ANÁLISE INSTRUMENTAL

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1 ANÁLISE INSTRUMENTAL CURSO DE ENGENHARIA QUÍMICA 2 o SEMESTRE 2018 Prof. Dr. Antônio Aarão Serra Profa. Dra. Jayne Carlos de Souza Barboza 1

2 CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA À GÁS (CG) 2

3 CROMATOGRAFIA GERAL - CLC A. Cromatografia Planar A.1.Cromatografia em Papel (CP) A.2.Cromatografia em Camada Fina (CCF). B.Cromatografia em Coluna B.1.Cromatografia à Gás B.2.Cromatografia Líquida B.2.1.Cromatografia Líquida Clássica (CLC)(em Vidro a Pressão Ambiental) B.2.2.Cromatografia Líquida de Alta Pressão e Alta Eficiência (CLAE ou HPLC) 3

4 CG - COLUNA PLANO DE AULA: INTRODUÇÃO EQUIPAMENTO GASES ESPECIAIS COLUNA/FORNO FASE MÓVEL (FM) FASE ESTACIONÁRIA (FE) DETALHAMENTO MECANISMO DE SEPARAÇÃO DETECTORE INJETORES DESENHO (COLUNA/SEPARAÇÃO/DETECÇÃO) PRATOS TEÓRICOS ANÁLISE BIBLIOGRAFIA 4

5 CG COLUNA - INTRODUÇÃO É importante ressaltar que Absorção é diferente de Adsorção. Na Absorção, uma substancia se infiltra na outra, enquanto que a Adsorção é apenas superficial. ABSORÇÃO ADSORÇÃO 5

6 CG COLUNA - INTRODUÇÃO Fonte adaptada: Collins, C. H. et al.. Fundamentos de cromatográfia, 5ª ed., Ed. UNICAMP,

7 . CG COLUNA - INTRODUÇÃO 7

8 CG COLUNA - INTRODUÇÃO PRINCIPAIS TIPOS DE CROMATOGRAFIA CP Cromatografia em Papel CCD Cromatografia em Camada Delgada(TLC) CCV Cromatografia em coluna de vidro CG Cromatografia a Gás (CG) CL Cromatografia Líquida (HPLC) CS Cromatografia Supercrítica CE Cromatografia por Exclusão CTI Cromatografia de Troca Iônica (CI) CB Cromatografia de Bioafinidade Entre Outras 8

9 CG COLUNA - INTRODUÇÃO PRINCIPAIS TIPOS DE CROMATOGRAFIA 9

10 CG COLUNA - INTRODUÇÃO CUSTOS RELATIVOS: Cromatografia Planar : Cromatografia em Papel (CP) - Baixo Custo; Cromatografia em Camada Delgada Baixo Custo Cromatografia em Coluna: Cromatografia em Líquida Clássica (CLC): Baixo Custo Cromatografia a gás (CG): Médio custo Cromatografia de alta Eficiência (CLAE): Alto Custo 10

11 CG COLUNA - INTRODUÇÃO APLICAÇÃO: Agricultura (Pecuária, Veterinária) Alimentícia Cosméticos (Higiene, Perfumes) Farmacêutica (Farmacos) Medicina (Hospitais e Clinicas) Meio Ambiente (Resíduos, Águas) Petroquímica (Derivados) Embalagens Mineração Produtos Naturais (fragâncias, essências, princípios ativos) Química (matéria-prima, catalisadores, aditivos) Entre outros 11

12 CG COLUNA - INTRODUÇÃO FORÇAS QUE ATUAM CG: A diferença na magnitude dessas forças que determina a resolução e portanto a separação dos solutos individuais. As forças elementares que agem sobre as moléculas são de cinco tipos: 1) Forças de dispersão de London ou forças de Van der Waals; 2) Interações de dipolo induzido; 3) Ligações de hidrogênio; 4) Interações dielétricas; 5) Interações eletrostáticas e coulombianas. OBS.: Pressão Média 12

13 CG COLUNA - INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO: O objetivo da cromatografia é separar os diversos constituintes de uma mistura de vários compostos seja para identificação, quantificação ou obtenção de compostos puros para os mais diversos fins. A separação se dá através da migração da amostra através de uma Fase Estacionária (FE) por intermédio de uma Fase Móvel (FM). 13

14 CG COLUNA - INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO: Após a introdução da amostra no sistema cromatográfico, os componentes da amostra se distribuem entre as duas fases e viajam mais lentamente que a fase móvel devido ao efeito retardante da fase estacionária. O equilíbrio de distribuição dos componentes entre as duas fases (FE/FM) determina a velocidade com a qual cada componente migra através do sistema. 14

15 CG COLUNA - INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO: A diferença na magnitude dessas forças que determina a resolução e portanto a separação dos solutos individuais. As forças elementares que agem sobre as moléculas são de cinco tipos: 1) Forças de dispersão de London ou forças de Van der Waals; 2) Interações de dipolo induzido; 3) Ligações de hidrogênio; 4) Interações dielétricas; 5) Interações eletrostáticas e coulombianas. 15

16 CG COLUNA - INTRODUÇÃO Introdução: Mecanismo de separação A separação cromatográfica é realizada a partir de interações diferenciadas entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel FE AMOSTRA FM C R O M A T O G R Á F I A 16

17 CG COLUNA - INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO: Quais misturas podem ser separadas por CG? Qualquer substância que poder ser arrastada por um fluxo de um gás. Desde que ela se dissolva total ou pelo menos parcialmente nesse gás. Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS/SEMI-VOLÁTEIS. DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300 o C e que sejam termicamente estáveis. 17

18 CG COLUNA - INTRODUÇÃO MODALIDADES E CLASSIFICAÇÃO 1. Cromatografia à Gás (CG): Cromatografia a Gás: Coluna de metal ou de vidro pressão média, gás de arraste é a FM. FM = Gás (A escolha do Gás de arraste depende do detector). Ex. He, N 2 ou H 2. FE = Geralmente líquido não volátil, mas algumas vezes sólido. 18

19 CG COLUNA - EQUIPAMENTO CROMATÓGRAFO A GÁS (CG) 19

20 CG COLUNA - EQUIPAMENTO ESQUEMA DE UM CROMATÓGRAFO À GÁS. 20

21 CG COLUNA - EQUIPAMENTO PARTES PRINCIPAIS DO CG 1-Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2-Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3-Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4-Detector. 5- Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6- Registro de Sinal (Registrador/Integrador). 21

22 CG COLUNA GASES ESPECIAIS FASE MÓVEL (GÁS DE ARRASTE) FM em CG: NÃO interage com a amostra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS DE ARRASTE. REQUISITOS: INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos: H 2 O e O 2 = oxida / hidrolisa algumas FE. HIDROCARBONETOS = ruído no sinal de DIC 22

23 CG COLUNA GASES ESPECIAIS FASE MÓVEL (GÁS DE ARRASTE)-Requisitos CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser muito caros. A = 99,995 % (4.5) (R$ 100) B = 99,999 % (5.0) (R$ 300) C = 99,9999 % (6.0) (R$ 900) COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento. DCT He, H 2 DIC N 2, H 2 DCE N 2, Ar + 5% CH 4 23

24 CG COLUNA GASES ESPECIAIS FASE MÓVEL (GÁS DE ARRASTE) Gases mais usados (N 2, He, H 2 e Ar) Não deve interagir com o recheio da coluna e ser compatível com o detector e de alta pureza (H 2 O/HC) 24

25 CG COLUNA GASES ESPECIAIS FASE MOVEL (GÁS DE ARRASTE) Sua escolha depende: Do tipo de coluna (empacotada ou capilar). Do tipo de detector que está sendo usado. OBS.: Colunas capilares, normalmente necessita-se um gás auxiliar (make up) para o detector, para obter sensibilidade otimizada. Coluna capilar d.i.<0.32mm HIDROGÊNIO Ideal (Perigoso) HÉLIO aceitável NITROGÊNIO menos aceitável 25

26 CG COLUNA GASES ESPECIAIS FASE MÓVEL GÁS DE ARRASTE Coluna megabore - d.i. 0.53mm NITROGÊNIO IDEAL HÉLIO Pode ser usado HIDROGÊNIO não recomendado Coluna empacotada: normalmente nitrogênio ou hélio, mas no caso de detector de condutividade térmica, hidrogênio ou hélio são os mais recomendados. Pureza dos gases: ideal é % ou melhor, principalmente para detector de captura de elétrons. 26

27 CG COLUNA COLUNAS - EMPACOTADA Forno e Coluna: Programa de temperaturas (Isotérmica/ Rampa contínua/ Rampa por patamares) O último patamar bem acima do p.e. do menos volátil 27

28 CG COLUNA FM FASE MÓVEL Gasosa - Na Cromatografia Gasosa a Fase Móvel é o próprio Gás de Arraste cuja função é transportar os analitos através do Sistema (Injetor /Coluna /Detector). Os principais Gases de Arraste são o Hélio, Nitrogênio, Hidrogênio e o Argônio. Líquida Na Cromatografia Líquida emprega-se uma mistura de solventes, denominada Eluente, como Fase Móvel. Os principais são: metanol, acetonitrila e água. 28

29 CG COLUNA FM CONSTANTE DE DISTRIBUIÇÃO Kc 29

30 CG COLUNA FM QUANTIFICAÇÃO DA EFICIÊNCIA 30

31 CG COLUNA FE NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (n)ou (N) n= 16 (tr/ wb)2 n = segmento da coluna onde se atinge um equilíbrio entre fase móvel, estacionária e analito quanto > n > rendimento da coluna (picos mais finos) 31

32 CG COLUNA FE TEMPO DE RETENÇÃO/LARGURA DO PICO. t R = tempo de retenção t o = tempo de volume morto w b = largura da base 32

33 CG COLUNA FE SELETIVIDADE (α) α = k 2 /k 1 α = posição relativa de 2 picos Ideal: α > 1 33

34 CG COLUNA FE RESOLUÇÃO (Rs) Rs = 2 (t R2 t R1 )2/ w b1 + w b2 Rs = separação real dos picos 34

35 CG COLUNA FE EFICIÊNCIA: Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito. 35

36 CG COLUNA FE QUANTIFICAÇÃO DA EFICIÊNCIA ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H) é o Tamanho de cada estágio de equilíbrio. Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes. 36

37 Tempos de Retenção (t R ) Fixadas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante. CG COLUNA FE t' R = f Interações analito/fe Pressão de vapor do analito Condições operacionais (Tcol., Fc...) 37

38 CG COLUNA FE Colunas cromatográficas: Tubo longo contendo a FE. Principais materiais para confecção de colunas: aço inox, vidro, alumínio, teflon, sílica fundida. a Coluna Empacotada b,c,d Colunas Capilares 38

39 CG COLUNA FE FASE ESTACIONÁRIA LÍQUIDA líquido pouco volátil, recobrindo um suporte sólido. deve solubilizar seletivamente as substâncias. termicamente estável. quimicamente inerte. Suporte ideal: Deve ter área superficial específica grande. FE deve espalhar uniformemente, na forma de filme fino. Deve ter partículas com diâmetros regulares e poros uniformes. Deve ser mecanicamente rígido, para evitar quebras. Não deve interagir com as moléculas da amostra. 39

40 CG COLUNA FE a) Tubos densamente empacotados com fase estacionária de material uniforme, finamente dividida, ou com suporte sólido que é recoberto com uma fina camada de fase líquida estacionária. 40

41 CG COLUNA FE b) Parede interna do capilar recoberto com uma fina camada de FE. c) Superfície interna do capilar é coberta por um filme fino de um material suporte (adsorvente), como terra diatomacia, sobre o qual a FE líquida encontrase dispersa. 41

42 CG COLUNA FE d) Parede do capilar recoberta apenas com uma camada de adsorvente, que é a própria FE. 42

43 CG COLUNA FE COLUNA CAPILAR: A separação ocorre na coluna e duas fases são envolvidas: Fase Estacionária (FE) que fica dentro da coluna Fase Móvel (FM) que é o gás de arraste que move-se sobre a FE. 43

44 TIPOS DE COLUNAS: CG COLUNA FE 44

45 CG COLUNA FE VANTAGENS E DESVANTAGENS DAS COLUNAS. 45

46 CG COLUNA FE TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIAS CROMATOGRAFIA GÁS-LÍQUIDO (~90%) Polisiloxano R= -CH 3 ; -CH 2 CH 2 CH 2 CN; -CH 2 CH 2 CF 3 ; -C 6 H 5 Polietilenoglicol 46

47 CG COLUNA FE TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIAS CROMATOGRAFIA GÁS-SÓLIDO (~10%) Material sólido adsorvente, por ex.: molecular sieves, alumina, etc. Uso: hidrocarbonetos muito voláteis (e.g. CH 4 ), gases inorgânicos (por. ex.: N 2, CO 2 ) 47

48 CG COLUNA FE SELEÇÃO DE FASE ESTACIONÁRIA 100% dimetil polisiloxano (APOLAR) Ex. de analitos: solventes, produtos de petróleos, sabores, hidrocarbonetos saturados 5% difenil 95% dimetil polisiloxano (APOLAR) Ex. de analitos: aromas, pesticidas, hidrocarbonetos aromáticos 35% difenil 65% dimetil polisiloxano (POLARIDADE MÉDIA) Ex. de analitos: pesticidas contendo nitrogênio Polietileno glicol (POLAR) Ex. de analitos: ácidos graxos, aromas e álcoois. 48

49 CG COLUNA FE LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: sólidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares). 49

50 CG COLUNA FE Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é presa de duas maneiras:. A) Entrecruzada: as cadeias poliméricas são quimicamente ligadas entre si. B) Quimicamente ligadas: as cadeias poliméricas são presas ao suporte por ligações químicas SÓLIDOS Colunas recheadas com material finamente granulado (empacotadas) ou depositado sobre a superfície interna do tubo (capilar) 50

51 CG COLUNA FE SELETIVA Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra. Regra geral: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático...). FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra. 51

52 CG COLUNA FE FE pouco Seletiva: Pior resolução mesmo com coluna de boa eficiência. 52

53 CG COLUNA FE EFEITO DA TEMPERATURA DA COLUNA: 53

54 CG COLUNA - DETALHAMENTO CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE UM FORNO AMPLA FAIXA DE TEMPERATURA DE USO Pelo menos de T ambiente até 400 o C. SISTEMAS CRIOGÊNICOS (T < T ambiente ) podem ser necessários em casos especiais. TEMPERATURA INDEPENDENTE DOS DEMAIS MÓDULOS Não deve ser afetado pela temperatura do injetor e detector. TEMPERATURA UNIFORME EM SEU INTERIOR Sistemas de ventilação interna muito eficientes para manter a temperatura homogênea em todo forno. 54

55 CG COLUNA - DETALHAMENTO CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE UM FORNO: FÁCIL ACESSO À COLUNA A operação de troca de coluna pode ser freqüente. AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO RÁPIDO Importante tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas. TEMPERATURA ESTÁVEL E REPRODUTÍVEL A temperatura deve ser mantida com exatidão e precisão de ± 0,1 C. 55

56 CG COLUNA - DETALHAMENTO PROGRAMAÇÃO LINEAR DE TEMPERATURA Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:. Componentes mais voláteis são separados Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos 56

57 CG COLUNA - DETALHAMENTO PROGRAMAÇÃO LINEAR DE TEMPERATURA Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:. Componentes mais voláteis não são separados. Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente. 57

58 CG COLUNA - DETALHAMENTO PROGRAMAÇÃO LINEAR DE TEMPERATURA (PLT) Possíveis problemas associados à PLT: VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura. 58

59 CG COLUNA - DETALHAMENTO PROGRAMAÇÃO LINEAR DE TEMPERATURA (PLT) Possíveis problemas associados à PLT: DERIVA ( DRIFT ) NA LINHA DE BASE Devido ao aumento de volatilização de FE líquida. 59

60 CG COLUNA - DETALHAMENTO Temperatura da Coluna Pressão de Vapor (p 0 ) p 0 = f ESTRUTURA DO ANALÍTO TEMPERATURA DA COLUNA 60

61 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO MECANISMOS DE SEPARAÇÃO 61

62 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO MECANISMOS DA CROMATOGRAFIA 62

63 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO PROCESSO FÍSICO-QUÍMICO QUE REGE A SEPARAÇÃO Adsorção: (Gás- Sólido) O soluto é adsorvido na superfície das partículas sólidas da fase estacionária. É um fenômeno superficial, aumentado com a formação de pontes de hidrogênio. FE é sólida e a adsorção ocorre na interface, entre FE e FM 63

64 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO MECANISMOS DA CROMATOGRAFIA 64

65 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO PROCESSO FÍSICO-QUÍMICO QUE REGE A SEPARAÇÃO Partição: (Gás-Líquido) O soluto se equilibra entre o líquido da fase estacionária e a fase móvel, por diferença de solubilidade (equilíbrio). O soluto dissolvido na fase líquida que reveste a superfície da fase sólida. Diferentes solubilidades dos componentes da amostra na FE. 65

66 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO MECANISMOS DA CROMATOGRAFIA 66

67 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO MECANISMOS DA CROMATOGRAFIA 67

68 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO PROCESSO FÍSICO-QUÍMICO QUE REGE A SEPARAÇÃO Troca Iônica: Os ânions móveis são mantidos perto dos cations que estão ligados covalentemente a uma fase estacionaria sólida. 68

69 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO MECANISMOS DA CROMATOGRAFIA 69

70 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO PROCESSO FÍSICO-QUÍMICO QUE REGE A SEPARAÇÃO Exclusão Molecular, Filtração ou Permeação em Gel (GPC) Não existem interações entre a fase estacionária e o soluto. Se separa por tamanho de partícula. Moléculas grandes são excluídas e moléculas pequenas são retidas. 70

71 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO MECANISMOS DA CROMATOGRAFIA 71

72 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO PROCESSO FÍSICO-QUÍMICO QUE REGE A SEPARAÇÃO Afinidade: Um tipo de molécula de uma mistura complexa se liga a moléculas que estão covalentemente ligadas a FE. Todas outras moléculas passam. 72

73 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO FE QUIRAIS (Separação de isômeros óticos) FÁRMACOS: Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica. PRODUTOS BIOLÓGICOS: Distinção entre produtos de origem sintética e natural. Natural = normalmente substâncias oticamente puras; Sintético = muitas vezes são misturas racêmicas. 73

74 CROMATOGRÁFIA - SEPARAÇÃO FE. 74

75 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO EXISTEM OUTROS TIPOS DE CLASSIFICAÇÕES: Mecanismo de separação baseados em processos Físico, Químico e Mecânico. Mecanismo de separação baseado na fase estacionária (gás-sólido e gáslíquido) 75

76 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO MECANISMOS DA SEPARAÇÃO ADSORÇÃO: A fase estacionária é um sólido contendo grupos (sítios ativos) que podem adsorver certas substâncias. Ex.: Peneira Molecular, Polímeros Porosos. Tem o equilíbrio: 76

77 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO PARTIÇÃO MECANISMOS DA SEPARAÇÃO A fase estacionária é um líquido depositado ou quimicamente ligado a um suporte sólido ou depositado ou quimicamente ligado à de um tubo capilar de sílica fundida(cg) As moléculas dos componentes a serem separados se distribuem entre a fase estacionária ligada e a fase móvel líquida(hplc) ou fase móvel gasosa(cg) de acordo com sua afinidade relativa: Compostos com diferentes constantes de partição são separados. 77

78 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO MECANISMOS DA SEPARAÇÃO Partição: diferentes solubilidades dos componentes da amostra na FE Tem o equilíbrio 78

79 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO MECANISMOS DA SEPARAÇÃO Partição: A FM carrega as moléculas nela dissolvidas. Para re-estabelecer o equilíbrio, moléculas na FE passam para a FM e são arrastadas. Tem-se um equilíbrio dinâmico em cada segmento da coluna. Como a FM está em contínuo movimento, esta acaba retirando todas as moléculas da coluna. 79

80 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO FATORES QUE AFETAM EFICIÊNCIA Comprimento da coluna Diâmetro da coluna Vida útil Temperatura de eluição Vazão de FM Volume de amostra introduzida Técnica de injeção Características da substância Outros 80

81 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO Escolha da coluna: Polaridade da fase estacionária, Diâmetro e espessura do filme quantidade de amostras, tempo de análise, pressão (velocidade da FM), temperatura do forno. Comprimento dos pratos teóricos. 81

82 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIAS Apolar: hidrocarbonetos não aromáticos, silicones (ex.: SE-30). Polar: contém grande quantidade de grupos polares (Ex.: Carbowax)- interações tipo pontes de hidrogênio Intermediária: grupos polares ou potencialmente polares em esqueleto apolar (Ex. SE-52) 82

83 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO Abreviação de algumas fases estacionárias mais usadas: DEGA - adipato de dietileno glicol DEGS - succinato de dietileno glicol SE metil silicone OV % fenil- metilsilicone Carbowax 20 M - polietilnoglicol 83

84 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO Parâmetro Coluna empacotada Coluna capilar N o de Pratos teóricos Diam. Int. (mm) 1 4 0,15-0,75 Comprimento (m) Pratos teóricos Espessura F.E.(µm) 5 0,5-2 Vazão gás (ml/min) Vol. amostra (µl) ,001-0,5 84

85 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO FASE ESTACIONÁRIA/ESTRUTURA POLI(5%DIFENIL- 95%DIMETILSILOXANE). Não polar fase ligada. Quimicamente compatível com água e outros solventes. Pode ser lavada. Faixa de temperatura: -60 o C a 320 o C 85

86 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO FASE ESTACIONÁRIA/ESTRUTURAS POLI(5%DIFENIL- 95%DIMETILSILOXANE). APLICAÇÃOES TÍPICAS: hidrocarbonetos, gasolina, solventes, pesticidas, alimentos, fame, fenois, alcaloides aromáticos, drogas de abuso, flavorizantes, fragâncias. 86

87 CROMATOGRÁFIA DETECTORES 87

88 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR DETECTOR: Dispositivos que examinam e detectam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem do composto que não o gás de arraste. SINAL GRÁFICO X TEMPO = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma. 88

89 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR PRINCIPAIS DETECTORES DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD)Variação da condutividade térmica do gás de arraste DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID) Íons gerados durante a queima dos (compostos) eluatos em uma chama de H 2 + ar sintético. DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD) Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos. 89

90 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR DETECTORES: Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluída de um analito. Existem ~ 60 detectores que foram utilizados em CG. Destes aproximadamente 15 equipam os cromatógrafos comerciais. Apenas 4 respondem pela maior parte das aplicações DIC ou FID - Detector por Ionização em Chama EM ou MS - Detector Espectrométrico de Massas DCT ou TCD - Detector por Condutividade Térmica DCE ou ECD - Detector por Captura de Elétrons 90

91 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR PARÂMETROS DESEJAVEL DO DETECTOR Alta sensibilidade Resposta rápida para todos os compostos da amostra Insensível à mudanças na Fase Móvel Insensível à mudanças de temperatura Resposta independente para a Fase Móvel Resposta linear Não deve destruir a amostra Fácil operação Fornecer informações qualitativas 91

92 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR PARÂMETROS DESEJAVEL DO DETECTOR Baixo nível de ruído Faixa linear ampla p/ a resposta Resposta p/ os compostos de interesse (universais, seletivos, específicos) Insensível a pequenas mudanças de fluxo e temperatura Destrutivos / não destrutivos 92

93 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR PARÂMETROS BÁSICOS DE DESEMPENHO QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL Massa de um analito que gera um pico com altura igual a três vezes o nível de ruído. RUÍDO Qualquer componente do sinal gerado pelo detector que não se origina da amostra. Principais Fontes de Ruído: Contaminantes nos gases; Impurezas acumuladas no detector; Aterramento elétrico deficiente; inerente do próprio equipamento. 93

94 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR TIPOS DE DECTORES UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluida. SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. ESPECÍFICOS: Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas. 94

95 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR CLASSIFICAÇÃO: 95

96 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR CARACTERÍSTICAS DOS DETECTORES a) Seletividade: responde apenas a uma classe de substâncias detectores seletivos (detectores universais e detectores específicos); b) Sensibilidade: mudança na resposta do detector em função da quantidade detectada; c) Ruído: deflexões da linha de base (efeitos eletrônicos do sistema de detecção); 96

97 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR CARACTERÍSTICAS DOS DETECTORES (Cont.) d) Quantidade mínima detectável: depende de parâmetros relacionados à coluna ( g); e) Faixa linear: razão entre a maior e a menor concentração da amostra; f) Outras características: não sofrer alterações de vazão e de temperatura e ser resistentes às condições de trabalho. 97

98 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (FID) (quase universal) Detector mais usado (sensível / destrutivo). Adequado para compostos orgânicos. Substâncias orgânicas (contendo C) quando queimadas produzem íons que afetam o potencial entre dois pólos elétricos (300 V), amostra é misturada com H 2 e ar. Os íons CHO + são recolhidos no cátodo e a corrente gerada produz o sinal. 98

99 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (FID) (quase universal) Formação de íons pela combustão da amostra na presença de H 2 e O 2. Origina corrente elétrica no coletor gerando um sinal do qual a combustão do gás de arraste é descontada É sensível à velocidade do fluxo de massa passando por ele Fornece sinal só a 1 a vez. Para ter mais sinal tem que fornecer mais soluto e moléculas de amostra (no gás de arraste) são queimadas na chama formando íons (coletados por um eletrodo). (esquema do FID a seguir) 99

100 FID CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR 100

101 FID CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR 101

102 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR DETECTOR DE CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT) UNIVERSAL: Detecta matéria orgânica e inorgânica mas pouco sensível (60% FID). não destrutivo. O gás de arraste tem uma condutividade térmica conhecida. A resistência do filamento muda com a condutividade do gás. A presença de analitos altera a condutividade térmica do gás de arraste (H 2 ou He). A sensibilidade aumenta com a diminuição da temperatura, do fluxo e da corrente. Os filamentos queimam na presença de oxigênio. 102

103 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR DETECTOR DE CONDUTIVIDADE TÉRMICA (UNIVERSAL) H 2 e He têm uma condutividade térmica 6 a 10 x superior à dos compostos orgânicos. Sua presença leva a uma diminuição da condutividade e um aumento muito rápido da temperatura. 103

104 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (ECD) (seletivo) Grupos funcionais eletronegativos. N 2 é ionizado por fonte radiativa (Ex.: 63 Ni) partículas betas (β) produzindo elétrons (ânodo), que gera corrente, resultando na linha de base (constante). Moléculas eluindo da coluna capturam elétrons e diminuem a corrente. O sinal gerado é proporcional à concentração Bastante usado para análise de pesticidas. Esquema do ECD a seguir. 104

105 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR ECD 105

106 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR DETECTOR POR ESPECTROMETRIA DE MASSA (DEM) Centenas de componentes presentes em sistemas naturais e biológicos; Caracterização de componentes que dão odor e sabor aos alimentos; Identificação de poluentes da água. GC-ICP-MS 106

107 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR ESPECTROMETRIA DE MASSA 107

108 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR APARELHO MASSA (CG-EM) 108

109 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR DEM. 109

110 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR TIPOS DE DETECTORS (DETALHES) Ionização de chamas FID (alta sensibilidade, resposta quase universal) FM = hidrogênio ou nitrogênio, destrutivo. Condutividade térmica (resposta universal, não destrói a amostra) FM = helio ou hidrogênio, não destrutivo. Captura de elétrons (seletivo p/ halogênios orgânicos, nitrilas, nitratos e organometálicos) FM = nitrogênio, não destrutivo Termiônico (seletivo p/ compostos contendo N e P) destrutivo. 110

111 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR Detectores Limites de detecção DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Universal. Observa-se para qualquer substância eluída. Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de mg (10 4 ). DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Quase-universal universal. Detecta qualquer substância que contenha ligações C-H. Não responde a gases nobres, H 2, O 2, N 2, CX 4, SiX 4 (X=halogênio), CO, CO 2, CS 2, H 2 O, NO, N 2 O, NO 2, NH 3. Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg ( ). DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01 a 1 pg com linearidade até ng. (10 4 ) DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico fico. Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg 111 (P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. ( )

112 CG COLUNA - FE SEPARAÇÂO - DETECTOR Detectores Limites de detecção DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Universal. Observa-se para qualquer substância eluída. Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de mg (10 4 ). DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Quase-universal universal. Detecta qualquer substância que contenha ligações C-H. Não responde a gases nobres, H 2, O 2, N 2, CX 4, SiX 4 (X=halogênio), CO, CO 2, CS 2, H 2 O, NO, N 2 O, NO 2, NH 3. Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg ( ). DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01 a 1 pg com linearidade até ng. (10 4 ) DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico fico. Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg 112 (P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. ( )

113 CG COLUNA - FE INJETORES INJETORES 113

114 CG COLUNA - FE INJETORES SISTEMA DE INJEÇÃO DA AMOSTRA Injeção (seringas ou válvulas) Pode injetar líquido, gás, sólido/líquido gerar banda única e estreita. quantidade de amostra não deve ultrapassar a capacidade da coluna. Reprodutível. Aquecimento para vaporização total da amostra. 114

115 CG COLUNA - FE INJETORES TIPOS DE INJETORES 115

116 INJETOR: CG COLUNA - FE INJETORES Parte do cromatografo a gás onde a amostra é introduzida. Vaporiza amostra (solvente + compostos alvo) Mistura vapor com fase móvel (gás de arraste) Transfere vapor para dentro da coluna Forma mais simples: Câmara de aquecimento Cobertura do injetor/dispositivo de vidro Linhas de fluxo de gás 116

117 CG COLUNA - FE INJETORES INJETOR (Formato geral) 117

118 INJETOR: CG COLUNA - FE INJETORES INJETOR: SPLIT/SPLITLESS: Vantagem: Previne introdução de compostos não voláteis da amostra. Desvantagem: Discriminação dos compostos com alto ponto de ebulição e termicamente instáveis; Dois modos de injeção em um único injetor. 118

119 CG COLUNA - FE INJETORES INJEÇÃO: INJEÇÃO SPLIT: Para amostras com concentrações mais altas. Razão Split = Fluxo de que sai por Split / Fluxo da Coluna. Vantagem: Pico com bom formato INJEÇÃO SPLITLESS: nível traço. Para compostos de Bom para amostras semi-voláteis (pontos de ebulição do analito são acima de ~150ºC). 119

120 CG COLUNA - FE INJETORES INJETOR ON-COLUMN (OCI): Toda amostra é introduzida diretamente na coluna. Amostra pode ser introduzida a temperatura relativamente baixa. Temperatura do injetor pode ser programada (rampa). Por ex.: 50ºC (0.1min) 100 º C/min 280º C (20min). Não ocorre o splitting da amostra Sem discriminação dos compostos com alto ponto de ebulição. Minimiza decomposição de compostos termicamente instáveis. Rápida contaminação da coluna por compostos não voláteis. 120

121 CG COLUNA - FE INJETORES QUALIDADE DA INJEÇÃO: Injeção de amostra para dentro da fase móvel sem dispersão da amostra ou tailing (efeito cauda) Vaporizar todos solutos instantaneamente sem decomposição térmica Evitar difusão de componentes da amostra na fase móvel Não tenha contaminação da amostra Não tenha perda da amostra 121

122 CG COLUNA - FE INJETORES INJETORES PARA COLUNAS CAPILARES. 122

123 CG COLUNA - FE INJETORES TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize imediatamente, mas sem decomposição. REGRA GERAL: Acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil (Tinj = 50 o C ). VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra. 123

124 CG COLUNA - FE INJETORES SISTEMA DE INJEÇÃO/EXIGÊNCIAS Usar quantidade de amostra tão pequena quanto possível (<1ml). Temperatura no injetor dever ser controlável, constante e a recomendável pelo fabricante. A amostra deve vaporizar Instantaneamente: controlar a temperatura do injetor. O sistema de injetor é frequentemente fonte de assimetria dos picos: Sujidade/demasiada amostra/temperatura insuficiente. A amostra não deve conter resíduos não voláteis. 124

125 CG COLUNA - FE INJETORES SISTEMA DE INJEÇÃO/EXIGÊNCIAS (Cont.) O septo é fonte de problemas: Vedação incompleta (perda de amostra / descriminação). Liberação de impurezas (picos estranhos à amostra). O septo novo deve ser pré-aquecido durante várias horas. O injetor deve ser limpo frequentemente. A divisão da amostra ( splitter ) - pode ser fonte de discriminação entre solutos de diferentes volatilidades 125

126 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO DESENHO (COLUNA/SEPARAÇÃO/DETECÇÃO) 126

127 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO Operação pela qual uma mistura é dividida em pelo menos duas frações com diferentes composições. É obtida por meios físicos embora reações químicas podem ser envolvidas no processo. Os métodos físico-químicos de separação são baseados na utilização de alguma propriedade física das substâncias a serem separadas. 127

128 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO PRINCIPAIS TIPO DE SEPARAÇÃO Destilação fracionada: Diferença de ponto de ebulição (diferença na pressão de vapor) Destilação por arraste a vapor: Diferenças de solubilidades Cristalização/Recristalização: Diferenças de solubilidades Derivados: Preparação de derivados (Ex. Oximas) Extração com solvente: Diferença na constante de distribuição (partição) dos componentes em dois solventes imiscíveis entre si. Cromatografia: Diferença de afinidade das substâncias por um material ativo ou adsorve 128

129 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO SEPARAÇÃO EM COLUNA ANTES DE COLOCAR A FASE MOVEL (FM) 129

130 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO ÍNICIO DA FASE MÓVEL (Líquida ou gás) 130

131 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO LINHA BASE 131

132 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO. 132

133 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO.PASSAGEM PELO DETECTOR 133

134 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO. 134

135 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO. 135

136 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO. 136

137 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO. 137

138 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO. 138

139 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO COMPORTAMENTO NA COLUNA Amostra gasosa ou liquida volatilizada é introduzida na corrente do gás de arraste que a leva sobre a FE numa coluna. Os constituintes se distribuem entre FE e FM, movendo-se a porção que está na fase vapor com o gás de arraste. Podem ser separados e saem da coluna em tempos diferentes característicos da coluna e das condições experimentais (vazão da FM, Temp.). Ao sair da coluna, os constituintes, separados, passam por um dispositivo onde são detectados, emitindo um sinal elétrico que é registrado, constituindo o que se denomina cromatograma. 139

140 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO CROMATOGRAMA t 1 t 2 t 0 w w

141 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO IMPORTÂNCIA DA CG Velocidade Cromatografos convencionais Cromatografos com sistema para Fast CG; Módulo para EZ Flash acoplado a CG convencional. Poder de resolução Capacidade de separar adequadamente os constituintes da amostra. Manuseio de pequenas quantidades de amostra: ( g) Simplicidade da técnica 141

142 CG COLUNA - FE FM - SEPARAÇÃO COMPARAÇÃO CG/HPLC 142

143 143

144 CROMATOGRAFIA PRATOS TEÓRICOS E SEPARAÇÃO (CG e HPLC) 144

145 CROMATOGRAFIA - PRATOS TEÓRICOS EFICIÊNCIA: Número de pratos teóricos (N) Cada N uma etapa de equilíbrio entre FE e FM Quanto > N > Eficiência = maior separação (picos mais estreitos) Quanto < N < Eficiência = menor separação (picos mais largos) Equação de N N = 16 (dr/wd) 2 N = 5,54 (dr/wh) 2 145

146 CROMATOGRAFIA - PRATOS TEÓRICOS EFICIÊNCIA: N = numero de pratos teóricos dr = distancia de retenção (tempo de retenção) Wd = largura do pico na linha de base Wh = Largura a meia altura Altura equivalente a um prato teórico (H) Comparação entre colunas de comprimentos diferentes: Equação de H H = L/N L = comprimento da coluna 146

147 CROMATOGRAFIA - PRATOS TEÓRICOS Eficiência: Dados para o cálculo de N 147

148 CROMATOGRAFIA - PRATOS TEÓRICOS Eficiência Dados para o cálculo de N ou n O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, T R : T R = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico); T M = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna); T R = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE) 148

149 CROMATOGRAFIA - PRATOS TEÓRICOS. 149

150 CROMATOGRAFIA - PRATOS TEÓRICOS PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS TEMPO DE RETENÇÃO (T R ) Por definição chamamos de TEMPO DE RETENÇÃO, (T R ), de uma substância ao tempo decorrido desde o instante em que a amostra foi introduzida até o instante do máximo do pico. (onde (To) é o tempo de retenção de um composto não retido na fase estacionária) 150

151 CROMATOGRAFIA - PRATOS TEÓRICOS TEMPO DE RETENÇÃO (tr) Na análise cromatográfica, mantido constantes a vazão da fase móvel e a temperatura da coluna, o tempo de retenção de cada componente é constante, desde que a FE não sofra modificação. 151

152 CROMATOGRAFIA - PRATOS TEÓRICOS PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS A partir da figura, definimos os seguintes parâmetros cromatográficos de acordo com as equações a seguir: 152

153 CROMATOGRAFIA - PRATOS TEÓRICOS PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS FATOR DE RETENÇÃO (ou FATOR CAPACIDADE) Onde: t r é o tempo de retenção corrigido t O é o tempo de retenção de um composto não retido. 153

154 CROMATOGRAFIA - PRATOS TEÓRICOS EFICIÊNCIA Relação entre resolução, seletividade e eficiência a Resolução - Ruim Seletividade - Ruim Eficiência - Ruim b Resolução - Boa Seletividade - Boa Eficiência - Ruim c Resolução - Boa Seletividade - Boa Eficiência - Boa 154

155 CROMATOGRÁFIA ANÁLISES 155

156 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES t R = tempo de retenção. t m = tempo morto- tempo que a FM leva para percorrer a coluna t R = tempo de retenção corrigido = t R -t m 156

157 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES ANÁLISE QUALITATIVA a) Comparação do tr com a do composto padrão Identifica de forma aproximada, pois 2 componentes podem apresentar mesmo Tr. Confirmar o resultado: outra técnica ou testar colunas diferentes. b) Adição de padrão Adicionar o composto que se imagina presente aumenta na altura do pico confirma aumento na largura do pico não é o composto c) Índice de Kovats (comparar c/ literatura) 157

158 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES ANÁLISE QUANTITATIVA Avaliar: análise qualitativa, exatidão e precisão. Causas de erro: perdas mecânicas, amostra volátil, contaminação. Integração dos picos. 158

159 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO a) Normalização: compara a área com a % da composição da mistura %A = (área A / área total) x 100 b) Calibração externa: curva de calibração: A x C c) Padronização interna: adição de quantidade conhecida de um padrão na amostra Ax /A PI x C d) Adição de padrão. Aplicação Analítica: Áreas: ambiental; farmacêutica; alimentícia; petroquímica, medicina, pesquisa,

160 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES CROMATOGRAMA. 160

161 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES Indices de Kovats / indices de retenção Os índices de retenção são importantes para assegurar a identificação e intercomparação de resultados com base de dados. 161

162 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES Indices de Kovats / indices de retenção 162

163 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES MÉTODOS DE DETECÇÃO QUALITATIVOS Cromatografia Gasosa com Detecção Espectrométrica de Massas (CG-EM). Cromatografia Gasosa com Detecção Espectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA). Cromatografia Gasosa com Detecção Espectrométrica por Absorção no Infra- Vermelho (CG-EIV). OBS.: Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de identificação baseadas em retenção. 163

164 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES TERMOS E SÍMBOLOS MAIS USADOS CG t R = tempo de retenção de cada componente. Tm = T 0 = tempo de retenção de um componente não retido (não tem afinidade) pela fase estacionária => tempo morto. K= fator de retenção = (t R -t M )/T M. As= assimetria do pico (divide-se o pico ao meio e faz-se a razão entre os dois segmentos). T= fator de cauda (tailing factor) substitui a As geralmente. 164

165 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES TERMOS E SÍMBOLOS MAIS USADOS CG α = fator de seletividade=(t R 2-t M )/ (t R1 t M ) T= tailing factor= fator de cauda. N= eficiência= número de pratos Rs= resolução entre os picos. H= altura equivalente (utilizado para comparar eficiência de colunas de diferentes comprimentos)= L/N Alargamento de banda. 165

166 EXEMPLO: CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES 166

167 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES CLASSIFICAÇÃO QUANTO A TEMPERATURA Cromatografia gasosa com programação de temperatura. Variação linear ou não Melhora a separação Diminui o tempo de análise Temperaturas menores Solutos mais voláteis Temperaturas maiores Solutos menos voláteis maior simetria nos picos melhor detectabilidade Amostra composta de substancias com grandes diferenças em seus pontos de ebulição. 167

168 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES CG ISOTERMICA DA MISTURA DE ÁLCOOIS Cromatografia gasosa isotérmica A temperatura da coluna permanece constante durante a análise 168

169 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES CG COM TEMPERATURA PROGRAMADA Cromatografia gasosa com programação de temperatura. 169

170 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES CÁLCULOS/ANÁLISES 170

171 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES ANÁLISES (K = FATOR DE RETENÇÃO) 171

172 ANÁLISES CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES 172

173 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES ANÁLISES (AVALIAÇÃO DOS PICOS) 173

174 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES ANÁLISES: De acordo com a fórmula de Resolução Para Rs aumentar, a diferença entre o tr de dois picos adjacentes deve aumentar ou as larguras (w) dos picos deve diminuir. 174

175 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO(H) Tamanho de cada estágio de equilíbrio. Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos. Mas na capilar L é muito maior então são mais eficientes. 175

176 CROMATOGRÁFIA - ANÁLISES Quantificação da eficiência ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H) Tamanho de cada estágio de equilíbrio (L = comprimento da coluna) dc = Diâmetro da coluna df = Espessura da FE em mm Capilares, L = 30 m Empacotadas, L = 2 m Valores típicos de H e N: d C d f H N 0,10 0,25 0, ,25 0,25 0, ,32 0,32 0, ,32 0,50 0, ,32 1,00 0, ,32 5,00 0, ,53 1,00 0, ,53 5,00 0, ,16 10% 0, ,16 5% 0, Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes 176

177 CROMATOGRÁFIA Termos e símbolos mais usados tr= tempo de retenção de cada componente; tm= tempo de retenção de um componente não retido (não tem afinidade) pela fase estacionária => tempo morto; K= fator de retenção= (tr-tm)/tm; As= assimetria do pico (divide-se o pico ao meio e faz-se a razão entre os dois segmentos); 177

178 CROMATOGRÁFIA Termos e símbolos mais usados (Cont.) T= fator de cauda (tailing factor) substitui a As geralmente; α = fator de seletividade=(tr2-tm)/ (tr1 tm) T= tailing factor= fator de cauda; N= eficiência= número de pratos; Rs= resolução entre os picos; H= altura equivalente (utilizado para comparar eficiência de colunas de diferentes comprimentos) = L/N Alargamento de banda 178

179 CROMATOGRÁFIA/TERMOS USUAIS Termos e símbolos mais usados (Cont.) Amostra: Porção de um determinado material que representa a totalidade. Analito: Espécie (iônica, atômica ou molecular) que se deseja determinar em uma amostra. Matriz: Conjunto de todos os constituintes que compõem uma amostra. Detector: Dispositivo mecânico, elétrico ou químico que identifica, registra ou indica uma alteração em uma das variáveis na sua vizinhança (pressão, temperatura, etc.). Sistema de detecção: Conjunto inteiro que indica ou registra as quantidades físicas ou químicas. Transdutor: Dispositivo que converte informação de domínio não-elétrico em informação de domínio elétrico e vice-versa (microfone, fotocélulas, etc.). 179

180 CROMATOGRÁFIA/TERMOS USUAIS Termos e símbolos mais usados (Cont.) Sensor: Dispositivo analítico capaz de monitorar espécies químicas específicas de forma contínua e reversível (eletrodo de vidro, QCM, etc.). Equivale ao transdutor associado a uma fase de reconhecimento quimicamente seletiva. Curva analítica: Representação gráfica da resposta do instrumento (sinal analítico) em função da concentração do analito proveniente de soluções-padrão (padrão externo). Também chamada de curva de trabalho ou curva de calibração. 180

181 CROMATOGRÁFIA/TERMOS USUAIS Termos e símbolos mais usados (Cont.) Branco (br): Sinal do instrumento para matriz (ou imitação) na ausência do analito ou de uma espécie que corresponda ao analito. Limite de detecção (LD ou Cm): Concentração ou massa mínima do analito que pode ser detectada em um nível confiável. Sm = Sbr + k sbr (valor mais aceito k = 3) onde Sm e Sbr são o sinal analítico mínimo e do branco e s é o desvio padrão do branco. 181

182 CROMATOGRÁFIA/TERMOS USUAIS Termos e símbolos mais usados (Cont.) Limite de quantificação (LQ): Considera-se ser a concentração para a qual o sinal analítico excede em 10 desvios padrões o sinal do branco. Limite de resposta linear (LRL): Concentração limite a partir da qual não é mantida a linearidade. LRL Sinal Analítico c m LQ FOT Concentração 182

183 CROMATOGRÁFIA/TERMOS USUAIS Faixa linear de trabalho (FLT) ou Faixa ótima de trabalho (FOT) ou Faixa dinâmica: Faixa de concentração que se estende de LQ até LRL. Sinal analítico 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 y = 0,0382x + 0,2412 R 2 = 0,9999 0, Volume de solução do padrão, ml 183

184 CROMATOGRÁFIA/TERMOS USUAIS Termos e símbolos mais usados (Cont.) Método do padrão interno: Consiste em adicionar uma substância em quantidade constante a todas as amostras, aos brancos e aos padrões de calibração em uma análise. Compensa diversos tipos de erros, aleatórios ou sistemáticos. Método de adição de padrão: Consiste em uma série de medidas envolvendo a adição de incrementos de uma solução-padrão do analito à alíquotas da amostra de mesmo volume com a finalidade de corrigir a interferência da matriz sobre o sinal analítico. 184

185 CROMATOGRÁFIA/TERMOS USUAIS Termos e símbolos mais usados (Cont.) Repetibilidade: Grau de concordância entre resultados independentes obtidos com o mesmo método para um material de teste idêntico sob as mesmas condições (mesmo operador, mesmo equipamento, mesmo laboratório em um pequeno intervalo de tempo). Reprodutibilidade: Grau de concordância entre resultados independentes obtidos com o mesmo método para um material de teste idêntico sob diferentes condições (diferentes operadores, diferentes equipamentos, diferentes laboratórios e após diferentes intervalos de tempo). A medida da reprodutibilidade é o desvio padrão qualificado com o termo 185

186 CROMATOGRÁFIA/TERMOS USUAIS Termos e símbolos mais usados (Cont.) Reprodutibilidade: Em alguns contextos reprodutibilidade pode ser definida como o valor abaixo do qual a diferença absoluta entre dois resultados individuais com um material idêntico, obtido nas condições acima, aconteçam com a mesma probabilidade especificada. Note que uma declaração completa de reprodutibilidade exige a especificação das condições experimentais que diferem. 186

187 CROMATOGRAFIA - ANÁLISE QUANTITATIVA ANÁLISE QUANTITATIVA Sensibilidade: quanto mais inclinada a curva de calibração mais sensível é o método (diferença de sinal é maior com menores diferenças de concentração) 187

188 CROMATOGRAFIA - ANÁLISE QUANTITATIVA Faixa linear: região da curva de calibração na qual o sinal possui uma relação linear com a concentração. 188

189 CROMATOGRAFIA ALGUMAS FASES ESTACIONÁRIAS 189

190 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO FASE ESTACIONÁRIA/ESTRUTURAS POLI(14%CIANOPROPILFENIL-86%DIMETILSILOXANE) Polaridade intermediária. Fase ligada. Grupo ciano torna a fase mais susceptível a danificação por oxigênio e umidade do que outras fases de silicone. Pode ser lavada. Faixa de temperatura: sub ambiente a 280º C. 190

191 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO FASE ESTACIONÁRIA?ESTRUTURAS POLI(14%CIANOPROPILFENIL-86%DIMETILSILOXANE) APLICAÇÕES: Aplicações típicas: pesticidas, semi voláteis, esteróides, ac. orgânicos, álcoois, pahs, pcbs, aroclor, tranquilizantes. 191

192 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO FASE ESTACIONÁRIA/ESTRUTURAS POLI(6%CIANOPROPILFENIL-94%DIMETILSILOXANE) Fase polaridade média. Fase ligada. 192

193 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO FASE ESTACIONÁRIA/ESTRUTURAS POLI(6%CIANOPROPILFENIL-94%DIMETILSILOXANE) APLICAÇÕES: Fase desenvolvida para análises de compostos organo-voláteis, halogenados, não halogenados e aromáticos pela técnica de purge&trap como contaminantes em ar, água potável, e efluentes e solos. 193

194 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO FASE ESTACIONÁRIA/ESTRUTURAS POLIETILENOGLICOL(CARBOWAX 20M) Fase polar. Fase quimicamente compatível com água e outros solventes, porém solventes como o metanol e água devem ser vaporizados no injetor antes de alcançar a Coluna, portanto evite usar com injeção on colum. Pode ser lavada. Faixa de temperatura: 35 a 280º C. 194

195 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO FASE ESTACIONÁRIA/ESTRUTURAS POLIETILENOGLICOL(CARBOWAX 20M) APLICAÇÕES: Alcóois aromáticos(btex), glicois, fame, ac. Graxos, fenois, flavorizantes, fragâncias. 195

196 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO FASE ESTACIONÁRIA/ESTRUTURAS Coluna Capilar de Parede Recoberta (WCOT): FE líquida sobre a parede interna da coluna. Coluna Capilar Recoberta com um Suporte (SCOT): FE liquida recobrindo um suporte sólido que se encontra preso na parede interna da coluna. Coluna Capilar com camada porosa (PLOT): FE sólida sobre a parede interna da coluna. (Ex. Alumina/KCl). 196

197 CG COLUNA - FE - SEPARAÇÂO FASE ESTACIONÁRIA/ESTRUTURAS As colunas PLOT foram desenvolvidas para substituir colunas empacotadas com fases estacionárias sólidas, com o objetivo de proporcionar maior número de pratos da coluna e consequentemente melhor resolução dos analitos. 197

198 CROMATOGRAFIA FIM 198

199 BIBLIOGRÁFIA CROMATOGRAFIA SKOOG, D. A; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A.. Princípios de Análise Instrumental, 5ª edição, Editora Bookman, COLLINS, H. C.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S.. Fundamentos de Cromatografia, Editora Unicamp,

200 BIBLIOGRÁFIA CROMATOGRAFIA HARRIS, D. C.. Análise Química Quantitativa, Sétima Edição, ltc (Livros Técnicos e Científicos Editora Ltda), Rio de Janeiro, (Tradução de 7th ed Quantitative Chemical Analysis), ENGEL, R. G.; KRIZ, G. S.; LAMPMAN, G. M.; PAIVA, D. L.. Química Orgânica Experimental. Tradução da 3ª Edição, Cengage Learning, São Paulo,