PCR Reação de Polimerase em Cadeia. Termociclador

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Liliana Gameiro Castelo
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1 PCR Reação de Polimerase em Cadeia Termociclador

2 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) Técnica que permite a amplificação da quantidade de DNA específico utilizando a enzima Taq DNA polimerase, sequências iniciadoras específicas (primers) e variações de temperatura controladas.

3 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes DNA

4 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos)

5 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes Taq polimerase Primers Tampão Água MgCl 2 DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos)

6 Taq DNA polimerase O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.

7 Trata-se de uma enzima cuja atividade é mantida durante 45 minutos a 95 C. Taq DNA polimerase Sua quantificação é dada em Unidades (U), sendo que cada U é definida como a quantidade de enzima capaz de incorporar 10 nm de dntp em cerca de 30 min a 72 C. Na maioria dos protocolos são utilizadas 2,0 a 2,5 U (0,5 l) de enzima em volume final de 100 l. É importante deixar claro que o excesso de enzima também pode prejudicar a eficiência da reação, podendo inclusive inibi-la.

9 Seqüências dos primers Os primers (forward e reverse) devem ser construídos de acordo com a conveniência do investigador, de modo que esses possuam seqüências complementares a determinadas regiões do DNA que limitam os segmentos a serem amplificados.

10 Problemas comuns no Desenho de Primers Auto-complementariedade Complementariedade entre primers

11 Auto Complementariedade Formação de alça GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT HO TGACTTC ACTGAA T m = 71 o C

12 Desoxinucleotídios trifosfatados (dntp) São as bases nitrogenadas que constituirão as novas cadeias de DNA. Sua concentração numa reação pode variar de 20 a 200 um sendo importante que as quatro devam variar em concentrações equivalentes. Quando estão em excesso (um nucleotídeo ou todos) podem ocorrer erros de incorporação de bases, gerando cópias alteradas

13 Íon magnésio O íon magnésio (Mg ++ ) é um co-fator enzimático que desempenha um papel de extrema importância na atividade da enzima Taq DNA polimerase. Sua concentração em torno de 1,5 mm é aplicável a maioria das necessidades. - Se a concentração de Mg2+ é muito baixa, temos pouco ou nenhum produto - Se a concentração de Mg2+ é muito elevada, a PCR tem baixa especificidade. Observa-se muitas bandas ou smear.

14 Smear

15 PCR Requerimentos Cloreto de Magnésio:.5-2.5mM Tampão: ph dntps: µM Primers: µM DNA Polimerase: units DNA Alvo: 1 µg

16 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes Taq polimerase Primers Tampão Água DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos)

17 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes Taq polimerase Primers Tampão Água DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos) 94ºC DENATURAÇÃO 2. Alternância de temperaturas (Termociclador)

18 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes Taq polimerase Primers Tampão Água DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos) 94ºC 57ºC DENATURAÇÃO ANELAMENTO 2. Alternância de temperaturas (Termociclador)

19 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes Taq polimerase Primers Tampão Água DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos) 94ºC 57ºC 72ºC DENATURAÇÃO ANELAMENTO EXTENSÃO 2. Alternância de temperaturas (Termociclador) (35) CICLOS

20 94ºC DENATURAÇÃO

21 57ºC Primer forward Primer reverse ANELAMENTO

22 72ºC Taq DNA polimerase EXTENSÃO

23 Temperatura média (Tm) de Anelamento Essa temperatura está relacionada, por exemplo, com a quantidade das bases C e G, de modo que Ponte de Hidrogênio quanto maior for o número dessas bases, a fosfato pentose temperatura de hibridização tende a aumentar. Citosina Guanina Timidina Normalmente primers de 18 a 25 nucleotídios Adenina contendo 50 a 60% de G + C são adequados. Para se calcular a TM (temperatura média de hibridização) de primers com até 20 nucleotídios aplica-se a seguinte formula: 4 x (C + G) +2 x (A + T) = TM

24 Tempo de extensão dos primers Esse fator depende do comprimento do segmento a ser amplificado e da concentração do DNA molde utilizado na reação. A temperatura ótima de extensão dos primers é de 72 C (temperatura ótima de atividade da polimerase) e o tempo de extensão de 1 minuto é considerado suficiente para estender produtos de aproximadamente pb (em condições ideais).

25 Tempo e temperatura de denaturação As condições de desnaturação utilizadas normalmente são de 95 C por 5 minutos (desnaturação inicial) e por 30 segundos (desnaturação na ciclagem), sendo que temperaturas mais altas podem ser utilizadas quando se trabalha com seqüências moldes ricas em G+C. Temperaturas muito altas e tempos longos de desnaturação levam a perda de atividade da enzima

26 Amplificação de DNA (exponencial) Linear Plateau Gel EtBr Log [DNA] Geométrica X ciclos y = 2 X

27 Amplificação de DNA (Platô)

28 Número de cópias de 1 molécula de DNA após 34 ciclos: CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA , , , , , , , , , , ,048, ,097, ,194, ,388, ,777, ,554, ,108, ,217, ,435, ,870, ,073,741, ,400,000, ,500,000, ,550,000, ,580,000,000

29 Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Análise dos dados

30 Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Análise dos dados Termociclador

31 Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Análise dos dados Termociclador Reação de PCR + Tampão Corado (Loading Buffer)

32 Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Análise dos dados Termociclador Reação de PCR + Tampão Corado (Loading Buffer) Eletroforese em gel de agarose + Brometo de Etídeo

33 Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Análise dos dados Luz Ultravioleta Fotodocumentação Termociclador Reação de PCR + Tampão Corado (Loading Buffer) Eletroforese em gel de agarose + Brometo de Etídeo

34 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 2% REVELAÇÃO DO BROMETO DE ETÍDEO COM LUZ ULTRAVIOLETA

35 FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2% UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb Marcador de pares de base (pb)

FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2% UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb 1400 1300 600 500 400 600 600 400 400

36 FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2% UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb Marcador de pares de base (pb) TAMANHO ESTIMADO DOS FRAGMENTOS DE DNA AMPLIFICADOS

38 Variações da técnica de PCR - Reverse Transcriptase -PCR (RT-PCR): amplifica RNAm, construindo cópias complementares de DNA (cdna). - Real Time-PCR: PCR quantitativo utilizado para determinação de carga viral. - Nested-PCR: amplifica seqüências de DNA de baixa frequência (exemplo: diagnóstico de parasitoses).

39 Aplicações do PCR A alta sensibilidade do método de PCR, bem como a sua especificidade, nos permite amplificar uma seqüência-alvo mesmo a partir de amostras com baixo grau de pureza e de quantidades mínimas de DNA, o que torna o método viável não só para a pesquisa básica mas também para a pesquisa aplicada.

40 Aplicações do PCR Os produtos amplificados por PCR podem ter as seguintes utilidades/ aplicações: 1. Detecção de deleções / inserções determinadas pela geração de produtos amplificados que apresentam alterações em seu tamanho. 2. Detecção de mutacões pontuais (substituição de bases), conhecidas ou não, que geram polimorfismos genéticos podem ser determinadas pela ação das enzimas de restrição ou através do seqüenciamento.

41 Aplicações do PCR 3. No diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional (particularmente para doenças herdadas). 4. Na tipagem para transplantes de órgãos e susceptibilidade para doenças auto-imunes específicas (detecção de polimorfismo para HLA). 5. No diagnóstico e prognóstico de doenças de ordem genética, como o câncer, através do estudo dos genes relacionados a essas doenças. 6. Na medicina forense (DNA fingerprint). 7. No diagnóstico de doenças infecciosas por agentes patogênicos diversos

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