ELABORAÇÃO, REVISÃO E IMPLANTAÇÃO DO POP DE CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA PARA A VERIFICAÇÃO DA CONVERSÃO DE TRIACILGLICERÓIS A ÉSTERES ETÍLICOS

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1 ELABORAÇÃO, REVISÃO E IMPLANTAÇÃO DO POP DE CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA PARA A VERIFICAÇÃO DA CONVERSÃO DE TRIACILGLICERÓIS A ÉSTERES ETÍLICOS Autores: Eduardo Filipe PELLIZZARO 1, Andréia DALLA ROSA 3, Camila BONISSONI 3, Giniani Carla DORS 2, Ingrid Aparecida dos Santos GUIMARÃES 3, Maria Manuela Camino FELTES 4, Samantha Lemke GONZALEZ 5 Bolsista PIBIC-EM/CNPq 1 ; Participante do projeto (UFPel) 2 ; Equipe participante no desenvolvimento do projeto (IFC-campus Concórdia) 3 ; Participante do projeto (IFC- campus Brusque) 4 ; Orientador IFC-Campus Concórdia 5. Introdução A cromatografia é caracterizada por ser um processo físico de separação, no qual os componentes a serem separados distribuem-se em duas fases: fase estacionária e fase móvel. A fase estacionária é composta por um sólido ou um líquido disposto sobre um suporte sólido com grande área superficial. Já a fase móvel, que pode ser gasosa, líquida ou ainda um fluido supercrítico, passa sobre a fase estacionária, arrastando consigo os diversos componentes da mistura (PERES, 2002). Na cromatografia em camada delgada (TLC), a fase estacionária é uma camada fina formada por um sólido granulado (sílica, alumina, poliamida, etc.) depositado sobre uma placa de vidro, alumínio ou outro suporte inerte (PERES, 2002). Dentre as vantagens da cromatografia em camada delgada, a rapidez, versatilidade, grande reprodutibilidade e baixo custo são destacadas na escolha do método analítico (CECCHI, 2003). Por conta de tais vantagens, é utilizada no acompanhamento de reações de transesterificação, permitindo a identificação de monoacilgliceróis (MAG), diacilgliceróis (DAG), triacilgliceróis (TAG) e ácidos graxos livres (AGL) em reações de glicerólise de óleos de diferentes origens (CHRISTIE, 1982). Um procedimento operacional padrão (POP) tem por característica descrever e padronizar os procedimentos através do passo a passo do ensaio, experimento ou técnica analítica. Portanto, deve conter todas as informações necessárias para o bom desenvolvimento deste processo de maneira sucinta e coesa (DUARTE, 2005).

2 O objetivo deste trabalho foi elaborar, revisar e implantar o POP de Cromatografia em Camada Delgada (CCD) em placas de TLC para verificação da conversão de triacilgliceróis a ésteres etílicos, adequando os padrões do POP com as necessidades e características local, facilitando, por fim, o desenvolvimento da técnica pelos usuários vinculados aos projetos de Biodiesel. Material e Métodos Inicialmente, deve ser feito o preparo da fase móvel, contendo hexano, acetato de etila e ácido acético, na proporção 90:10:0,5 (v/v/v). O reagente deve ser homogeneizado e guardado em geladeira, em vidro âmbar com tampa e devidamente identificado. Posteriormente recorte a placa de sílica gel para CCD. Em uma superfície limpa e totalmente seca, com uso luvas de látex limpas e secas, devem ser marcados a lápis, o tamanho da placa a ser cortada. A altura não deve exceder o béquer e a largura varia de acordo com o número de amostras, onde deve-se ter 1 cm de distância entre as mesmas e as bordas da placa. Deve-se ter cuidado ao fazer o traçado para não danificar a sílica. Na sequência, com auxílio de uma tesoura limpa e seca, a placa deve ser cortada na dimensão desejada, cortando também as bordas inferiores em diagonal (distância de menos de 1 cm das bordas da placa). Após, deve ser feito um traçado, a lápis, a partir de 1 cm da base da placa. Esta será a linha base, onde serão aplicadas as amostras. Deve-se identificar também a frente do solvente, o ponto máximo onde o solvente deverá chegar. Com a conclusão dessa etapa, as amostras, caso não estejam em estado líquido, devem ser fundidas (em torno de 30 C, dependendo da amostra) e, em um eppendorf de 2 ml, pesar 0,020 g de amostra, com o auxílio de uma pipeta Pasteur. A amostra deve ser identificada com uma etiqueta. Em seguida, em uma capela de exaustão, utilizando uma pipeta graduada de 1 ml, adicionar 1 ml de hexano no eppendorf com a amostra. A concentração final da solução será 20 mg ml -1 e, caso a massa da amostra ultrapasse 20 mg, utilizar quantidade de hexano

3 suficiente para que a concentração final seja 20 mg.ml -1. Assim, pode-se homogeneizar as amostras, com a ajuda do agitador vórtex. Após, um capilar deve ser lavado, mergulhando em torno de 5 vezes a ponta em um béquer contendo hexano e deixando escorrer em papel toalha. Com isso, com a ponta do capilar, aplicar a solução do eppendorf sobre a placa. Dispensar a primeira gota em um pedaço de papel toalha e, após, aplicar 2 gotas sobre a linha base da placa de cromatografia delgada (CD). O capilar deve estar na vertical, angulado em 90 para que o líquido escorra na placa. Lavar o capilar novamente, 5 vezes, com hexano antes de aplicar nova amostra e assim sucessivamente. Deverá ser feita a aplicação de um padrão sobre a placa, (por exemplo ácido oleico como padrão para AGL), ao invés da amostra. Aplicar o padrão por último, ou seja: primeiro as amostras, depois o padrão. Na capela, colocar uma pequena quantidade de fase móvel dentro da cuba de migração ou em um béquer de 600 ml. Com a ajuda de uma pinça, colocar a placa dentro da cuba contendo a solução, lembrando sempre que a linha base deve estar acima dos solventes. A placa deve ser colocada de pé, sem tocar em nenhuma parede lateral da cuba. Cobrir imediatamente a cuba com papel pardo, filme plástico ou placa de petri. Assim, inicia-se o processo de eluição. No momento em que os solventes atingirem a marca feita a lápis (frente do solvente), retirar imediatamente a placa da cuba e deixá-la secar sobre papel toalha. Transferir o solvente que estava dentro da cuba para o béquer pequeno e descartar corretamente os resíduos do processo. Na sequência, deve-se deixar a cuba dentro da capela, sem qualquer cobertura, para evaporar os resíduos de solventes. Quando evaporado, colocar um pouco de iodo finamente moído dentro da cuba e deixar saturar a câmara com a finalidade de revelar resultados, mas não exagerar no tempo para que o iodo não danifique a placa. Segue-se o processo retirando, com auxílio de uma pinça, a placa da cuba e colocando uma régua ao lado da mesma para realizar as medidas das distâncias, iniciando a contagem do zero na linha de base das amostras e finalizando-a na frente do solvente. Anotar os resultados obtidos e fotografar a placa.

4 Resultados e discussão Para identificar a presença das amostras nas placas, os resultados obtidos devem ser calculados de acordo com o fator de retenção (Equação 1) e, os mesmos, comparados com as referências bibliográficas. Rf = distância percorrida pela fração lipídica(medirnocentrodamancha), h distância percorrida pelo solvente, H Os resultados obtidos através do cálculo caracterizam a análise como qualitativa, indicando ou não a presença dos componentes desejados. Ou seja, nesse caso indica a conversão de triacilgliceróis a ésteres etílicos (Figura 1). Figura 1. Localização dos componentes da amostra sobre a placa Fonte: POP Conclusão O desenvolvimento do POP permitiu o aperfeiçoamento das técnicas de CCD aplicadas no laboratório de Bromatologia do IFC Campus Concórdia, adequando as técnicas com a realidade do laboratório e melhorando a metodologia, que facilita consideravelmente a interpretação dos passos para quem desenvolver o processo.

5 Referências CECCHI, H. M. Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos. 2. Ed. Campinas: UNICAMP, p. CHRISTIE, W.W. Lipid analysis. 2 ed. Pergamon Press, DUARTE, R. L. Curso de BPLC - Rondônia, Disponível: df. Acesso em 21 de junho de PERES, B. T. Noções básicas de cromatografia. Palestra. Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Proteção Ambiental-Instituto Biológico. São Paulo SP, 2002.