Técnicas de biologia molecular. da análise de genes e produtos gênicos únicos a abordagens em larga escala

Transcrição

1 Técnicas de biologia molecular da análise de genes e produtos gênicos únicos a abordagens em larga escala

2 os mesmos genes, qual a diferença?

3 Dogma central

4 Localizando alvos Técnicas iniciais para evidenciar determinadas moléculas de interesse DNA / RNA métodos baseados em hibridização

5 Hibridização desnaturação / renaturação de ácidos nucléicos

6 Light absorption and temperature in DNA denaturation. (a) Melting of doubledstranded DNA can be monitored by the absorption of ultraviolet light at 260 nm. As regions of double-stranded DNA unpair, the absorption of light by those regions increases almost twofold. The temperature at which half the bases in a doublestranded DNA sample havedenatured is denoted Tm (for temperature of melting). Light absorption by single-stranded DNA changes much less as the temperature is increased. (b) The Tm is a function of the G C content of the DNA; the higher the G C percentage, the greater the Tm.

7 Southern blot DNA é hibridizado com uma sonda um fragmento de DNA de seqüência conhecida que contém algum tipo de marcação e pode ser detectado. Mostra sequências complementares à sonda detecta pequenas quantidades (1 to 10 pg por banda) de uma sequência específica 1000 vezes mais sensível que EtBr

8 Southern blot - etapas Etapas: amostra de DNA submetida à eletroforese mobilidades registradas DNA transferido para um filtro (nitrocelulose ou nylon) criando uma cópia do gel DNA é imobilizado no filtro

9 Sothern blot - marcação de sonda Incorporação no DNA de nt marcado radioativamente (p ex. alfa fosfato P-32), ou por adição de um grupamento químico (digoxigenina ou biotina) COMO? "End labeling enzima polinucleotídeo quinase transfere fosfato terminal de nt radioativo P-32-gamma- para a extremidade 5 do DNA

10 Sothern blot - Hibridização da sonda ao DNA imobilizado no filtro A sonda é desnaturada (fervida) e adicionada (em excesso) em solução sobre filtro Sonda hibridiza com seqüências complementares

11 Sothern blot - lavagens e detecção Lavagens retiram excesso de sonda e desfazem ligações inespecíficas (temperatura, força iônica) Permanecem as ligações específicas Revelação com base na marcação da sonda

12 Sothern blot - revelação Sonda radioativa- filtro é exposto a filme raio X, revelado Sonda marcação química filtro é exposto a anticorpo conjugado a enzima (p ex. fosfatase alcalina) + substrato que pode gerar produto colorido ou luz a posição da sonda é revelada

13 os mesmos genes, qual a diferença?

14 Análise dos transcritos: Northern Blot Extrair RNA dos organismos ou tecidos eletroforese de RNA transferência do RNA para uma membrana marcação de sequências conhecidas (sondas) Hibridização para localizar sequências alvo Visualização e quantificação do sinal de hibridização

15 Análise da expressão de proteínas: Extrair proteínas das células eletroforese desnaturante transferência das ptns para uma membrana Reação com anticorpo 2o anticorpo marcado Visualização e quantificação do sinal Western Blot

16 Sequenciamento de DNA Reação de sequenciamento - replicação de DNA molde: DNA plasmídeo, fragmento ou produto de PCR (200 ng) um primer 20 nt complementar a uma região de uma das fitas de DNA tampão + dntps enzima variante da Taq polymerase

17 Reação de polimerização Desnaturação do DNA 96 o C 10 min + formamida PCR 96 o C 10, 50 o C 5, 60 o C 4 25 X 2 fitas de DNA molde se separam, primer anela a uma delas especificamente, polimerase estende o primer apenas uma fita é sintetizada, não amplifica DNA

18 Método término da síntese de DNA por dideoxint dideoxinucleotídeos - sem 3' OH ao serem adicionados à extremidade do DNA não há como continuar a síntese atuam como terminadores da síntese a maior parte dos nt são normais, uma fração são ddntp

19 Sequenciamento de DNA - reação Ex: ddttp dttp normal em excesso, incorporado na maioria dos casos, a extensão continua entrada de ddttp aleatória, a fita para ao fim milhões de moléculas incluem paradas em todas as posições de T todas as moléculas têm o mesmo início mas términos variados tamanhos variados são separados por eletroforese

20 Sequenciamento de DNA - reação Dideoxi nt quimicamente modificados por adição de corante fluorescente. Reação com os 4 ddntps (A, G, C, T) cada um com uma cor diferente permite ler a seqüência de DNA

21 Sequenciamento de DNA - automático Leitura: sequenciador de DNA contém fonte de laser que atravessa o gel com um scanner, são registrados os comprimentos de onda de emissão quando cada fragmento de DNA passa pelo detector. Cada tipo de base com um comprimento de onda próprio.

22 Sequenciamento de DNA - resultado Software de análise de sequência fornece a leitura das bases e um gráfico com intensidade de sinal, qualidade da sequência, tamanho pode chegar a 700 nt