metanol entre em contato com o gel e deixar em contato com os anticorpos da coluna por 1 min etapa crítica. - Eluir as aflatoxinas mantendo o fluxo de 2 ml/min. E coletar o eluato em frasco apropriado (ver Notas 3 e 4) etapa crítica. - Adicionar 1,5 ml de água deionizada passar pela coluna mantendo o fluxo de 2 ml/min, coletando no mesmo frasco do primeiro eluato (ver Notas 3 e 4) etapa crítica. - Passar ar pela coluna aplicando pressão positiva com o êmbolo da seringa. - Homogeneizar o eluato e retirar uma alíquota de aproximadamente 500 µl para injeção no CLAE. Impresso por: Cópia não controlada Página 22/31

23 6.2.4 Separação, detecção e quantificação - Retomar os resíduos das amostras obtidos na etapa de purificação com a solução de metanol: água (2:3, v/v) e homogeneizar utilizando agitador de tubos ou ultrassom por aproximadamente 1 min, considerando os volumes etapa crítica: 3000 µl para resíduos obtidos de processos manuais (exceto castanha-do-brasil com casca); 500 µl para resíduos obtidos de processos manuais para castanha-do-brasil com casca; As amostras de pimenta-do-reino estão prontas para injeção após a eluição e homogeneização. - Injetar no CLAE soluções padrão e amostras nas condições cromatográficas especificadas para determinação de aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2 : Nota 5: Verificar o solvente do frasco de lavagem do auto injetor que deve ser preferencialmente a fase móvel ou solvente de composição e polaridade similar. coluna C 18, 25 cm de comprimento com partículas de 5 µm e 4,6 µm de diâmetro interno; pré-coluna de C 18 ; detector de fluorescência com excitação em 360 nm e emissão em 420 nm; fase móvel água: acetonitrila: metanol (6:2:2, v/v/v); fluxo da fase-móvel de 1,0 ml/min; volume de injeção de 50 µl; temperatura do forno da coluna de 40C; derivatização: Utilizando célula eletroquímica Kobra Cell: - fase móvel água: acetonitrila: metanol (6:2:2, v/v/v) + KBr + ácido nítrico. Nota 6: para Kobra cell, somente a fase móvel água: acetonitrila: metanol (6:2:2, v/v/v) poderá ser utilizada. Nota 7: Sistemas de derivatização com iodo, objeto da validação deste procedimento e constantes da revisão, poderão ser utilizados em caso de pane no kobra cell. - Fazer integrações das soluções padrão da curva de calibração e das amostras positivas. Impresso por: Cópia não controlada Página 23/31

24 - Armazenar os extratos brutos e os purificados, em freezer. - Calcular as concentrações de aflatoxinas presentes nas amostras (Rt aproximadamente de 10; 12; 14 e 17 minutos para AFG 2, AFG 1, AFB 2 e AFB 1, respectivamente) (Figuras 1, 2 e 3) utilizando a curva padrão de calibração dos padrões quando for a fase móvel água: metanol: acetonitrila (6:2:2, v/v/v). - Caso a leitura das amostras não esteja inserida na curva, diluir quantitativamente o extrato e injetar o extrato diluído Cromatogramas Cromatogramas obtidos utilizando sistema de derivatização kobra Cell Figura 1: Cromatograma obtido no cromatógrafo líquido n 674 no dia 17/09/2013, para solução padrão P1, da curva de calibração de AFBG: AFG 2 (Rt = 7,4 min); AFG 1 : (Rt = 8.9 min); AFB 2 : (Rt = 9,9 min) e AFB 1 : (Rt = 12,2 min). Impresso por: Cópia não controlada Página 24/31

25 Figura 2: Cromatograma obtido no cromatógrafo líquido n 674 no dia 13/09/2013, para amostra de milho naturalmente contaminada com AFB 1 e AFB 2 : AFB 2 : (Rt = 9,9 min) e AFB 1 : (Rt = 12,2 min). Figura 3: Cromatograma obtido no cromatógrafo líquido n 447 no dia 16/04/2013, para amostra de castanha-do-brasil naturalmente contaminada com AFBG: AFG 2 (Rt = 10,2 min); AFG 1 : (Rt = 12,3 min); AFB 2 : (Rt = 13,7 min) e AFB 1 : (Rt = 16,8 min). Impresso por: Cópia não controlada Página 25/31

26 7.0 Resultados 7.1 Cálculos Os níveis de contaminação das amostras deverão ser expressos em µg/kg, conforme legislação vigente. Os cálculos para determinação da contaminação de aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2 e aflatoxina total nas amostras analisadas deverão ser realizados utilizando a planilha PLN/LACQSA/BH/007 a qual considerou a Equação 1 para análises por CLAE. Equação 1: C CDCLAE = concentração de aflatoxina determinada pelo CLAE (µg/ml), V 1 = volume da solução de extração (ml), V 3 = volume de retomada do resíduo (µl), V 2 = volume do filtrado passado na coluna de imunoafinidade (ml), M 1 = massa da amostra extraída (g). 7.2 Reportagem de resultados Registrar diariamente os dados referentes ao controle intralaboratorial com amostras artificialmente contaminadas, naturalmente contaminadas ou com material de referência na PLN/LACQSA/BH/014 e na PLN/LACQSA/BH/015. Os resultados determinados para as amostras brancas e fortificadas deverão ser registrados no formulário FOR/LACQSA/BH/114 e devolvidos à URPA juntamente com os resultados das amostras analisadas. Em caso de amostras cegas, preencher a PLN/LACQSA/BH/011 e remetê-la ao Responsável. Os resultados das amostras analisadas somente poderão ser liberados se os resultados do controle intralaboratorial atenderem aos critérios de aceitabilidade em termos de recuperação e/ou desvio padrão conforme determinado na Tabela 1. A reportagem de resultados deve seguir as instruções contidas no DS/LACQSA/BH/022. Os casos em que há necessidade de reanálise também estão previstos nesse documento de suporte. Impresso por: Cópia não controlada Página 26/31

27 Considerar como NQ (não quantificado) os resultados inferiores ao limite de quantificação do método, conforme apresentado na Tabela 1. Após a verificação e liberação dos resultados das amostras analisadas, os mesmos deverão ser registrados no FOR/LACQSA/BH/012, que deverá ter todos os campos não utilizados fechados e após verificação deverão ser encaminhadas à URPA. 8.0 Responsabilidades As atribuições e responsabilidades e funções estão definidas na PLN/LACQSA/BH/020 e no DS/LACQSA/BH/ Referências Impresso por: Cópia não controlada Página 27/31

28 AOAC Association of Official Analytical Chemist, 1995, Natural Toxins. Official Methods of AOAC International. Chapter , pp , 16 th, AOAC Association of Official Analytical Chemist, Natural Toxins. Official Methods of AOAC International. Chapter , pp , 18 th edition. Current through revision 3, 2010, IARC International Agency for Research on Cancer, 1993, Aflatoxins, IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans: Some Naturally Occurring Substances, Food Items and Constituents, Heterocyclic Aromatics Amines and Mycotoxins (Lyon: International Agency for Research on Cancer), pp LISA L. BIRD, ROMAN GRYPA, MCCORMIC &CO., HUNT VALLEY, MD. Affinity columm cleanup and direct fluorescence Measurment of aflatoxins in spices. Thomsen J. Hansen, Nancy A. Zabe, VICAM, Watertown, MA. Plano de Estudo PE 004 Determinação de aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2 por cromatografia líquida de alta eficiência e com derivatização. SHOEMAKER, D. and TORCHIA, M. Appendix B: Laboratory Safety, AOAC, CD-Rom, STROKA J., ANKLAM E., JORISSEN, U., GILBERT, J Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste, fig paste and paprika powder: collaborative study. J. AOAC, 83, 2, STROKA J., ANKLAM E., NAGLER M., COKER R. 2000a. Standard operation procedure for the validation of a method for the determination of aflatoxins in corn and peanut meal by thin layer chromatography in combination with an immunoaffinity or solid phase clean-up. TRUCKSESS M. W., STACK M. E., NESHEIM S., PAGE S. W., ALBERT R. H., HANSEN, T. J., DONAHUE K. F Immunoaffinity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography postcolumn derivatization for determination of aflatoxins in corn, peanuts and peanut butter: collaborative study. J. AOAC, 74, 1, Documentos referenciados DE/LACQSA/BH/029-Regulamento Nº 401 da Comissão Europeia, de 23 de fevereiro de 2006 IP/LACQSA/BH/001-Descontaminação e preparo de material Impresso por: Cópia não controlada Página 28/31

29 IP/LACQSA/BH/003-Preparo e padronização de soluções padrões de micotoxinas IS/LACQSA/BH/002-Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções) IS/LACQSA/BH/005- Aquisição de Serviços e Suprimentos IT/LACQSA/BH/001-Uso das planilhas de rotina para emissão de resultados de análise POP/LACQSA/BH/002-Controle de equipamentos POP/LACQSA/BH/003-Acomodações e condições ambientais POP/LACQSA/BH/004-Gerenciamento de resíduos no laboratório POP/LACQSA/BH/009-Garantia da Validade dos Resultados 11.0 Anexos referenciados DS/LACQSA/BH/003-Requisitos para calibração, qualificação e verificação de equipamentos DS/LACQSA/BH/004-Escopo representativo do LACQSA - Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança Alimentar DS/LACQSA/BH/005-Descrição de Função DS/LACQSA/BH/011-Aquisição de materiais de consumo DS/LACQSA/BH/022-Reportagem de resultados DS/LACQSA/BH/024-Abreviação de analitos e parâmetros FOR/LACQSA/BH/010-Acompanhamento de análises de micotoxinas FOR/LACQSA/BH/012-Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas FOR/LACQSA/BH/024-Comunicado de recebimento e solicitação de amostras FOR/LACQSA/BH/025-Solicitação de material ao preparo FOR/LACQSA/BH/054-Controle de sistemas cromatográficos e colunas FOR/LACQSA/BH/114-Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle PLN/LACQSA/BH/001-Plano de equipamentos PLN/LACQSA/BH/007-Resultado Analítico de Aflatoxina BG por CLAE PLN/LACQSA/BH/011- Controle Intralaboratorial - Amostra cego PLN/LACQSA/BH/013-Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas PLN/LACQSA/BH/014-Carta de Controle - Amostras naturalmente contaminadas PLN/LACQSA/BH/015-Carta de Controle - Amostras fortificadas PLN/LACQSA/BH/018-Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos PLN/LACQSA/BH/020-Matriz de competência PLN/LACQSA/BH/061-Avaliação da Curva de Calibração para Micotoxinas REL/VAL/LACQSA/004-Determinação de aflatoxina B1, B2, G1 e G2 e ocratoxina A em amêndoa de cacau por cromatografia líquida de alta eficiência e cromatografia líquida de ultra eficiência (ampliação de escopo do método MET/LACQSA/BH/003) 12.0 Informações de registro Acompanhamento de análises de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/010) Avaliação da Curva de Calibração (PLN/LACQSA/BH/061) Carta de controle - amostras fortificadas (PLN/LACQSA/BH/015) Carta de controle - amostras naturalmente contaminadas (PLN/LACQSA/BH/014) Comunicado de recebimento e solicitação de amostras (FOR/LACQSA/BH/024) Controle de colunas cromatográficas - CLAE (FOR/LACQSA/BH/054) Impresso por: Cópia não controlada Página 29/31

30 Controle intralaboratorial - Amostra cego (PLN/LACQSA/BH/011) Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos (PLN/LACQSA/BH/018) Matriz de competência (PLN/LACQSA/BH/020) Plano de equipamentos (PLN/LACQSA/BH/001) Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas (PLN/LACQSA/BH/013) Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle (FOR/LACQSA/BH/114) Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/012) Resultado analítico de aflatoxina BG por CLAE - Incerteza de medição (PLN/LACQSA/BH/007) Solicitação de material ao preparo (FOR/LACQSA/BH/025) 13.0 Arquivos anexados Análise Crítica AC 025/2012. Análise Crítica AC 067/2013. Análise Crítica AC 068/2013. Memorando Interno 027/2013. Plano De Estudo PE078 Validação de limites de quantificação dos métodos de análise de micotoxinas. Plano De Estudo PE089 Revalidação dos limites de quantificação dos métodos de análise das micotoxinas AFBG, DON, OTA e ZON. Relatório do PE078 Validação de limites de quantificação (LQ) e definição dos critérios de aceitabilidade da Curva de Calibração para os métodos analíticos para micotoxinas. Relatório do PE089 Revalidação dos limites de quantificação dos métodos de análise das micotoxinas AFBG, DON, OTA e ZON. Teste 15 de 18/06/2013. Teste 16 de 28/06/2013. Teste 17 de 10/07/ Controle de alterações Item 1.1 Inseridas as siglas p.a. e p.a.r. Alteração Impresso por: Cópia não controlada Página 30/31

31 2.1 Inserida menção ao DE/LACQSA/BH/ Inserida referência à PLN/LACQSA/BH/ Notas 2 e 3 foram incorporadas no corpo do texto e deixaram de ser Notas Retirada a informação de fluxo de 1 gota por segundo ou 2 gotas por segundo, mantendo apenas a informação contida na Nota 5, que é a correta, de 1 gota por segundo ou 1 gota a cada 2 segundos. O procedimento não foi executado de maneira errônea porque a informação consta nos manifolds e os técnicos já foram devidamente treinados no procedimento. 7.2 Substituída a referência do FOR/LACQSA/BH/032 para PLN/LACQSA/BH/ Retirada referência do DS/LACQSA/BH/001 e incluída referência à PLN/LACQSA/BH/ Retirada referência do DS/LACQSA/BH/001 e FOR/LACQSA/BH/032 e incluídas as referência às PLN/LACQSA/BH/001, PLN/LACQSA/BH/020 e PLN/LACQSA/BH/011. Incluída referência às PLN/LACQSA/BH/001, PLN/LACQSA/BH/011, PLN/LACQSA/BH/020. Retirado FOR/LACQSA/BH/ Feita referência aos arquivos anexados (retirados do item 9.0). - Retirado o item Documentos Relacionados Impresso por: Cópia não controlada Página 31/31