Polymerase Chain Reaction

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1 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Instituto de Ciências Básicas da Saúde Laboratório de Virologia Polymerase Chain Reaction Equipe de Virologia UFRGS & IPVDF

2 PCR Desenvolvida em meados dos anos 80 Revolucionou a Biologia Molecular Síntese enzimática de cópias de DNA a partir de uma seqüência alvo Reação baseada na replicação do DNA

3 PCR Importância no diagnóstico virológico Requer um mínimo de material gênico para sua realização Pode aliar alta sensibilidade com alta especificidade Resultado em poucas horas

4 PCR Replicação do DNA in vivo Proteínas SSP ou DNA girase

5 PCR Síntese de DNA in vitro Reagentes DNA molde Primers Taq polimerase DNTPs Tampão da enzima H 2 O MgCl 2 Outros: DMSO, glicerol

6 Temperatura PCR - Amplificação Fonte: wps.prenhall.com

7 PCR - Amplificação

8 PCR - Amplificação

9 PCR - Amplificação

10 PCR Ciclos consistindo de 3 etapas: Desnaturação (15seg-1min a 94-95ºC) Anelamento (15seg-1min a 50-55ºC*) Extensão (15seg-3min** a 72ºC) *Temperatura determinada pela Tm dos primers **Tempo determinado pelo tamanho do produto

11 PCR *O que é Tm? Melting temperature

12 PCR A característica da sequência alvo também vai determinar a Tm P. ex.: Herpesvírus bovino 1 ou 5 apresentam um conteúdo de GC em torno de 72% Herpesvírus ovino tipo 2: 52% de GC SV 40 (poliomavírus): 40% GC

13 PCR Taq polimerase: enzima que sintetiza DNA Oriunda do Thermus aquaticus Temperatura ótima: 72 o C Processividade em torno de 1000 pb/min Produto de 500 pb: 30 seg de extensão Produto de 1500 pb: 1 min e 30 seg

14 Fonte: Dieffenbach & Dveksler, 1995 PCR

15 PCR Primers = oligonucleotídeos Pequenas sequencias de nucleotídeos desenhados para serem complementares a sequência alvo O tamanho pode variar entre 15-30pb Normalmente apresentam 50% de GC

16 PCR Outros reagentes: MgCl 2 : cofator da enzima

17 Outros reagentes: PCR DNTPs: deoxinucleotideos trifosfato datp (adenina), dttp (timina), dctp (citosina) e dgtp (guanina) Água (diluente)

18 PCR Outros reagentes: Tampão: oferece as condições básicas (50mM KCl; 10 mm Tris-HCl) para que a reação ocorra Glicerol; DMSO: diminuem a temperatura de fusão e separação das fitas, aumentando a especificidade de anelamento dos primers DNA molde: extração de DNA

19 Extração de ácidos nucléicos Extração de DNA total A partir de tecido remetido ao laboratório Etapas básicas no processo: Lise celular Extração dos ácidos nucléicos Precipitação dos ácidos nucléicos

20 Extração de ácidos nucléicos Composição química de uma célula procariótica DNA 3% RNA 20% Monômeros (aa) 3% Íons inorgânicos 1% Lipopolissacarídeo 3% Proteína 56% Lipídeo 9% Polissacarídeo 5% Fonte: Madigan, 2004

21 Extração de ácidos nucléicos Análise da extração de DNA total A B : Marcador λ x Hind III 2: 400nm de DNA bacteriófago Lambda 3-8: DNA total extraído de gânglios trigêmeos de bovinos 1 e 14: Marcador λ x Hind III 2-13: DNA total extraído de gânglios trigêmeos de bovinos Temos o DNA, falta a sequência alvo? Fotos: Fabrício Campos

22 Sequência alvo PCR

23 Sequência alvo PCR

24 PCR Sequência alvo vai dar origem ao produto de PCR TATGGAGAAGGAAGAGCCCGATACGCTCGCACCACGAGCTTCACGTGACGCTCCGGG GACGCCAAAAGTGCCCGCGATGCCCGGTGTGACCCCGGAGCCATCAGGAAACGCCTC GGAGCCCGCCGACCCGGCGGAGCTCCGGGCGGACTTGCGGGGTCTAAAAGGCTCCA GCGACGATCCTAATTTCTACGTGTGCCCCCCTCCCACCGGTGCGACCGTGGTGCGGCT CGAGGAGCCGCGCCCGTGCCCGGAGTTGCCCAAGGGGCTCAACTTCACCGAGGGCAT CGCCGTAACTTTCAAGGAGAACCTCGCGCCGTACAAGTTTAAGGCCACTATGTACTACAA GGCCGTGACTGTCGCTAGCGTGTGGTCCGGGTACTCGTATAACCAGTTTATGAATATCTT TGAGGACCGTGCCCCTATACCGTTCGAGGAAATCGTCGACCGGATACACGGCCGGGGT ATGTGTTTGTCCACGGCAAAGTACGTCAGGAACAACCTTGAGACCACCGCATTCCATAAT GATGCCGACGAACATGAGATGAAGCTGGTGCCCGCCGAGTCCGCCCCTGGGTTGCATC GCGGATGGCACACCACGCGGCTAAAAA Bovine herpesvirus type 2 glycoprotein B gene BoHV-2F: TATGGAGAAGGAAGAGCCCG BoHV-2R: TTTTTAGCCGCGTGGTGTGC Produto da PCR: 608 pb

25 PCR Fatores que podem interferir na amplificação Reagentes DNA molde Taq polimerase Tampão da enzima MgCl 2 Primers DNTPs H 2 O Outros: DMSO, glicerol

26 Excesso MgCl 2 PCR

27 Excesso DNA PCR

28 Excesso primers PCR

29 PCR Curva DMSO 10% 12% 14%

30 Fase exponencial da PCR Acúmulo de seqüências-alvo durante a PCR em função do nº de ciclos: Fonte: Dieffenbach & Dveksler, 1995

31 PCR Inibidores Excesso de DNA Fenol, clorofórmio Etanol, isopropanol Proteínas H 2 0 (íons, metais pesados) Manipulador Taq, primers, DNTPs Falta de MgCl 2

32 PCR Pode sofrer alterações em relação ao tipo de tecido, condições da reação, experiência do manipulador Exige a padronização do teste ( in house ) Ocorrência de contaminações que levam a resultados falsos positivos e falsos negativos

33 Questão 1 Como podemos evitar a ocorrência de resultados falso-positivos?

34 Fontes de contaminação Combatendo as fontes de contaminação Identificação (fontes pré e pós-pcr) Redução Programa de controle

35 Fontes de contaminação Pré-PCR Manipulação de clones de plasmídeos Extrações repetidas do ácido nucléico molde Preparação do mix da reação

36 Fontes de contaminação Pós-PCR Execução da PCR Geração de aerossóis associada com a análise dos produtos Disseminação da seqüência-alvo

37 Esquema do processamento e análise de amostras Pré-PCR Pós-PCR Fonte: Theodore E. Mifflin

38 Laboratório de diagnóstico Contaminações Análises repetidas da seqüência alvo ( template ) Baixo limite de detecção da PCR (sensibilidade) Principal fonte de contaminação Contaminação pós-pcr pré-pcr

39 Controle da contaminação Dividir em áreas separadas a manipulação do DNA/RNA Extração Preparação do mix (DNTPs, MgCl 2, buffer) Execução da PCR Manipulação e análise dos produtos da PCR

40 Salas pré e pós-pcr Fonte: Theodore E. Mifflin

41 Programa de controle Esterilização dos reagentes Aliquotar os reagentes da PCR Água deonizada, equipamentos, pipetadores, ponteiras em cada sala Adição de controles positivo, negativo e branco (água)

42 Programa de controle Pipetar a amostra com DNA molde como último passo Uso de ponteiras com filtro, de luvas Descontaminação do ambiente (luz UV) Controle e remoção dos amplicons como base do controle da contaminação

43 Questão 2 Como podemos evitar a ocorrência de resultados falso-negativos?

44 Controle interno Seqüência de DNA, diferente da seqüência-alvo, adicionada a cada amostra para ser co-amplificada Detecta falhas na amplificação devido a presença de inibidores Seqüência baseada na seqüência do produto amplificado

45 Controle interno Utiliza os mesmos oligonucleotídeos Presente em todas as reações

46 Variações da técnica de PCR Variações da PCR DNA PCR DNA fs ou cdna RNA RT-PCR RT AAAAA PCR PCR

47 Variações da técnica de PCR Variações da PCR PCR Nested-PCR Multiplex-PCR DNA DNA fd DNA fd PCR PCR 1º par de primers PCR PCR DNA fd PCR 2 o par de primers Possíveis múltiplos pares de primers

48 Nested PCR 570 pb Produto da 1ª PCR BoHV-1 BoHV pb 236 pb

49 Semi-Nested PCR 608 pb Produto da 1ª PCR BoHV pb

50 Real time PCR Detecção da amplificação associada a cada ciclo durante a PCR Quantificação do DNA ou RNA viral (cdna) Ciclos ultra-rápidos (30 min a 2 horas) Nenhuma análise no final da reação de PCR

51 Real time PCR Fonte:

52 Referências THEODORE E. MIFFLIN. Setting up a PCR laboratory. Department of Pathology, University of Virginia, Charlottesville, Virginia VERLENGIA, R.; CRESPO HIRATA, R.D., HIRATA, M.H. Biologia Molecular - Prevenção e controle da contaminação nas reações de amplificação de ácidos nucléicos. NewsLab 43; p.69-80; ESTEVES, P.A.; SILVA, A.D.; SPILKI, F.R.; PINTO, L.S.; DELAGOSTIN, O.A.; FRANCO, A.C.; RIJSEWIJK, F.A.M.; ROEHE, P.M. Differentiation between bovine herpesvirus types 1.1; 1.2 and 5 (BoHV) by polymerase chain reaction followed by restriction enzyme analysis (PCR REA) of a carboxy-terminal region of glycoprotein C (gc) gene.in press. VAN ENGELENBURG, F.A.C.; MAES, R.K.; VAN OIRSCHOT, J.T.; RIJSEWIJK, F.A.M. Development of a Rapid and Sensitive Polymerase Chain Reaction Assay for Detection of Bovine Herpesvirus Type 1 in Bovine Semen. Journal of Clinical Microbiology. Vol. 31, No p

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