Código: MET/LACQSA/BH/011 - V.4 Fase: Vigente Aprovado em: 04/06/2018

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1 1.0 Objetivos e alcance O MET/LACQSA/BH/011 objetiva descrever os procedimentos analíticos a serem utilizados na determinação de fumonisinas B 1 e B 2 e no registro dos dados relacionados às análises, para que estes possam ser corretamente seguidos. 1.1 Abreviações CLAE = cromatografia líquida de alta eficiência; DPR = RSD = CV = desvio padrão relativo; FL = fluorescência; IAC = coluna de imunoafinidade; LD = limite de detecção; LQ = limite de quantificação; MC = material crítico; p.a. = para análise; p.a.r. = para análise de resíduos; PBS = solução tampão fosfato salina; R %= recuperação percentual; r 2 = coeficiente de correlação; TP = solução trabalho pool; U = incerteza expandida; URPA = Unidade de Registro e Preparo de Amostras; As abreviações relativas às micotoxinas constam no DS/LACQSA/BH/ Fundamentos Esta metodologia fundamenta-se na extração das fumonisinas B 1 e B 2 presentes nas amostras pela solução de acetonitrila: metanol: água (25:25:50, v/v/v), purificação do extrato por coluna de imunoafinidade contendo anticorpos específicos para fumonisinas; separação, detecção e quantificação das fumonisinas por CLAE-FL com sistema automatizado de derivatização pré-coluna. 2.1 Características do método Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 1/30

2 Este método foi desenvolvido, validado e otimizado pelo LACQSA/BH, com base nos estudos nos métodos oficiais AOAC (2001) e CSL (2008) com adaptações pertinentes à rotina, à capacidade operacional e à infraestrutura do LACQSA/BH. Os dados referentes à validação encontram-se no relatório de validação, no plano de estudo PE071 e nas planilhas eletrônicas. Os parâmetros determinados no processo de validação são apresentados na Tabela 1. Tabela 1: Parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de validação utilizando dados de controles analisados no período de janeiro de 2013 a outubro de 2013 Parâmetros de Desempenho Critérios/Requisitos Valor obtido Aprovação Faixa de aceitabilidade do material de Contaminação média de 6 replicatas obtidas em referência do FAPAS FB 1 : 319 a 980 µg/kg condições de precisão intermediária FB 1 : 825 µg/kg Sim FB 2 : 113 a 347 µg/kg FB 2 : 228 µg/kg Veracidade DE/LACQSA/BH/029: C 500 µg/kg 60 a 120% C > 500 µg/kg 70 a 110% Amostras fortificadas Toxina Faixa - µg/kg Recuperação (%) FB a a 91 FB a a 84 Sim Equação de Horwitz Precisão Repetibilidade DPR r (%) DPR Horwitz = 2 (1-0,5logC) em que C = C µg/kg x 10-9 Critérios de aceitabilidade (DE/LACQSA/BH/029) Valores obtidos dos dados de validação - amostras fortificadas Sim Nível - µg/kg DPR r - % DPR R -% Toxina Faixa - µg/kg DPR r -% DPR R - % Precisão (Reprodutibilidade intralaboratorial ou precisão intermediária 3 dias) DPR R (%) FB a ,4 a 10 6,9 a 9,1 > FB a ,4 a 10 5,2 a 8,2 Sim Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 2/30

3 Tabela 1 (continuação): Parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de validação utilizando dados de controles analisados no período de janeiro de 2013 a outubro de 2013 Parâmetros de Desempenho Critérios/Requisitos Valor obtido Aprovação Variação de Horrat de repetibilidade Horrat (repetibilidade) Horrat Precisão adequada evidenciada pelos valores de Horrat que devem ser idealmente próximos a 1. Toxina Faixa - µg/kg Horrat FB a ,65 a 2,19 FB a ,75 a 1,99 Variação de Horrat de reprodutibilidade Toxina Faixa - µg/kg Horrat Sim (reprodutibilidade) FB a ,28 a 1,97 FB a ,95 a 1,59 Parâmetros de desempenho cromatográfico Parâmetro Critério Parâmetro FB 1 FB 2 Retenção relativa: α>1 α 3,26 Resolução: R>2 R 11,88 Assimetria: T 1 T 1,04 1,05 Pratos teóricos: N 2000 ou maior N Sim A faixa de trabalho é a mesma faixa da curva pois toda faixa da curva é linear Faixa de trabalho FB 1 : 130 a 5000 µg/kg e FB 2 : 60 a 2410 µg/kg Toxina LD (µg/kg) Limite de detecção (µg/kg) - FB 1 93 FB 2 51 No máximo 1/5 do LMR Toxina LQ (µg/kg) Limite de quantificação FB 1 : 266 µg/kg FB (µg/kg) FB 2 : 133 µg/kg FB Sim Valores obtidos dos dados de validação (amostras Incerteza expandida U (µg/kg) - fortificadas) com k de aproximadamente 2 e com 95% de confiança. Todos estão dentro do critério de aceitabilidade Toxina Faixa (µg/kg) U (µg/kg) Sim FB a a 496 Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 3/30

4 FB a a 261 Toxina Faixa (µg/kg) U (µg/kg) Incerteza expandida no LQ - FB FB Soma (FB 1 +FB 2 ) - 65 Sim 2.2 Aplicabilidade O método validado é aplicável à determinação de fuminisinas B 1 e B 2 em grupos de matrizes constantes no DS/LACQSA/BH/ Reagentes, padrões, materiais e insumos Vidrarias e outros materiais de uso na rotina necessário à análise deverão ser solicitados à Unidade de Preparo de Material pelo preenchimento do formulário FOR/LACQSA/BH/025. Quando for identificada a necessidade da aquisição de materiais indisponíveis em estoque, seguir procedimentos descritos na IS/LACQSA/BH/ Vidraria em geral Nota 1: As vidrarias identificadas como MC deverão ser calibradas e/ou terem desempenho satisfatório na verificação de desempenho segundo procedimento específico do LACQSA. conjunto (aparato) para filtração a vácuo com reservatório e base do funil com filtro poroso para membrana filtrante de 47 mm de diâmetro, com rolha para conexão ao kitasato; balões volumétricos de 5 ml, âmbar, calibrados e/ou com avaliação de desempenho atualizada; balões volumétricos de 50 ml, preferencialmente âmbar, calibrados e/ou com avaliação de desempenho atualizada (MC); balões volumétricos de 100 ml; balões volumétricos de 1000 ml; béqueres de 50, 100 e 600 ml ou equivalentes; erlenmeyer de 250 ml de rosca esmerilhada com tampa de polipropileno; Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 4/30

5 frascos de vidro com capacidade para aproximadamente 1 L, tipo Mason ou equivalente; kitasatos de 500 e 1000 ml; pipetas de Pasteur; proveta graduada com volume nominal de 10 ml, com tolerância de ± 0,1 ml; proveta graduada com volume nominal de 100 ml, com tolerância de ± 0,5 ml; proveta graduada com volume nominal de 250 ml, com tolerância de ± 2 ml; proveta graduada com volume nominal de 500 ml, com tolerância de ± 2 ml; proveta graduada com volume nominal de 1000 ml, com tolerância de ± 3 ml; seringas de polipropileno de 50 ml, tipo luer ou equivalente; seringas de vidro de 10 ml, tipo luer ou equivalente; seringas de polipropileno de 3 ml; tubo de centrífuga em polipropileno, capacidade de 50 ml, fundo cônico, com tampa de rosca; tubos de ensaio de com capacidade para 4 ml de vidro, silanizados ou tratados com ácido sulfúrico. 3.2 Colunas e unidades filtrantes coluna de imunoafinidade com anticorpos específicos para FB 1 e FB 2 e FB 3 com capacidade para até 5000ng de FB 1 e FB 2 e recuperação 80% quando uma solução de metanol: PBS contendo aproximadamente 7 µg de fumonisina total for passada pela coluna (FUMONIPREP - VICAM ou R-Biopharm) (MC); membrana de fibra de vidro com 55 mm de diâmetro, 1 µm, tipo Whatman GF/B ou equivalente (MC); membrana filtrante HA em éster de celulose, de 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa, para filtração de água; membrana filtrante de poliamida; Porosidade: 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa para filtração de solventes orgânicos; papel de filtro qualitativo pregueado com 24 cm de diâmetro, ou equivalente, para filtração rápida. 3.3 Padrões e materiais de referência materiais de referência certificados, materiais de referência e padrões analíticos de fumonisinas B 1 e B 2, com massa mínima de 10 mg, Sigma ou equivalente, com pureza mínima de 90%. Soluções preparadas de MR ou MRC, de concentrações conhecidas podem ser utilizadas (MC). 3.4 Materiais de suporte Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 5/30

6 adaptadores para tubos de 1, 3 e 6 ml, tipo Bond elut, Varian ou equivalente; barra magnética; bastão, em vidro borossilicato; bulbos conta-gotas; cuba para recolher materiais limpos e utilizados; dispensette (dispensador) com capacidade mínima de 10 ml; espátulas; gás nitrogênio, industrial ou ar comprimido seco; garra para conexão das partes do aparato de filtração; grades para tubos; hélice de aço inoxidável; papel toalha ou guardanapo; parafilme; papel alumínio; pissetas; ponteiras para micropipetas automáticas, para as faixas de volumes de 20 a 100, 50 a 250, 100 a 1000 e 200 a 1000, 500 a 5000, 500 a 2500 e 1000 a µl; torneiras de polipropileno ou teflon, tipo bond- elut, Varian ou equivalente. 3.5 Material para quantificação por CLAE coluna de C18, 150 x 3,9 mm, partículas de 5 µm que apresente perfil característico para o sinal de fumonisina B 1 e B 2 e que atenda ao perfil cromatográfico previsto neste procedimento (MC); frascos para injetor automático para cromatógrafo líquido de 1,1 ml com fundo fino (ex: vial assy 1.1 ml SHIMADZU P/N ) com tampa e septo compatíveis com o injetor automático (Figura 1) (MC); frascos de reagentes para injetor automático para cromatógrafo líquido de 10 ml compatível com o rack nº 7 (frasco para reagente de derivatização, P/N , Figura 1); Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 6/30

7 Figura 1: Frasco para injetor automático de 1,1 ml com fundo fino com tampa e septo compatíveis com o injetor automático (à esquerda) e frasco de reagentes de 10 ml com tampa e septo para injetor automático compatível com o rack nº 7 (à direita). Nota 2: Os septos de marcas diferentes da marca do injetor automático do sistema CLAE utilizado (Shimadzu SIL- 10Dvp) podem causar danos à agulha do injetor automático. - pré-coluna de C18 com partículas de 5 µm ou equivalente, compatível com a coluna (MC). 3.6 Reagentes, solventes e soluções Reagentes e solventes 2-mercaptoetanol p.a.; acetonitrila grau p.a.; acetonilrila grau CLAE (MC); ácido fosfórico 85% - H 3 PO 4 (MC); água tipo I é recomendada. Em caso da não disponibilidade de água tipo I usar tipo II ou água deionizada, filtrada em membrana de 0,45 µm (MC); cloreto de potássio grau p.a KCl; cloreto de sódio grau p.a NaCl; dihidrogênio fosfato de potássio grau p.a. - KH 2 PO4 (MC); hidrogênio fosfato disódio anidro grau p.a. Na 2 HPO4; metanol grau CLAE (MC); metanol grau p.a.; o-ftalaldeído p.a. - OPA (MC); tetraborato de sódio decaidratado p.a. - Na 2 B 4 O 7.10H 2 O. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 7/30

8 3.6.2 Soluções acetonitrila: água (1:1, v/v) (MC); acetonitrila: metanol: água (25:25:50 v/v/v); solução tampão PBS; soluções padrão trabalho pool de fumonisinas B 1 e B 2 em acetonitrila: água (1:1, v/v) (MC); tampão com ph de 4,00 ± 0,05 para medidor de ph; tampão com ph de 7,00 ± 0,05 para medidor de ph Reagentes e soluções para cromatografia líquida - fase móvel: metanol: 0,1 mol/l dihidrogênio fosfato de potássio (70: 30, v/v) com ph corrigido para 3,35 ± 0,02 com H 3 PO 4 em phmetro (MC); - solução derivatizante OPA; - solução dihidrogênio fosfato de potássio (KH 2 PO 4 ) 0,1 mol/l; - solução de tetraborato de sódio 0,1 mol/l; - metanol: água (5:95, v/v) solução de lavagem do injetor automático e da bomba de pistão. 4.0 Equipamentos Utilizar os equipamentos conforme os procedimentos descritos nas suas respectivas instruções de trabalho (IT), na PLN/LACQSA/BH/001, no DS/LACQSA/BH/003 e no POP/LACQSA/BH/002, considerando a adequação dos instrumentos aos requisitos e especificações necessárias à adequada execução deste MET. 4.1 Equipamentos críticos balança de 2 casas decimais, com menor divisão de escala de 0,01g, calibrada; balança de 4 casas decimais, com menor divisão de escala de 0,0001g, calibrada; balões volumétricos de 50 ml preferencialmente calibrados e/ou com avaliação de desempenho atualizada; cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector de fluorescência e auto injetor programável para realização de derivatização; Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 8/30

9 micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 100 a 1000µL ou 200 a 1000µL, com menor divisão de escala de 2 µl; micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 1000 a 10000µL com menor divisão de escala de 2 µl ou pipeta volumétrica de 10 ml, calibrada e/ou com avaliação de desempenho atualizada; micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 50 a 250µL ou 20 a 100µL ou 10 a 100µL com menor divisão de escala de 0,2 µl; micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 500 a 5000µL com menor divisão de escala de 2 µl; phmetro digital com menor divisão de escala de 0,01 unidades de ph, calibrado; proveta com volume nominal de 250 ml, com menor divisão de escala de 1 ml, calibrada/ou com avaliação de desempenho atualizada; sistema de purificação com controle individual de vácuo, com capacidade de manter um fluxo de 2mL/min. 4.2 Equipamentos de suporte agitador de tubos; agitador magnético; aparelho de ultrassom; banho de aquecimento com agitação com controle da temperatura 50 C ± 10%; capelas de exaustão; centrífuga com capacidade de atingir a velocidade de rotação de aproximadamente 1200 xg e capacidade para utilizar tubos de 50 ml; cronômetro temporizador digital; freezer capacidade de atingir temperaturas -15 C; geladeira capacidade de atingir temperaturas de 2 a 8 C; homogeneizador de amostras com capacidade de atingir 1500 rpm; sistema de filtração a vácuo. 5.0 Precauções analíticas Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 9/30

10 Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH/003. Fumonisinas são substâncias consideradas nefrotóxicas, hepatóxicas e carcinogênicas em ratos. Efeitos no ser humano ainda não são completamente compreendidos. Seus padrões sólidos e suas respectivas soluções devem ser manipulados como substâncias tóxicas. Todo o procedimento analítico deve ser realizado em local apropriado, com precauções particulares como utilização de equipamentos de proteção individual (luvas, guarda-pó, máscara, sempre que necessário, e sapatos fechados), evitando qualquer contato de padrões com a pele e/ou os olhos. Em caso de contato com a pele, lavar com solução de hipoclorito de sódio 1%, sabão e água em abundância e procurar assistência médica. Utilizar vidraria limpa, livre de detergente e resíduos e descontaminar o material utilizado ao final da análise, conforme o IP/LACQSA/BH/001. Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras, assim como das soluções padrões, incluindo vials novos utilizados nos cromatógrafos, deve ser tratada com ácido sulfúrico 2 mol/l, de acordo com os procedimentos descritos na IP/LACQSA/BH/001. Em casos de derrames acidentais de soluções padrões, descontaminar a área com solução de hipoclorito de sódio a 1%, deixar em contato por 10 minutos e adicionar solução de acetona a 5%. A manipulação de solventes e/ou reagentes, bem como de resíduos, das análises deve ser realizada com cuidado, considerando a natureza de cada um, a ficha de informação de segurança de produtos químicos (FISPQ) e o POP/LACQSA/BH/004. A instalação de colunas cromatográficas deve ser feita utilizando um fluxo de 0,01 ml/min da fase móvel, para evitar a entrada de bolhas de ar nos detectores. Observa-se a saída de bolhas na saída da coluna e somente ao cessar a saída das bolhas e que a coluna pode ser conectada ao detector. Visando aumentar a vida útil das colunas cromatográficas de fase reversa (C 18 ), pode-se usar pré-colunas de C 18. Ao término das análises, lavar e armazenar a coluna em solventes orgânicos como metanol ou acetonitrila. Quando se observar anomalias referentes à simetria do sinal cromatográfico, separação e alteração de pressão, avaliar a possibilidade da troca inicial da pré-coluna. Se não, avaliar outros parâmetros cromatográficos. Se necessário, trocar a coluna. A manutenção do desempenho da coluna deve ser observada levando-se em consideração os parâmetros de resolução de pico, número de pratos teóricos e tempo de retenção. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 10/30

11 6.0 Procedimentos O analista deve verificar quais amostras deverão ser analisadas, inclusive aquelas para fins de controle de qualidade intralaboratorial conforme o POP/LACQSA/BH/009, em acordo com o Responsável. As amostras devem ser solicitadas à URPA pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/024. Estas serão entregues acompanhadas dos respectivos formulários de acompanhamento de amostras FOR/LACQSA/BH/012. O FOR/LACQSA/BH/010 deverá ser preenchido com os dados pertinentes. Caso sejam anexados registros da técnica de detecção ou folhas adicionais, estas deverão ser rubricadas e numeradas ao final da análise de forma que cada folha seja identificada com o número total de folhas e número da folha. No caso de realização de controle de reagente, seguir procedimentos descritos na IS/LACQSA/BH/002. O FOR/LACQSA/BH/054 deverá ser preenchido com todas as características de identificação da coluna cromatográfica (tipo de coluna, marca, lote, número, comprimento, diâmetro interno e tamanho da partícula) empregada e, a cada análise, com informações referentes à data da utilização, nome do analista, metodologia utilizada e número de injeções. O formulário deverá ser arquivado na pasta do cromatógrafo no qual a coluna foi instalada. 6.1 Preparo de soluções e materiais Os volumes e massas propostos para preparo das soluções reagentes podem ser ajustados para atender as necessidades das análises respeitando as devidas proporções Antes de serem transferidas para os cromatógrafos as fases móveis devem ser desgaseificadas em ultrassom por 10 a 15 minutos para retiradas de bolhas de ar adsorvidas nas soluções. - Acetonitrila: água (1:1, v/v) Adicionar 100 ml de acetonitrila grau CLAE em erlenmeyer de 250 ml com tampa e rosca esmerilhada e depois adicionar 100 ml de água deionizada previamente filtrada em membrana filtrante DAS em éster de celulose, de 0,45 µm de poro e homogeneizar. - Acetonitrila: metanol: água (25:25:50, v/v/v) Solvente de extração Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 11/30

12 Com auxílio de uma proveta, adicionar lentamente e com agitação 250 ml de acetonitrila p.a. e 250 ml de metanol p.a. em 500 ml de água deionizada em frasco apropriado e homogeneizar. - Metanol:água (5:95, v/v) Solução de lavagem do injetor automático Adicionar 5 ml de metanol grau CLAE em frasco apropriado para o injetor automático do cromatógrafo e depois adicionar 95 ml de água deionizada previamente filtrada em membrana filtrante DAS em éster de celulose, de 0,45 µm de poro e homogeneizar. Utilizar a mesma solução para a lavagem da bomba de pistão do cromatógrafo. - Solução tampão PBS Dissolver individualmente 0,20 g de dihidrogênio fosfato de potássio; 1,20 g de hidrogênio fosfato de disódio anidro; 8,0 g de cloreto de sódio e 0,2 g de cloreto de potássio em água deionizada e transferir para um balão volumétrico de 1000 ml, completar o volume e homogeneizar. - Solução dihidrogenofosfato de potássio 0,1 mol/l Dissolver 13,6 g de KH 2 PO 4.H 2 O em aproximadamente 600 ml de água deionizada e transferi-la para um balão volumétrico de 1000 ml, homogeneizar e completar o volume. - Solução metanol: dihidrogeno fosfato de potássio 0,1 mol/l (70:30, v/v) com ph 3,35 Fase Móvel Com o auxílio de uma proveta, adicionar 300 ml de solução de KH 2 PO 4 0,1 mol/l em frasco apropriado e em seguida adicionar 700 ml de metanol grau CLAE (nota-se aqui, a formação de um precipitado branco). Antes de ajustar o ph da solução é necessário realizar a verificação do desempenho do potenciômetro de acordo com a PLN/LACQSA/BH/087. Com auxílio de uma micropipeta ou pipeta de Pasteur, ajustar o ph da solução para 3,35 ± 0,02 com ácido fosfórico (H 3 PO 4 ) em potenciômetro com precisão de no mínimo 0,01 unidades de ph e sempre homogeneizando com um homogeneizador magnético (etapa crítica). Após a correção do ph, filtrar a solução em membrana filtrante de poliamida com porosidade de 0,45 µm. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 12/30

13 Micropipeta contendo H 3 PO 4 ATENÇÃO: A fase móvel é uma solução extremamente crítica para a qualidade dos resultados e por isso deve ser preparada cuidadosamente. A exatidão do ph é imprescindível para a solução, além da permanência constante da proporção entre metanol e a solução de dihidrogeno fosfato de potássio, por isso, recomenda-se o preparo da solução sem a utilização do sistema de exaustão das capelas e corrigir o ph em frasco de boca pequena. Eletrodo e termômetro Frasco contendo a fase móvel Agitador magnético phmetro Figura 2: esquema para aferição do ph da fase móvel - Solução de tetraborato de sódio 0,1 mol/l Pesar 3,8 g de tetraborato de sódio decahidratado (Na 2 B 4 O 7.10H 2 O), utilizando balança apropriada, transferir para um balão volumétrico de 100 ml e adicionar cerca de 90 ml de água deionizada previamente filtrada em membrana filtrante DAS em éster de celulose de 0,45 µm de poro e homogeneizar em ultrassom por 30 minutos (sal com dificuldade de dissolução) e por fim, aferir o volume do balão. - Solução derivatizante OPA Pesar 40 mg de OPA em frasco de reagentes compatível com o injetor automático do cromatografo, utilizando balança analítica de 4 casas decimais. Em seguida, com o auxílio de uma micropipeta, adicionar 1 ml de metanol grau CLAE e homogeneizar a solução por aproximadamente 1 minuto. Diluir a solução formada com 5 ml da solução tampão de tetraborato de sódio 0,1 mol/l, utilizando uma micropipeta. Com auxílio de uma micropipeta, adicionar 50 L de 2-mercaptoetanol e homogeneizar novamente. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 13/30

14 Acondicionar este reagente em frasco âmbar ou coberto por papel alumínio à temperatura de 5 15 C por um prazo de até uma semana. Trazer a solução para temperatura ambiente antes de sua utilização. - Solução de reagente silanizante (5:95, v/v) Preparar uma solução de dimetildiclorosilano: tolueno (5:95, v/v) ou de trimetildiclorosilano: tolueno (5:95, v/v) pela adição do reagente dimetildiclorosilano ou trimetildoclorosilano ao tolueno. Validade de 1 ano se conservada na faixa de temperatura de 2 C a 8 C, podendo neste período ser utilizada até 3 vezes (WHITE, 2004). - Silanização dos frascos e vials utilizados para armazenamento de extratos finais e padrões Para evitar a adsorção das fumonisinas pela parede dos frascos e assegurar a estabilidade das soluções preparadas, frascos de vidro silanizados devem ser utilizados. A silanização dos frascos pode ser feita de acordo com o procedimento: Preencher os frascos com a solução de dimetil ou trimetildiclorosilano: tolueno (5:95, v/v) e deixar em repouso por 20 minutos. Transferir a solução silanizante para um reservatório e etiquetar como primeiro, segundo ou terceiro uso. Enxaguar a vidraria silanizada com tolueno e em seguida com metanol grau CLAE. Após enxágue, encher cada frasco ou vial com metanol ou deixar sob imersão em metanol grau CLAE por 20 minutos. Descartar o metanol, enxaguar com acetona e deixar secar. Os frascos estão prontos para serem usados. Acondicioná-los adequadamente separados dos demais em embalagem devidamente etiquetados. A solução silanizante pode ser utilizada por até três vezes no período de um ano se armazenada em temperatura de 2 a 8 C Preparo de soluções padrão de fumonisina As soluções padrão de fumonisinas devem ser preparadas conforme procedimentos descritos na IP/LACQSA/BH/003. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 14/30

15 Os cálculos utilizados no preparo deverão ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/013, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados. Utilizar frascos tratados com ácido sulfúrico ou silanizados de volume adequado para preparo das soluções padrão. Os frascos devem ser âmbar ou protegidos da luz. Durante a manipulação das soluções padrões: - Retirar os frascos do freezer para ambientação da temperatura em ambiente protegidos da luz. - Homogeneizar a solução padrão antes da retirada da alíquota desejada. - Ao abrir o frasco de solução padrão para retirada da alíquota desejada, fazê-lo sempre em capela, com a guilhotina abaixada, porém com a exaustão desligada. - Após a retirada da alíquota desejada da solução padrão, selar imediatamente o frasco e retorná-lo para armazenamento no freezer Solução estoque As soluções estoque são preparadas pela pesagem da toxina sólida em balança analítica calibrada com divisão de escala mínima de 0,0001 g e a toxina pesada é dissolvida em acetonitrila: água (1:1, v/v), utilizando balão volumétrico calibrado ou micropipetas calibradas. O procedimento detalhado é descrito a seguir: - Retirar os frascos do freezer para ambientação da temperatura em ambiente protegidos da luz. - Utilizar pesa-padrão para realizar a pesagem da toxina. Esse pesa-padrão deve ser pesado três vezes consecutivas, anotando os valores de massa obtidos. - Sem tarar a balança, coloca-se o pesa-padrão na mesma e, com o auxílio de uma espátula pequena, inicia-se a pesagem da toxina. - Após a pesagem de toda toxina possível, o conjunto pesa-padrão e toxina devem ser pesados mais duas vezes. Esse procedimento é feito simplesmente colocando o conjunto pesa-padrão e toxina na balança, anotar a massa obtida, retirar o conjunto, esperar a balança estabilizar no zero, colocar o conjunto novamente na balança e anotar o próximo valor de massa. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 15/30

16 - Completada a etapa de pesagem, a massa da toxina deve ser transferida para balão volumétrico calibrado com uma pequena quantidade de solução acetonitrila: água (1:1, v/v). Caso balões calibrados no volume desejado não estejam disponíveis utilizar micropipeta calibrada. Nota 3: Recomenda-se que a concentração final da solução estoque seja próxima a 1000 µg/ml tanto para FB 1 quanto para FB 2. - Com a transferência de toda a toxina para o balão, este deve ser agitado em agitador de tubos e por fim aferese o volume do balão com acetonitrila: água (1:1, v/v) de maneira criteriosa e cuidadosa para não haver erros significativos na concentração final. A concentração da solução estoque a calculada pela Equação 1: C SE f m V T Equação 1 Em que: - C SE é a concentração da solução estoque em µg/ml - f é a pureza do padrão em porcentagem - m é a massa média do padrão pesado em gramas - V T é o volume total do balão volumétrico utilizado em ml. A massa média do padrão pesado (m) é calculada pela diferença entra a média da massa do conjunto pesapadrão e toxina e a média da massa do pesa-padrão vazio Solução trabalho concentrada e solução trabalho Após o preparo das soluções estoque de FB 1 e FB 2, estas poderão ser combinadas e estocadas para a formação de soluções pool de FB 1 e FB 2 simultaneamente. A combinação consiste na pipetagem, com o auxílio de uma micropipeta calibrada, de uma alíquota de cada solução estoque. O volume de pipetagem é escolhido de forma a obter-se uma concentração final de aproximadamente 100 µg/ml de FB 1 e 50 µg/ml de FB 2 em um volume de 5 ml de solução. Porém, ao invés de diluir a solução pool elaborada, esta será vedada com parafilme e armazenada em freezer e somente será diluída para uso na rotina (fortificação de amostras e prepara de curvas) ou seja, como não foram diluídas ainda, essas soluções são denominadas TP s concentradas. Esse procedimento é realizado para evitar o constante manuseio das soluções estoque e assim Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 16/30

17 evitando uma menor dispersão da concentração final obtida no preparo. O preparo consiste em: - Selecionar um frasco de TP concentrada do freezer e deixar atingir temperatura ambiente. - Transferir quantitativamente o volume contido no frasco de TP concentrada para um balão volumétrico calibrado que já contenha uma quantidade da solução acetonitrila: água (1:1, v/v). Nota 7: Para transferir quantitativamente o conteúdo do frasco de TP concentrada para o balão, pode-se utilizar uma micropipeta que tenha capacidade superior ao volume contido no frasco. Por exemplo, se há 650 µl no frasco, utilizar uma micropipeta de 1000 µl. Dessa forma, garante-se que todo o volume contido no frasco irá para a micropipeta (mais um pouco de ar) e este deve ser transferido cuidadosamente para o balão volumétrico de 5 ml. Recomenda-se lavar o frasco de TP concentrada com solução de acetonitrila: água (1:1, v/v) e transferir o solvente de lavagem para o balão volumétrico. - Homogeneizar a solução contida no balão utilizando um agitador de tubos, - Aferir o menisco do balão cuidadosamente utilizando a mesma solução de acetonitrila: água (1:1, v/v). A solução pode ser preparada utilizando micropipeta calibrada para diluição. - Transferir a solução preparada para frasco apropriado, rotular adequadamente e armazenar o padrão, vedado com parafilme, em freezer. Calcular as concentrações de FB 1 e FB 2 na solução TP preparada para cada toxina utilizando a Equação 2: Em que: C TP CSE V V T P Equação 2 - C TP é a concentração da solução trabalho (TP) em µg/ml - C SE é a concentração da solução estoque em µg/ml - V P é o volume pipetado da solução estoque para o preparo da TP concentrada, em ml - V T é o volume total do balão volumétrico utilizado em ml Solução padrão para a curva de calibração Os cálculos utilizados no preparo das soluções para a curva de calibração devem ser realizados utilizando a Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 17/30

18 PLN/LACQSA/BH/018, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrões, sejam inseridos nos campos apropriados. Pipetar, utilizando micropipeta calibrada, volume conhecido da solução trabalho pool de FB 1 e FB 2, transferir para frasco apropriado para o preparo da primeira solução da curva de calibração (P 1,) e diluir com acetonitrila: água (1:1, v/v) para atingir a concentração (em µg/ml) descrita na Tabela 2. Antes da injeção dos padrões proceder à avaliação da adequação das condições instrumentais. A aprovação de P 1 é feita conforme instruções contidas na IT/LACQSA/BH/001 para o preenchimento e avaliação da PLN/LACQSA/BH/061. Os demais padrões da curva de calibração serão preparados após aprovação de P 1, por diluição do mesmo com acetonitrila: água (1:1, v/v), de forma direta ou indireta para obter concentrações (em µg/ml) aproximadas daquelas apresentadas na Tabela 2. Tabela 2 Curva de calibração de fumonisinas Padrão Concentração após diluição com OPA (µg/ml) Concentração na amostra (µg/kg)* FB 1 FB 2 FB 1 FB 2 ( * ) Concentração calculada considerando que: 20 mg de amostra chega ao extrato final injetado, a concentração do padrão é diluída por um fator de 2 quando se adiciona o derivatizante e que 20 µl do extrato retomado é injetado. Fazer a injeção em triplicata ou duplicata de todas as soluções preparadas de forma aleatória e avaliar a aceitabilidade da curva conforme a IT/LACQSA/BH/001. A curva de calibração aprovada (as soluções) tem o prazo de validade de um mês para uso nas análises da rotina. Se no período de um mês houver necessidade de preparar uma nova solução padrão trabalho deve-se preparar também uma nova curva de calibração. P 1 5,00 2, P 2 4,00 2, P 3 3,00 1, P 4 2,00 1, P 5 1,00 0, P 6 0,50 0, P 7 0,25 0, P 8 0,13 0, Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 18/30

19 Durante o prazo de validade de 1 mês, caso não se prepare nova curva analítica, a curva já preparada pode ser usada e deve ser avaliada a cada análise, segundo os critérios descritos na IT/LACQSA/BH/001, à exceção da aprovação de P1, a qual é feito quando de seu preparo. As curvas de calibração de micotoxinas feitas a partir de Materiais de Referência Certificados não serão descartadas mensalmente, desde que sejam avaliadas para demonstração de que as mesmas se mantém estáveis. O procedimento de avaliação das curvas está descrito na IT/LACQSA/BH/ Determinação de fumonisinas FB 1 e FB 2 As etapas para a análise de fumonisinas FB 1 e FB 2 estão descritas de forma resumida no fluxograma (item 6.2.6) Extração - Pesar 25 ± 0,1 g da amostra, à temperatura ambiente, em um frasco tipo Mason etapa crítica. - Adicionar 125 ± 1 ml da solução de acetonitrila: metanol: água (25:25:50, v/v/v) etapa crítica. - Homogeneizar a mistura por 5 minutos à velocidade de aproximadamente 1440 rpm. - Coletar uma porção do extrato homogeneizado para um tubo de centrífuga de 50 ml até completar o volume do tubo e centrifugar a extrato por 10 minutos a uma velocidade de 2500 x g. - Filtrar o extrato através de papel de filtro qualitativo pregueado e em seguida filtrar através de membrana de fibra de vidro Whatman GF/B µm ou equivalente em um sistema de filtração à vácuo com kitasato de 500 ml e recolher o filtrado Diluição - Com o auxílio de uma micropipeta calibrada ou pipeta volumétrica preferencialmente calibrada retirar uma alíquota de 10 ± 0,1 ml do filtrado e transferir para um balão volumétrico de 50 ml- etapa crítica. - Aferir o volume do balão para 50 ml com solução tampão PBS e homogeneizar- etapa crítica. Nota 4: A diluição do extrato causa a formação de espuma no balão. Recomenda-se a adição gradativa da solução PBS para a melhor aferição do volume final. Portanto, não se deve homogeneizar vigorosamente o balão antes de aferir o menisco Purificação Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 19/30

20 - Adaptar um reservatório (seringa de polipropileno de 60 ml) à coluna de imunoafinidade, utilizando um adaptador, e conectá-la ao sistema de vácuo com controle individual de fluxo. - Com o auxílio de uma micropipeta calibrada ou pipeta volumétrica calibrada, transferir 10 ± 0,1 ml do extrato diluído para o reservatório conectado à coluna de imunoafinidade e deixar passar através da coluna com um fluxo aproximado de 2 ml/min, mantendo o fluxo do início ao término da análise, não deixando a coluna secar etapa crítica (ver Nota 5). - Lavar a coluna com 10 ml de solução PBS mantendo o fluxo de 2 ml/min (ver Nota 5). - Deixar passar ar pela coluna. Nota 5: O fluxo aproximado de 2 ml/min é obtido por controle individual e depende do manifold utilizado e do analista. O fluxo aproximado de 2 ml/min pode ser obtido pela contagem de gotas por tempo e está devidamente identificado nos manifolds: 1 gota por segundo ou 1 gota a cada 2 segundos, conforme determinado nos Testes: 15 (18/06/13) 16 (28/06/13) e 17 (10/07/13) Eluição - Desconectar a coluna do sistema de vácuo, conectá-la a uma seringa de vidro e aplicar pressão positiva para retirada de excesso de água do gel. - Adaptar cada coluna seca com torneiras de polipropileno ou teflon em um tubo de ensaio de vidro de 4 ml com o auxílio de uma estante para tubos (recomenda-se utilizar estantes que vem com os manifolds de purificação à vácuo). - Com o auxílio de uma micropipeta, transferir 1,5 ml de metanol grau CLAE para a coluna de imunoafinidade, realizar pressão positiva com uma seringa de vidro na coluna para que o metanol tenha um efetivo contato com o gel e deixar em contato por aproximadamente 1 minuto. - Eluir as fumonisinas controlando o fluxo aproximado de 2 ml/min por meio do êmbolo da seringa. Adicionar mais 1,5 ml de metanol grau CLAE (se necessário, ajustar o fluxo realizando pressão positiva com uma seringa de vidro na coluna) etapa crítica. - Evaporar o eluato até obtenção de gotículas no fundo frasco, sob atmosfera de nitrogênio ou ar comprimido seco, em banho de aquecimento com agitação a 50 o C etapa crítica Separação, detecção e quantificação Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 20/30

21 - Retomar os resíduos das amostras obtidos na purificação com 200 L de solução acetonitrila: água (1:1, v/v) e homogeneizar utilizando agitador de tubos ou ultrassom por aproximadamente 1 min etapa crítica. - Homogeneizar com agitador de tubos, à temperatura ambiente, por aproximadamente 1 minuto a solução derivatizante OPA no frasco de reagentes e inseri-lo no rack 7 do injetor automático. - Com auxílio de micropipeta calibrada, pipetar 50 ± 1 µl do extrato retomado ou padrão da curva em um frasco de injeção com fundo fino de 1,1 ml silanizado ou tratado com ácido sulfúrico compatível com o rack 7, ou com outro rack apropriado com o injetor automático do sistema cromatográfico etapa crítica. - Injetar no cromatógrafo líquido, soluções padrão para curva de calibração (Tabela 2) e amostras nas condições cromatográficas especificadas para determinação de fumonisinas. A injeção deve ser programada em sequência e deve ser elaborada conforme procedimentos específicos do cromatógrafo. Por exemplo para o cromatógrafo de número de registro 511_ , que tem como software de interface o Lcsolution. Neste equipamento, basta selecionar o método Fumonisinas.lcm que o sistema de derivatização précoluna será acionado automaticamente. Os parâmetros cromatográficos estão salvos no método, basta apenas o técnico estabilizar o instrumento aumentando gradativamente o fluxo da fase móvel (eluição isocrática) para o fluxo final de 1,0 ml/min. O método terá que conter os seguintes parâmetros: i. detector de fluorescência com excitação em 335 nm e emissão em 440 nm; ii. fluxo final de 1,000 ml/min; iii. temperatura do forno de 30 ºC; iv. tempo de corrida de 35 minutos Os demais parâmetros não devem ser alterados. Caso exista necessidade, entrar em contato com o Responsável e tomar as providências cabíveis - Programar os procedimentos para derivativação conforme cromatógrafo em uso. Por exemplo para o equipamento 511_ , verificar que na parte inferior da janela New sequence existe um campo denominado Autosampler (Figura 3) onde haverá uma entrada chamada Program file para selecionar o arquivo contendo a programação de derivatização automática do injetor e este encontra-se em C:\CLASS- VP\Autosampler com o nome de Derivatização_Fumonisinas.ape. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 21/30

22 Figura 3: Janela inicial para a programação de sequência de injeção do software CLASS-VP com indicação do campo para inserção do arquivo de derivatização 2. Seleciona-se a posição do primeiro e último vial (Start vial e End vial) e o volume de injeção que é 20 µl. Depois seleciona-se OK e conclui-se a elaboração da sequência de injeções. Após selecionar OK, haverá uma janela com uma série de linhas que representam cada corrida cromatográfica onde poderão ser alterados nomes, método, volume de injeção e diversos outros parâmetros da sequência. Nota 6: Caso seja necessária a injeção de uma única amostra ou padrão, o menu Control\Single Run também possui o campo Autosampler\Program file para inserir o arquivo de derivatização. - O sistema CLAE deve estar condicionado com: coluna C18, 150 mm de comprimento e 3,9 mm de diâmetro interno, com partículas de 5 µm; pré coluna de C18; fase móvel metanol:kh 2 PO 4 0,1 mol/l na proporção de 70:30 v/v e ph igual a 3,35 ± 0,02 corrigido com ácido fosfórico (H 3 PO 4 ); Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 22/30

23 - Armazenar os extratos brutos e os purificados, em freezer, porém os extratos retomados devem ser injetados imediatamente depois do processo de retomada (no mesmo dia) pois estes extratos possuem baixa estabilidade. As validades de algumas soluções específicas para este método estão representadas na Tabela 3. As demais soluções possuem prazos de validade descritos na IS/LACQSA/BH/002. Tabela 3: Resumo dos prazos de validade para soluções específicas deste MET Solução Prazo de Validade Observação Extrato eluído Extrato retomado Solução de tetraborato de sódio Solução derivatizante (OPA) 5 dias Tempo máximo que o extrato ficou armazenado em freezer a < -15 ºC e ainda se obteve bons resultados O extrato retomado deve ser injetado no mesmo dia que foi retomado, o 1 dia mais rápido possível, pois a estabilidade da toxina nesse tipo de extrato é muito baixa nos tubos de ensaio 1 mês Solução com pouco critério de desempenho e pouco significativa nos resultados finais 7 dias Indicação do método oficial AOAC, Integrar o sinal cromatográfico presente nas amostras e padrões (tempo de retenção aproximadamente de 11 minutos para FB 1 e 28 minutos para FB 2 ) Figuras 4 e 5. - Caso a área determinada para a amostra não esteja inserida na curva, diluir quantitativamente o extrato e reinjetar. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 23/30

24 Figura 4: Cromatograma da solução padrão P1 de concentração 5,0 µg/ml de FB 1 e 2,4 µg/ml de FB 2 obtida por injeção no sistema CLAE-FL. Figura 5: Cromatograma de amostra fortificada com solução padrão de de fumonisinas com concentração de aproximadamente 2300 µg/kg para FB 1 e 1000 µg/kg para FB Fluxograma Fluxograma da metodologia para análise de FB 1 e FB 2. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 24/30

25 7.0 Resultados 7.1 Cálculos Os níveis de contaminação das amostras deverão ser expressos em µg/kg, conforme legislação vigente. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 25/30

26 Os cálculos da contaminação de fumonisinas FB 1 e FB 2 nas amostras analisadas deverão ser realizados utilizando a planilha PLN/LACQSA/BH/078, a qual considerou a Equação 3 para análises por CLAE. Alterações nos procedimentos descritos neste método poderão ser efetuadas, desde que não comprometam o resultado da análise, devidamente autorizadas pelo Responsável e registradas na ficha de acompanhamento de análise. C FB Em que: C CLAE VextV M V a PBS VR ( Vder V V V dil pur der OPA ) Equação 3 C CLAE = Concentração de fumonisina (FB 1 ou FB 2 ) determinada pelo CLAE (µg/ml) V ext = Volume de solução usada na extração da amostra (ml) V R = Volume da solução usada para retomar o extrato evaporado (µl) V PBS = Volume total da diluição do extrato filtrado em solução PBS (ml) V dil = Volume de extrato filtrado que será diluído (ml) V pur = Volume de extrato diluído que é utilizado na purificação (ml) V der = Volume de extrato retomado utilizado para derivatização (µl) V OPA = Volume de solução derivatizante OPA adicionado ao extrato retomado (µl) M a = Massa de amostra pesada (g) 7.2 Reportagem de resultados Registrar diariamente os dados referentes ao controle intralaboratorial com amostras artificialmente contaminadas, naturalmente contaminadas ou com material de referência nas planilhas PLN/LACQSA/BH/014 e PLN/LACQSA/BH/015. Em caso de amostras cegas, preencher a PLN/LACQSA/BH/011. Os resultados determinados para as amostras brancas e fortificadas deverão ser registrados no formulário FOR/LACQSA/BH/114 e devolvidos à URPA juntamente com os resultados das amostras analisadas. Os resultados das amostras analisadas somente poderão ser liberados se os resultados do controle intralaboratorial atenderem aos critérios de aceitabilidade em termos de recuperação e/ou desvio padrão conforme determinado abaixo na tabela 1. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 26/30

27 A reportagem de resultados deve seguir as instruções contidas no DS/LACQSA/BH/022. Esse documento de suporte também trata dos casos em que é necessário realizar reanálise. Considerar como NQ (não quantificado) resultados inferiores ao limite de quantificação do método, conforme apresentado na Tabela 1. Após a verificação e liberação dos resultados das amostras analisadas, os mesmos deverão ser registrados no FOR/LACQSA/BH/012, que deverá ter todos os campos não utilizados fechados e, após verificação, deverá ser encaminhado à URPA. 8.0 Responsabilidades As funções, atribuições e responsabilidades estão definidas na PLN/LACQSA/BH/020 e no DS/LACQSA/BH/ Referências AOAC Official Methods of Analysis, Natural toxins, , Method , Chapter 49, p. 58, 2010 CSL, Determination of fumonisins B 1, B 2 and B 3 using immunoaffinity column clean-up and CLAE with precolumn derivatisation and fluorescence detection. Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, 2008 WHITE, S. N., MACARTHUR, R., ROSE, M. PAH GC-MS Single Laboratory method validation and preparation for collaborative trial for oils and fats. Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, LACQSA/BH PE 071 -Determinação de fumonisinas B 1 e B 2 em milho com purificação via coluna de imunoafinidade e quantificação por CLAE com derivatização pré-coluna e detecção por fluorescência. LACQSA/BH - REL/PE 071/001/V.1. Relatório de Validação de Procedimento Analítico: Determinação de fumonisinas B 1 e B 2 em milho com purificação via coluna de imunoafinidade e quantificação por CLAE com derivatização pré-coluna e detecção por fluorescência Documentos referenciados DE/LACQSA/BH/029-Regulamento Nº 401 da Comissão Europeia, de 23 de fevereiro de 2006 IP/LACQSA/BH/001-Descontaminação e preparo de material IP/LACQSA/BH/003-Preparo e padronização de soluções padrões de micotoxinas IS/LACQSA/BH/002-Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções) IS/LACQSA/BH/005- Aquisição de Serviços e Suprimentos Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 27/30

28 IT/LACQSA/BH/001-Uso das planilhas de rotina para emissão de resultados de análise POP/LACQSA/BH/002-Controle de equipamentos POP/LACQSA/BH/003-Acomodações e condições ambientais POP/LACQSA/BH/004-Gerenciamento de resíduos no laboratório POP/LACQSA/BH/009-Garantia da Validade dos Resultados 11.0 Anexos referenciados DS/LACQSA/BH/003-Requisitos para calibração, qualificação e verificação de equipamentos DS/LACQSA/BH/004-Escopo representativo do LACQSA - Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança Alimentar DS/LACQSA/BH/005-Descrição de Função DS/LACQSA/BH/022-Reportagem de resultados DS/LACQSA/BH/024-Abreviação de analitos e parâmetros FOR/LACQSA/BH/010-Acompanhamento de análises de micotoxinas FOR/LACQSA/BH/012-Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas FOR/LACQSA/BH/024-Comunicado de recebimento e solicitação de amostras FOR/LACQSA/BH/025-Solicitação de material ao preparo FOR/LACQSA/BH/054-Controle de sistemas cromatográficos e colunas FOR/LACQSA/BH/114-Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle PLN/LACQSA/BH/001-Plano de equipamentos PLN/LACQSA/BH/011- Controle Intralaboratorial - Amostra cego PLN/LACQSA/BH/013-Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas PLN/LACQSA/BH/014-Carta de Controle - Amostras naturalmente contaminadas PLN/LACQSA/BH/015-Carta de Controle - Amostras fortificadas PLN/LACQSA/BH/018-Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos PLN/LACQSA/BH/020-Matriz de competência PLN/LACQSA/BH/061-Avaliação da Curva de Calibração para Micotoxinas PLN/LACQSA/BH/078-Resultado de Fumonisinas B1, B2 e B3 por CLAE - Incerteza PLN/LACQSA/BH/087-Verificação de Potenciômetro 12.0 Informações de registro Acompanhamento de análises de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/010) Avaliação da Curva de Calibração (PLN/LACQSA/BH/061) Carta de controle - amostras fortificadas (PLN/LACQSA/BH/015) Carta de controle - amostras naturalmente contaminadas (PLN/LACQSA/BH/014) Comunicado de recebimento e solicitação de amostras (FOR/LACQSA/BH/024) Controle de colunas cromatográficas - CLAE (FOR/LACQSA/BH/054) Controle intralaboratorial - Amostra cego (PLN/LACQSA/BH/011) Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos (PLN/LACQSA/BH/018) Matriz de competência (PLN/LACQSA/BH/020) Plano de equipamentos (PLN/LACQSA/BH/001) Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas (PLN/LACQSA/BH/013) Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 28/30

29 Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle (FOR/LACQSA/BH/114) Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/012) Resultado de funonisina B1, B2, G e G2 por CLAE - Incerteza (PLN/LACQSA/BH/078) Solicitação de material ao preparo (FOR/LACQSA/BH/025) Verificação de Potenciômetro (PLN/LACQSA/BH/087) 13.0 Arquivos anexados 14.0 Controle de alterações Item Alteração - Retirado nome dos documentos, mantendo apenas suas siglas. 1.1 Atualização das abreviações. 2.2 Alteração da escrita com menção ao DS/LACQSA/BH/ Item resumido. 3.1 Inserção da Nota Retirada Nota referente à temperatura de armazenamento das colunas de imunoafinidade. 3.6 Retirado texto introdutório. 4.0 Item resumido. Substituído plano de equipamentos anula por PLN/LACQSA/BH/ e 6.0 Itens reestruturados para manutenção das informações essenciais Retirada nota referente à recomendação de temperatura de armazenamento do padrão fornecida pelo fabricante Inserido: A curva de calibração aprovada (as soluções) tem o prazo de validade de um mês para uso nas análises da rotina. Se no período de um mês houver necessidade de preparar uma nova solução padrão trabalho deve-se preparar também uma nova curva de calibração. Durante o prazo de validade de 1 mês, caso não se prepare nova curva analítica, a curva já preparada pode ser usada e deve ser avaliada a cada análise, segundo os critérios descritos na IT/LACQSA/BH/001, à exceção da aprovação de P1, a qual é feito quando de seu preparo. As curvas de calibração de micotoxinas feitas a partir de Materiais de Referência Certificados não serão descartadas mensalmente, desde que sejam avaliadas para demonstração de que as mesmas se mantém estáveis. O procedimento de avaliação das curvas está descrito na IT/LACQSA/BH/ Item excluído porque as informações já constam na PLN/LACQSA/BH/061 e IT/LACQSA/BH/001. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 29/30

30 Item excluído porque as informações já constam na PLN/LACQSA/BH/061 e IT/LACQSA/BH/ Item excluído porque as informações já constam na PLN/LACQSA/BH/061 e IT/LACQSA/BH/ Retirado: Recomenda-se que a temperatura da sala de extração esteja na faixa de 18 a 24 C com variação de ± 2 C por dia. Durante os procedimentos de extração descritos a seguir, observar atentamente as etapas críticas Retiradas Notas 13 e Item excluído, sendo suas informações mais relevantes transferidas para os itens 5.0 e Inserção de referência à planilha PLN/LACQSA/BH/078. Retirado: Na realização dos cálculos, considerar todos os algarismos significativos que somente serão arredondados na emissão do resultado final, utilizando a mesma regra de arredondamento realizado pelo EXCEL.Caso seja necessário o uso de outra regra de arredondamento, seja devido ao cumprimento de requisitos ou por solicitação do cliente, deverá ser explicitada no Certificado de análise ou em documento de acordo entre as partes como na análise crítica de pedidos, propostas e contratos. Item resumido e feita referência ao DS/LACQSA/BH/022. Substituído o FOR/LACQSA/BH/032 pela PLN/LACQSA/BH/ Item excluído. 8.0 Retirada menção ao DS/LACQSA/BH/001 e feita menção à PLN/LACQSA/BH/ Atualização das referências Atualização das referências Atualização das referências Atualização das referências. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 30/30