Determinação de aflatoxina M1 por cromatografia em camada delgada

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1 1.0 Objetivos e alcance O MET Determinação de aflatoxina M 1 em leite por cromatografia de camada delgada objetiva descrever os procedimentos analíticos realizados para a determinação de aflatoxina M 1 em leite, assim como garantir que os dados relacionados às análises sejam devidamente registrados. 1.1 Abreviações Afla M 1 = aflatoxina M 1 ; CCD = cromatografia em camada delgada; LD = Limite de detecção; LQ = Limite de quantificação. 2.0 Fundamentos A amostra de leite é centrifugada, purificada pela coluna de imunoafinidade contendo anticorpos específicos para Afla M 1 (com capacidade mínima de 100 ng de Afla M 1 ). Os anticorpos da coluna se ligam seletivamente a Afla M 1 presente nas amostras de leite formando um complexo Afla M 1 -anticorpo. Os demais componentes da amostra passam livremente pela coluna ou são lavados com água. A Afla M 1 é eluída da coluna de imunoafinidade com acetonitrila:metanol (3:2, v/v) e metanol puro. O eluato é evaporado e dissolvido com um solvente apropriado para determinação da Afla M 1 por CCD com quantificação visual. 2.1 Aplicabilidade Este método é aplicável à determinação de aflatoxina M 1 em leite. 3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumos O material crítico (cuja qualidade afeta o resultado analítico) está identificado pelas iniciais MC. Os reagentes, solventes e materiais necessários à análise deverão ser solicitados pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/021 Solicitação de material de consumo. As quantidades das soluções necessárias para as análises deverão ser verificadas. Vidrarias e outros materiais de uso na rotina necessário à análise deverão ser solicitados pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/025 Solicitação de material ao preparo. Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras, assim como das soluções padrões, deve ser tratada em ácido sulfúrico 2 mol/l, de acordo com os procedimentos descritos Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 1/18

2 na IP/LACQSA/BH/001 Descontaminação e preparo de material. Quando for identificada a necessidade da aquisição de materiais indisponíveis em estoque devem-se observar os procedimentos descritos no DS/LACQSA/BH/011 Aquisição de materiais de consumo para solicitação dos mesmos. A especificação detalhada dos materiais, reagentes e solventes necessários à realização dos procedimentos descritos neste MET, em particular os materiais críticos (MC), encontra-se registrada na planilha PLN/DLAB/PL/007 Lista de materiais de consumo por procedimento. 3.1 Vidraria em geral béqueres de 10, 100, 300 e 600 ml; funis de haste curta com 14 cm de diâmetro. 3.2 Colunas e unidades filtrantes colunas de imunoafinidade específicas para Afla M 1 (MC); papel de filtro com 24 cm de diâmetro, qualitativo ou algodão. 3.3 Padrões e materiais de referência materiais de referência certificados e padrão analítico de aflatoxina M 1 (MC). 3.4 Materiais de suporte bastões de vidro; bulbos conta-gotas; grades para tubos; papel alumínio; pipetas de Pasteur; pissetas; ponteiras para micropipetas automáticas; tubos de centrífuga. 3.5 Material para quantificação por CCD Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 2/18

3 cuba cromatográfica para placas de 10x20 cm; microsseringas de 10 e 25 µl; placa de cromatografia de camada delgada de sílica gel, 60, 10x20 cm, 250 µm. Nota 1: Toda vidraria utilizada para acondicionar soluções padrões de Afla M 1 ou extratos purificados de amostra deverá passar por tratamento com ácido sulfúrico 2 mol/l (ficar pelo menos duas horas em contato com o ácido). 3.6 Reagentes, solventes e soluções Os reagentes, solventes e materiais devem ser avaliados e validados segundo a IS/LACQSA/BH/002 Preparo e controle de lotes de insumos que deverá estar de acordo com os critérios de aceitabilidade do MET descritos no item 7.2 deste MET. Avaliar também a existência de interferentes. A avaliação feita deve ser registrada no FOR/LACQSA/BH/005 Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de micotoxinas. A quantidade das soluções necessárias para as análises deverão ser verificadas. Preparar as soluções, seguindo os procedimentos descritos neste MET. As soluções deverão ser descartadas, mesmo dentro do prazo de validade, quando observadas alterações indicativas de deterioração (como turbidez, separação de fases, alteração de cor, etc.) Reagentes e solventes acetona p.a.r. ou HPLC; acetonitrila p.a.; acetonitrila grau p.a.r. ou HPLC; clorofórmio grau p.a.r. ou HPLC; éter etílico p.a.; isopropanol p.a.r. ou HPLC; metanol grau p.a.r. ou HPLC; metanol p.a.; tolueno grau UV Soluções acetonitrila:metanol (3:2, v/v); Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 3/18

4 tolueno:acetonitrila (90:10, v/v) Reagentes e soluções para cromatografia em camada delgada clorofórmio:acetona:isopropanol (87:10:3, v/v/v); éter etílico:metanol:água (95:4:1, v/v/v); solução padrão de Afla M 1 em acetonitrila ou tolueno:acetonitrila (9:1 v/v). 4.0 Equipamentos Utilizar os equipamentos conforme os procedimentos descritos nas suas respectivas instruções de trabalho (IT), no plano de equipamentos anual, no DS/LACQSA/BH/003 Requisitos para calibração, qualificação e verificação de equipamentos e no POP/LACQSA/BH/002 Controle de equipamentos, considerando a adequação dos instrumentos aos requisitos e especificações necessárias à adequada execução deste MET. Verificar a avaliação de desempenho e/ou calibração externa dos equipamentos, antes do início da análise. Para micropipetas, balanças, banho de agitação, proceder à verificação diária e registrar nos devidos formulários e planilhas. 4.1 Equipamentos críticos micropipetas automáticas de 50, 100 e 1000 µl. 4.2 Equipamentos de suporte agitador de tubos; banho de aquecimento com agitação; capelas de exaustão; centrífuga; cromatovisor (lâmpada uv 365nm); pipeta graduada; sistema de filtração à vácuo. 5.0 Precauções analíticas Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 4/18

5 A Afla M 1 é um metabólito hidroxilado da aflatoxina B 1 presente no leite de animais que se alimentaram de rações contaminadas (Van Egmond, 1989). A Afla M 1 foi classificada pelo IARC no grupo 2B como possivelmente carcinogênica para humanos (IARC, 1993). Materiais de proteção individual devem ser utilizados durante o manuseio das soluções padrões e amostras possivelmente contaminadas. Os padrões sólidos devem ser manipulados com extremo cuidado, devido à sua natureza eletrostática e à sua tendência de se dispersar no ambiente. Todo o procedimento analítico deve ser realizado em local apropriado, com precauções particulares como utilização de equipamentos de proteção individual (luvas, guarda-pó, máscaras e sapatos fechados), evitando qualquer contato de padrões com a pele e/ou os olhos. Em caso de contato com a pele, lavar com solução de hipoclorito de sódio 1%, sabão e água em abundância e procurar assistência médica. Utilizar vidraria limpa, livre de detergente e resíduos e descontaminar o material utilizado ao final da análise, conforme a IP/LACQSA/BH/001 Descontaminação e preparo de material. Em casos de derrames acidentais de soluções padrões, descontaminar a área com solução de hipoclorito de sódio a 1%, deixar em contato por 10 minutos e adicionar solução de acetona a 5%. Resíduos de soluções padrões a serem descartados devem ser descontaminados com solução de hipoclorito de sódio a 1%. Após contato de 2 horas, adicionar quantidade de acetona correspondente a 5% do volume. Após contato de 30 minutos, enxaguar completamente em água corrente e deionizada. A manipulação de solventes e/ou reagentes utilizados nas análises deve ser realizada com cuidado, considerando a natureza de cada um e as informações contidas na FISPQ - ficha de segurança de produtos químicos. Consultar o POP/LACQSA/BH/004 Gerenciamento de resíduos e documentação associada. 6.0 Procedimentos O analista deve verificar quais amostras deverão ser analisadas, inclusive aquelas para fins de controle de qualidade intralaboratorial conforme o POP/LACQSA/BH/009 Garantia da qualidade analítica, em acordo com o Responsável. As amostras devem ser solicitadas à URPA pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/024 Comunicado de recebimento e solicitação de amostras. Estas serão entregues acompanhadas dos respectivos formulários de acompanhamento de amostras FOR/LACQSA/BH/012 Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas. O FOR/LACQSA/BH/010 Acompanhamento de análises de micotoxinas deverá ser preenchido com os dados Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 5/18

6 pertinentes. Caso sejam anexados registros da técnica de detecção ou folhas adicionais, estas deverão ser rubricadas e numeradas ao final da análise de forma que cada folha seja identificada com o número total de folhas e número da folha. Utilizar, preferencialmente, equipamentos e materiais listados neste MET, sendo que outros podem ser utilizados desde que sua aplicabilidade tenha sido comprovada e o seu uso devidamente registrado nos formulários de análise. Na medição de massas, volumes finais de extratos de amostras, soluções padrão ou qualquer medida que impacte significativamente a incerteza de medição, devem ser usados vidrarias e equipamentos de medições calibradas. Devem ser utilizados equipamentos cujos valores das resoluções estejam de acordo com a especificação. A vidraria e o material utilizados nas análises deverão ser identificados, na medida do possível, evitando a troca de frascos de reagentes e amostras. Ao final da análise: Os resíduos de análise (sólidos e líquidos) devem ser coletados em recipientes adequados, devidamente identificados para coleta de resíduos e devem ser manipulados conforme POP/LACQSA/BH/004 Gerenciamento de Resíduos. Coletar o material utilizado, separando os que serão lavados pelo próprio analista (materiais pequenos e ou frágeis) e encaminhar o restante para a Unidade de Preparo de Material (UPM). Organizar as soluções e materiais utilizados na análise. Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH/003 Ambiente e Segurança. 6.1 Preparo de soluções Os volumes e massas propostos para preparo das soluções reagentes podem ser ajustados para atender às necessidades das análises respeitando as devidas proporções. Etiquetar as soluções preparadas utilizando rótulo próprio, preenchendo adequadamente os campos com os dados do solvente/solução, data do preparo, nome do analista, validade e lote, conforme validado no FOR/LACQSA/BH/005 Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de micotoxinas. Acetonitrila:metanol (3:2, v/v) - adicionar 20 ml de metanol p.a.r. ou HPLC a 30 ml de acetonitrila p.a.r. ou HPLC e homogeneizar lentamente. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 6/18

7 Clorofórmio:acetona:isopropanol (87:10:3, v/v/v) - adicionar 10 ml de acetona p.a.r. ou HPLC e 3 ml de isopropanol a 87 ml de clorofórmio e homogeneizar lentamente. Éter etílico:metanol:água (95:4:1, v/v/v) - adicionar 4 ml de metanol p.a.r. ou HPLC a 95 ml de éter anidro e homogeneizar lentamente. A essa solução adicionar 1 ml de água deionizada e homogeneizar lentamente. Tolueno:acetonitrila (90:10, v/v) - adicionar 10 ml de acetonitrila p.a.r. ou HPLC a 90 ml de tolueno e homogeneizar lentamente Preparo da solução padrão de Afla M 1 As soluções padrões de aflatoxina M 1 (estoque, intermediária e trabalho) devem ser preparadas conforme procedimentos descritos na IP/LACQSA/BH/003 Preparo e padronização de soluções padrões de micotoxinas. Durante a manipulação das soluções padrões: - Retirar os frascos do freezer para ambientação da temperatura, colocá-los em suportes adequados e em ambiente protegidos da luz; - Homogeneizar a solução padrão antes da retirada da alíquota desejada; - Ao abrir o frasco de solução padrão para retirada da alíquota desejada, fazê-lo sempre em capela, com a guilhotina abaixada, porém com a exaustão desligada. - Após a retirada da alíquota desejada da solução padrão, selar imediatamente o frasco e retorná-lo para armazenamento no freezer. Os cálculos utilizados no preparo deverão ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/013 Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados. Utilizar frascos tratados com ácido sulfúrico ou silanizados de volume adequado para preparo das soluções padrão. Os frascos devem ser âmbar ou devem ser protegidos contra a luz fluorescente e solar. Após o preparo, a solução trabalho deve ser selada com parafilm e armazenada em freezer a temperatura -15 C. Durante a manipulação das soluções padrões. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 7/18

8 Nota 2: Observar a temperatura de recomendação de armazenamento de padrão fornecido pelo fabricante no certificado do padrão Preparo da solução trabalho de Afla M 1 Pipetar uma alíquota apropriada da solução padrão recém padronizada, evaporar à temperatura ambiente sob fluxo de nitrogênio (preferencialmente) ou ar comprimido seco e retomar com o volume apropriado de tolueno:acetonitrila (9:1 v/v) ou acetonitrila. Nota 3: solução padrão de Afla M 1 é estável em acetonitrila por aproximadamente 1 mês Curva de calibração para quantificação por CCD Preparar a curva de calibração com, no mínimo, 5 concentrações aproximadamente, em tolueno:acetonitrila (9:1, v/v) partindo da solução trabalho (~1 µg/ml) para atender a faixa de contaminação na amostra de aproximadamente 0,012 a 0,5 µg/l de afla M 1 quando 10 µl da solução padrão e 20 µl da amostra forem aplicados. Os cálculos utilizados no preparo das soluções para a curva de calibração devem ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/018 Curvas de calibração para micotoxinas - Modelos, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrões, sejam inseridos nos campos apropriados. A planilha deverá ser arquivada juntamente na pasta de preparo de soluções para curva de calibração, podendo, também, ser uma cópia das planilhas juntamente com os registros de acompanhamento de análise ou de testes. Rotular adequadamente as soluções preparadas (solução, toxina, analista e data). Solução preparada Concentração da solução preparada (µg/ml) Tabela 1. Curva de calibração para aflatoxina M 1. Volume pipetado do padrão (µl) Volume adicionado do solvente (µl) Volume final (µl) Contaminação equivalente para aplicação de 20 µl da amostra (µg/l) P1 0, Evaporado ,492 P2 0, ,246 P3 0, ,148 P4 0, ,098 Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 8/18

9 P5 0, ,050 P6 0, ,018 Considerando a faixa de contaminação de afla M 1 nas amostras de controle, as soluções da curva de calibração podem ser utilizadas para contaminação das amostras. 6.2 Determinação de Afla M 1 As etapas para a análise de Afla M 1 estão descritas de forma resumida no Fluxograma Extração Centrifugar (velocidade de 3500xg) as amostras de leite (10 C) por 10 minutos para desengorduramento. Após centrifugar, retirar a camada cremosa completamente por aspiração com pipeta de Pasteur ou por outro procedimento mais adequado como, por exemplo, filtração com algodão. Retirar uma alíquota do leite desengordurado para análise (Fluxograma 1) Purificação - transferir quantitativamente uma alíquota de 100 ml do filtrado obtido no item anterior para um reservatório acoplado à coluna de imunoafinidade. - passar o filtrado pela coluna, mantendo um fluxo regular de 2-3 ml/min, utilizando gravidade ou um sistema de vácuo para controlar o fluxo. Evitar que a coluna seque durante essa etapa. - lavar a coluna com 40 ml de água deionizada mantendo o fluxo regular de 2-3 ml/min. - passar ar pela coluna para garantir que esta seque completamente. - adicionar 2,5 ml de acetonitrila:metanol (3:2, v/v) e, em seguida, 2,5 ml de metanol p.a.r. ou HPLC puro à coluna de imunoafinidade, deixando cada um dos solventes em contato com os anticorpos da coluna por pelo menos 1 min. - eluir a Afla M 1 mantendo o fluxo de 2-3 ml/min e passar ar pela coluna. - coletar o eluato em um tubo cônico e evaporar a 40 C (Nota 4), sob fluxo de nitrogênio (preferencialmente) ou ar comprimido ou ainda utilizando evaporador rotatório à temperatura de 40 C. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 9/18

10 Nota 4: Cuidados devem ser tomados para evitar evaporação do extrato até a secura. Deixar sobrar uma gota do extrato no tubo, garantindo dessa forma uma ressuspensão eficiente do resíduo no solvente puro Detecção e quantificação - quando o volume do eluato tiver diminuído, lavar o tubo com aproximadamente 200 µl de acetonitrila pura, agitando o tubo vigorosamente por 1 minuto em vortex mix (para evitar formação de emulsão ao re-suspender o resíduo com tolueno:acetonitrila (9:1, v/v)). - terminar a evaporação à temperatura de 40 C. - adicionar 100 µl de tolueno:acetonitrila (9:1, v/v) e homogeneizar vigorosamente por 1 minuto em ultra-som e 1 min em vortex. - aplicar 10 e 20 µl de cada amostra e 10 µl da curva de calibração da solução padrão de Afla M 1, deixar secar por 5 minutos. - eluir a placa em éter:metanol:água (95:4:1 v/v/v) por 9 cm. - deixar a placa secar sob exaustão e fazer a quantificação visual utilizando lâmpada UV no = 365 nm, por comparação da fluorescência das soluções padrões da curva de calibração com a fluorescência apresentada por cada amostra. Se a fluorescência da amostra for maior do que a do padrão de maior concentração, fazer a diluição do extrato e reaplicar. A leitura visual deve, sempre que possível, ser realizada por três analistas treinados e o resultado emitido como média das leituras. - caso a amostra apresente interferentes na região da Afla M 1, fazer placa bidimensional, utilizando clorofórmio:acetona:isopropanol (87:10:3, v/v/v) (ou outro solvente apropriado) como solvente de eluição para a segunda direção. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 10/18

11 Fluxograma 1. Metodologia para análise de Afla M 1 Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 11/18

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13 7.0 Resultados 7.1 Cálculos Os níveis de contaminação das amostras deverão ser expressos em µg/kg, conforme legislação vigente. Os cálculos da contaminação de aflatoxina M 1 nas amostras analisadas deverão ser realizados utilizando a planilha PLN/LACQSA/BH/003 Resultado de aflatoxina M1 por CCD Incerteza, a qual considerou a Equação 1. Na realização dos cálculos, considerar todos os algarismos significativos que somente serão arredondados na emissão do resultado final, utilizando a mesma regra de arredondamento realizado pelo EXCEL. Caso seja necessário o uso de outra regra de arredondamento, seja devido ao cumprimento de requisitos ou por solicitação do cliente, deverá ser explicitada no Certificado de análise ou em documento de acordo entre as partes como na análise critica de pedidos, propostas e contratos. Alterações nos procedimentos descritos neste MET poderão ser efetuadas, desde que não comprometam o resultado da análise, devidamente autorizadas pelo Responsável e registradas no formulário de análise. (equação 1) sendo: VP = volume padrão aplicado (µl); CP = concentração do padrão (µg/ml); VA = volume de amostra aplicado (µl); VLp = volume de leite purificado (ml); VR = volume retomado (µl). 7.2 Reportagem dos resultados - Declarar se o resultado é corrigido ou não pela recuperação do controle. - Declarar os valores em porcentagem da recuperação obtida pelos controles. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 13/18

14 - Declarar a incerteza expandida estimada com probabilidade de abrangência 95%. - Reportar o fator de abrangência K. A expressão do resultado e da incerteza de medição deve ser (y ± U: Resultado ± Incerteza). Quando expressa em tabela ou Quadro a incerteza deve ser reportada sem o sinal ±. Sendo: y = resultado = mensurando e U = incerteza expandida com 95% de probabilidade de abrangência. Importante: y = corrigido pela recuperação quando aplicável y = corrigido pelo erro sistemático a princípio somente para procedimentos analíticos quando o erro sistemático impactar significativamente os resultados. A incerteza expandida de medição declarada é baseada em uma incerteza padrão multiplicada pelo fator de abrangência K, com uma probabilidade de abrangência de aproximadamente 95%. Podendo reportar também o K calculado pelas planilhas que sempre é calculado com uma probabilidade de abrangência de aproximadamente 95%. A incerteza é estimada pontualmente por amostra, respeitando a faixa de trabalho de cada método. Quando a concentração do analito exceder a faixa de trabalho a amostra deve ser diluída de forma que sua concentração fique dentro da faixa de trabalho validada pelo laboratório para cada um dos seus métodos. A incerteza é reportada na mesma unidade do mensurando (do analito) de acordo com a unidade da legislação vigente ou limite crítico estabelecido pelo Laboratório. A incerteza será reportada com dois (2) algarismos significativos, conforme o proposto pelo GUM, O número de algarismos significativos da incerteza poderá ser maior que dois para atender o valor e a unidade da legislação quando justificável. A unidade da reportagem de resultado poderá ser modificada, quando necessário ou quando o cliente assim exigir. Logo a unidade poderá ser modificada para continuar atendendo a premissa de a incerteza ser representada por dois (2) algarismos significativos. Os cálculos dos resultados analíticos e da incerteza de medição analítica, realizados em planilhas específicas pelo EXCEL, serão efetuados considerando todos os algarismos significativos e não serão arredondados até a Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 14/18

15 emissão do resultado final. Ao final, quando o resultado for reportado, será utilizada a mesma regra de arredondamento realizado pelo EXCEL. Os limites de detecção e quantificação serão representados nas mesmas condições descritas acima. Considerar como NQ (não quantificado) resultados inferiores ao limite de quantificação do método: 0,05 ± 0,03 g/l. O critério adotado para aceitabilidade de um resultado analítico é: recuperação na faixa de 70 a 110% para níveis de concentração maiores que 0,05 g/kg. A amostra que apresentar resultado maior que o limite da legislação (considerando o destino da amostra) deve ser reanalisada para confirmação. Caso os resultados dêem diferentes (considerando a incerteza) repetir a análise e avaliar o processo do preparo da amostra. Registrar diariamente os dados referentes ao controle intralaboratorial com amostras artificialmente contaminadas, naturalmente contaminadas ou com material de referência nas planilhas PLN/LACQSA/BH/014 Carta de controle - amostras naturalmente contaminadas e PLN/LACQSA/BH/015 Carta de controle - amostras fortificadas. Os resultados determinados para as amostras brancas e fortificadas deverão ser registrados no formulário FOR/LACQSA/BH/114 Reportagem de resultados analíticos Amostra controle e devolvidos à URPA juntamente com os resultados das amostras analisadas. Em caso de amostras cegas, preencher o FOR/LACQSA/BH/032 Controle intralaboratorial - Análise de amostras cegas para micotoxinas e remetê-la ao Responsável. Os resultados das amostras analisadas somente poderão ser liberados se os resultados do controle intralaboratorial atenderem aos critérios de aceitabilidade em termos de recuperação e/ou desvio padrão conforme POP/LACQSA/BH/009. Após a verificação e liberação dos resultados das amostras analisadas, os mesmos deverão ser registrados no FOR/LACQSA/BH/012 Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas que deverá ter todos os campos não utilizados fechados e após verificação deverão ser encaminhadas à URPA. 8.0 Responsabilidades Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 15/18

16 As atribuições e responsabilidades estão definidas no DS/LACQSA/BH/001 Atribuições e Responsabilidades e no DS/LACQSA/BH/005 Descrição de Função. 9.0 Referências Dragacci, S. and Grosso, F. Immunoaffinity column clean-up with liquid chromatography for determination of aflatoxin M 1 in liquid milk: Collaborative Study. Journal of AOAC International, v. 84, n. 2, IARC (1993). IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, v. 56, Some naturally occurring substances: food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins, Lyon, pp Protocolo do estudo colaborativo - IDF/IUPAC/IAEA: "Determination of the content of aflatoxin M 1 in milk by immunoaffinity clean-up followed by thin layer chromatography, may, Programa de Controle de Resíduos em Leite PCRL (IN nº 42, de 20 de dezembro de 1999, Anexo IV e Portaria SDA nº 1 de 07 de janeiro de 2005, anexo II PCRC/2005). Van Egmond H. P Current situation on regulations for mycotoxins. Overview of tolerances and status of standard methods of sampling and analysis; Food Additives and Contaminants; 6, 2; Documentos referenciados IP/LACQSA/BH/001-Descontaminação e preparo de material IP/LACQSA/BH/003-Preparo e padronização de soluções padrões de micotoxinas IS/LACQSA/BH/002-Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções) POP/LACQSA/BH/002-Controle de equipamentos POP/LACQSA/BH/003-Acomodações e condições ambientais POP/LACQSA/BH/004-Gerenciamento de resíduos no laboratório POP/LACQSA/BH/009-Garantia da Validade dos Resultados 11.0 Anexos referenciados DS/LACQSA/BH/003-Requisitos para calibração, qualificação e verificação de equipamentos DS/LACQSA/BH/005-Descrição de Função DS/LACQSA/BH/011-Aquisição de materiais de consumo FOR/LACQSA/BH/005-Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de micotoxinas FOR/LACQSA/BH/010-Acompanhamento de análises de micotoxinas FOR/LACQSA/BH/012-Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas FOR/LACQSA/BH/021-Solicitação Interna de Aquisição FOR/LACQSA/BH/024-Comunicado de recebimento e solicitação de amostras FOR/LACQSA/BH/025-Solicitação de material ao preparo FOR/LACQSA/BH/114-Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle PLN/DLAB/PL/007-Lista de Materiais de Consumo por Procedimento PLN/LACQSA/BH/003-Resultado de Aflatoxina M1 por CCD - Incerteza PLN/LACQSA/BH/013-Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas PLN/LACQSA/BH/014-Carta de Controle - Amostras naturalmente contaminadas Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 16/18

17 PLN/LACQSA/BH/015-Carta de Controle - Amostras fortificadas PLN/LACQSA/BH/018-Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos 12.0 Informações de registro Acompanhamento de análises de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/010) Carta de controle - amostras fortificadas (PLN/LACQSA/BH/015) Carta de controle - amostras naturalmente contaminadas (PLN/LACQSA/BH/014) Comunicado de recebimento e solicitação de amostras (FOR/LACQSA/BH/024) Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/005) Controle Intralaboratorial - Análise de amostras cegas para micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/032) Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos (PLN/LACQSA/BH/018) Lista de Materiais de Consumo por Procedimento (PLN/DLAB/PL/007) Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas (PLN/LACQSA/BH/013) Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle (FOR/LACQSA/BH/114) Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/012) Resultado de aflatoxina M1 por CCD - Incerteza (PLN/LACQSA/BH/003) Solicitação de material ao preparo (FOR/LACQSA/BH/025) Solicitação Interna de Aquisição (FOR/LACQSA/BH/021) 13.0 Arquivos anexados Não aplicável Controle de alterações Este MET teve origem no POP 090 Determinação de aflatoxina M1 por cromatografia de camada delgada, conforme sistema de gestão da qualidade do LACQSA/BH em vigor na época e histórico a seguir. Revisão Data Responsável Descrição Eliene A. S. - Ver FO 030, anexada no POP 090, os registros anteriores. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 17/18

18 Eliene A. S Eliene A. S. - Substituído Coordenador Técnico por Responsável pelas análises. - Inserida as abreviações LD e LQ. - Revisado item Procedimentos. - Alterado a concentração da solução trabalho de Afla M 1 para (~1 µg/ml) em Preparo de soluções reagentes. - Alterado o preparo de solução padrão para curva de calibração de Afla M 1 em Preparo de soluções reagentes. - Inserida Tabela 1. - Inserido a realização da leitura visual e emissão dos resultados como média das leituras em Detecção e quantificação. - Corrigida a fórmula para quantificação densitométrica - incluído VA e substituído CI por M 1 (massa de afla M 1 determinada no densitômetro). - Redefinido como ND (não detectado) os resultados inferiores ao LD do método (0,02 µg/l). - Redefinido o limite de quantificação do método (0,05 µg/l). - Definido o limite de detecção do método (0,02 µg/l). - Inserido fluxograma 1. - Inserido Histórico de revisões para controle das alterações. - Substituído FO 009 por FO Acompanhamento de preparo de soluções padrão para curva de calibração. - Substituído responsável pelas análises por supervisor. Controle de alterações do MET/LACQSA/BH/004 V.1 Versão Data Responsável Descrição Fernando D. M. - MET inserido no software Docnix, módulo Maxdoc. - Transferido o fluxograma do item Anexo para o item Procedimentos. - Inseridas informações acerca da incerteza da medição em Reportagem de resultados. - Excluídos procedimentos de análise densitométrica. Impresso por: Wagner de Souza Cópia não controlada Página 18/18