Hibridação de ácidos nucleicos. de cromossomo a chip de DNA

Transcrição

1 Hibridação de ácidos nucleicos de cromossomo a chip de DNA

2 Hibridação de ácidos nucleicos Pareamento complementar de bases entre duas fitas simples de ácido nucleico DNA DNA RNA RNA DNA - RNA

3 Hibridação de ácidos nucleicos Pareamento complementar de bases entre duas fitas simples de ácido nucleico DNA DNA RNA RNA DNA - RNA

4 Hibridação de ácidos nucleicos ALVO: Molécula a ser identificada ou estudada sequencia de RNA ou DNA. É uma população de sequencias de DNA heterogênia ou complexa SONDA: Se liga à sequencia alvo específica sequencia de DNA (RNA, sequencias específicas de DNA, DNA genômico total). É um fragmento de DNA marcado (32P, 35S ou biotina), utilizado para detectar moléculas de ácido nucléico com sequencias complementares, por meio de hibridação MARCADOR: Molécula detectável que se liga à sonda (material radioativo, produto enzimático ou composto fluorescente) - marcadores radioativos: H3, P32, P33, S35 - marcadores enzimáticos: fosfatase alcalina, peroxidase - marcadores fluorescentes: FITC (Fluoresceína Isotilcianato), AMCA (Amino Metil Cumarina Ácido Acético), Texas Red

5 Características das sondas de ácidos nucleicos

6 Marcação de sondas Marcação com radioisótopos

7 Marcação de sondas Marcação não radioativa DIG - Digoxigenina

8 Marcação de sondas com radioisótopos Random primer

9 Marcação de sondas com radioisótopos Nick translation

10 Marcação de sondas com radioisótopos Quinase ou klenow

11 O que é hibridação? É o pareamento de fitas complementares de DNA ou RNA para produzir hélices duplas do tipo DNA-DNA, RNA-RNA ou DNA-RNA

12 Denaturação e renaturação do DNA Denaturação (ou melting ): alta temperatura, alto ph Renaturação: Formação de duplex em condições subdenaturante (Marmur e Doty, 1960)

13 Como se mantem unidas as fitas? Pontes de hidrogênio entre as bases Interações hidrofóbicas entre as bases adjacentes de uma mesma fita.

14 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos Número de pares GC v/s pares AT; Grau de complementariedade; Tamanho das fitas (número de pares de bases) ; Concentração de sal na solução; Temperatura; Concentração de formamida (para híbridos de RNA).

15 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos Número de pares GC v/s pares AT: Maior número de ligações de H entre as fitas maior estabilidade dos híbridos. 3 ligações de H entre G e C 2 ligações de H entre A e T

16 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos Grau de complementariedade: Menor complementariedade de bases: menos ligações de H formadas; menor estabilidade.

17 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos Tamanho das fitas: Maior tamanho (cdnas >200pb): mais ligações de H; maior estabilidade do híbrido. Menor tamanho (oligos <50pb): Maior especificidade; Menor probalidade de hibridização cruzada.

18 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos Concentração de sal na solução: [sal] estabilidade do híbrido Cátions monovalentes (Na+) ou divalentes (Mg++) As cargas negativas dos grupos fosfato repelem umas às outras. Os íons positivos da solução reduzem a repulsão eletrostática entre as fitas.

19 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos Temperatura: Maior T aumenta a energia cinética das fitas e desestabiliza a estrutura dos ácidos nucléicos. as fitas se separam

20 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos ph: [OH- ] ionização dos grupos fosfato, favorecendo a repulsão eletrostática entre as fitas. Concentração de formamida: Provavelmente forma ligações de H com os ácidos nucléicos; Desestabiliza a formação de híbridos.

21 O efeito combinado destes fatores pode ser expresso em uma equação para o cálculo da Tm O que é Tm? Tm = temperatura de melting ou temperatura de separação das fitas. A Tm é uma medida de estabilidade dos híbridos, definida como a temperatura na qual 50% dos híbridos se encontram formados e 50% permanecen dissociados. 50% %

22 Temperatura de fusão (Tm) Denaturação do DNA pode ser seguida pelo aumento da densidade optica e é denominada de temperatura de fusão ou temperatura de melting (Tm) Temperatura em que metade das fitas estão no estado nativo (aneladas) e a outra metade estão no estado denaturado

23 Estringencia de hibridação Quanto maior a estringencia de hibridação, maior a especificidade da hibridação Menor quantidade de sal Aumento da temperatura Uso de desnaturantes Fatores que tendem a diminuir a hibridação - os híbridos se mantêm pela especificidade e complementariedade

24 O que é um alvo? É uma população de sequencias de DNA heterogênia ou complexa

25 Uso da sonda para identificar um alvo Hibridação do filtro estabele quando uma solução de DNA (ou RNA) denaturado contem sequencias complementares as fitas imobilizadas no filtro

26 Análise de Hibridização Imobilização; Adição das sondas na solução de hibridização; Lavagem: grau de complementaridade; Sondas: 100 a 1000 bp marcados radioativamente; Diversos protocolos: Southern e Dot

27 Hibridação de ácidos nucleicos Método para identificação e localização de ácidos nucleicos em materiais fixados

28 Hibridação cromossômica Sondas cromossômicas Cariótipo humano masculino normal

29 Hibridação cromossômica Hibridação em núcleos interfásico Cromossomo 18 (azul), X (verde) e Y (vermelho) Cromossomo 13 (vermelho) e 21 (verde)

30 Hibridação cromossômica Alteração cromossômica estrutural: Translocação Alteração cromossômica estrutural: Deleção

31 Hibridação cromossômica Alteração cromossômica numérica: Aneuploidia - Trissomia EXEMPLO = Síndrome de Down em humanos (trissomia do autossomo 21) Normal Cromossomo 13 (azul) e 21 (vermelho) Down Cromossomo 13 (azul) e 21 (vermelho)

32 Hibridação cromossômica Mapeamento dos cromossomos humanos

33 Hibridação em membrana Um ácido nucleico é fixado a uma membrana (alvo) e o outro ácido nucleico (sonda) é marcado e mantido em solução - Southern blot hibridação de DNA Southern EM (1975) Detection of specific sequence among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: Northern blot hibridação de RNA - colony blot - colonias de bactérias - Dot blot amostrsd e DNA/rna - Macroarray amostras de DNA -Microarray amostras de DNA/oligos - Chips de DNA

34 Hibridação em membrana

35 Como identificar o clone de interesse numa biblioteca de DNA? Sequencia do mesmo gene clonado em outra especie Síntese de oligonucleotídeo a partir da sequencia proteica Reação antígeno-anticorpo

36 Identificando sequencias alvo

37 Hibridação de colônias

38 Obtenção de uma sonda de DNA a partir da sequencia proteica

39 Reação antígeno anticorpo

40

41 Southern blotting análise de DNA Northern blotting análise de RNA Western blotting análise de proteínas