Técnicas moleculares

Transcrição

1 Técnicas moleculares

2 PCR Reação em Cadeia da Polimerase Inventada em 1983 por Kary Mullis é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas Kary Mullis ganhou o prêmio Nobel em 1993 pela invenção da PCR.

3 PCR Aplicações: seqüenciamento de genes diagnóstico de doenças hereditárias testes de paternidade e na medicina forense diagnóstico de doenças infecciosas Estudos populacionais

4 PCR Reação de PCR: DNA dntps (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) iniciadores (também chamados de primers) DNA polimerase solução tampão

5 PCR Toda esta mistura é colocada na máquina de PCR, o termociclador, que faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos

6 Desnaturação Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de DNA por meio da elevação da temperatura. As amostras são aquecidas a ºC durante um a vários minutos.

7 Hibridação A temperatura é reduzida a ºC durante alguns segundos. Os iniciadores hibridam com as sequências complementares do DNA molde

8 Extensão Eleva-se a temperatura a 72ºC por alguns segundos. A DNA polimerase faz a duplicação da cadeia a partir dos iniciadores

9 PCR desenho dos iniciadores Comprimento: em torno de 20 bases GC: ideal em torno de 50% Especificidade: pode ser testada no blast ( Evitar a formação de dímeros de iniciadores: pode ser testado em diversos programas (por ex.: FastPCR)

10 PCR-RFLP Enzima de restrição: mutação cria sítio de restrição mutação elimina sítio de restrição Transforma uma diferença de nt, que não detectada em uma eletroforese, em uma diferença de tamanho Fragmentos com tamanhos diferentes migram diferente na eletroforese

11 Enzimas de restrição Exemplo de enzima de restrição:

12 PCR-RFLP Produto da PCR 5'..GAA GCA GCA TGG...3' BsoFI 85 pb ' 21 pb

13 PCR-RFLP 85pb UU UK KK 106pb

14 PCR-SSCA (ou SSCP) Análise de Conformação de Fita Simples Descrita originalmente por ORITA e cols. (1989). DNA é amplificado por PCR Depois é desnaturado por calor Gel de poliacrilamida não desnaturante As fitas simples adquirem conformações tridimensionais e correm em posições diferentes no gel. Uma simples mutação de ponto pode alterar essa conformação e, conseqüentemente, o padrão de bandas do fragmento (IWAHANA e cols., 1992).

15 PCR-SSCA

16 PCR-SSCA

17 Seqüenciamento didesoxi Método de Sanger Síntese de DNA na presença de nucleotídeos didesoxi, os quais não tem o grupo 3 -hidroxila. Eles podem ser incorporados na cadeia, mas terminam a síntese

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20 PCR em tempo real É uma técnica para a detecção e medida de produtos gerados durante cada ciclo da PCR A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumentará na proporção direta da quantidade de produto da PCR. Em tempo real é possível saber a quantidade de produto em um ponto no qual a reação ainda está na fase exponencial Por este motivo, essa técnica permite a quantificação, o acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, pois não mais requer a detecção em gel de eletroforese.

21 PCR em tempo real

22 PCR em tempo real SYBR Green é um fluoróforo em suspensão, intercalante de DNA dupla fita, que emite uma fluorescência verde com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador. Durante a PCR, as moléculas do SYBR Green vão se ligando ao DNA recém sintetizado Um aumento da fluorescência é observado em tempo real, o que possibilita o monitoramento contínuo da reação

23 PCR em tempo real SYBR Green

24 PCR em tempo real Taqman

25 PCR em tempo real

26 PCR em tempo real Quantificação Aplicações Detecção de carga viral Determinação do número de cópias de um gene Análise da expressão gênica

27 PCR em tempo real Exemplo de aplicação: Investigação de amplificação ou deleção dos genes BCHE e ACHE em tecido mamário tumoral com relação ao tecido normal.

28 PCR em tempo real Quantificação relativa TumorCHE / Tumor18S Q = SangueCHE / Sangue18S

29 PCR em tempo real Gene BCHE Sem Informação 20,93% Amplificado 18,60% Inalterado 9,30% Deletado 51,16%

30 Genotipagem

31 Genotipagem

32 FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs Características da Amostra Detalhes dos Genótipos Frequência Alélica População 1 Grupo n 2 TT TC CC HW T C Guarani (GRC) Ameríndio 58 0,431 0,414 0,155 >0,250 0,6379 0,3621 Kaingang (KRC) Ameríndio 58 0,793 0,190 0,017 >0,500 0,8898 0,1102 Japão (JPT) Asiático 85 0,294 0,494 0,212 >0,950 0,5410 0,4590 China (HCB) Asiático 81 0,272 0,506 0,222 >0,750 0,5250 0,4750 Europa (CEU) Euro-americano 111 0,441 0,477 0,081 >0,250 0,6800 0,3200 Nigéria (YRI) Africano 112 0,955 0,045 0,000 >0,750 0,9780 0,0220 Fonte: Alves, 2009

33 FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs3495 Características da Amostra Detalhes dos Genótipos Frequência Alélica População 1 Grupo n 2 GG GA AA HW G A Guarani (GRC) Ameríndio 57 0,000 0,035 0,965 >0,750 0,0175 0,9825 Kaingang (KRC) Ameríndio 58 0,000 0,069 0,931 >0,750 0,0345 0,9655 Europa (EUR) Euro-americano 24 0,042 0,375 0,583 1,000 0,2290 0,7710 China (CHN) Asio-americano 24 0,000 0,458 0,542 0,150 0,2290 0,7710 Afro-brasileiros (AFBII) Afro-brasileiro 218 0,170 0,427 0,404 >0,100 0,3830 0,6170 África (AFR) Afro-americano 22 0,364 0,591 0,045 0,150 0,6590 0,3410 Fonte: Alves, 2009