Universidade Estadual de Maringá - UEM

Transcrição

1 Universidade Estadual de Maringá - UEM Disciplina: Biologia Molecular 6855 T1 e T2 Ciências Biológicas Transcriptoma metodologia ORESTES Profa. Dra. Maria Aparecida Fernandez

2 Estratégia ORESTES ESTs de diferentes estágios do ciclo de vida Iniciativa para anotação genômica

3 Gera ESTs da porção central do transcrito. Permite a identificação de genes raros. Open Reading frame Expressed Sequence Tag Utilização de primers arbitrários e em condições de baixa estringência, em cdna. Aplicável em todos os organismos, sejam células simples ou complexas.

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9 Amostras biológicas e extração de RNA Geração de perfis ORESTES Análises de seqüências

10 Amostras biológicas e extração de RNA Amostras de quatro estágios do ciclo de vida foram coletadas de colônias mantidas no apiário do Departamento de Genética, USP, campus Ribeirão Preto. Ovo Larvas Pré-pupa Pupas Adulto RNA total foi isolado com reagente TRIzol (Invitrogen).

11 RNA total mrna AAAAA AAAAA AAAAA 1 AAAAA AAAAA AAAAA 2 RNA cdna 3 5 UTR ORF P 3 UTR AAAAAAAAA 4 Eliminação da seqüência do vetor 10 Comparação das seqüências com os bancos de dados M Eliminação das seqüências de baixa qualidade ~ ~

12 mrna isolado pelo kit Oligotex II (Qiagen). Northern blot. Southern blot. mrna RT cdna PCRTD Geração de perfis ORESTES

13 Checar qualidade das seqüências: Análises de seqüências Base Caller Cimaron 1.53 Slim Phredfy (tamanho do inserto > 100, N nucleotídeos menor do que 20% e N repetições menor do que 6 nucleotídeos). Score-Card (MegaBACE ). Reads > 100 nt foram submetidos a um protocolo automático para análise de dados (Pipeline de Anotação Gênica) de ORESTES de Apis mellifera. 1. Conversão do eletroferograma 2. Detecção e remoção do primer e vetor (Cross_match) 3. Mascaramento de repetições (Repeat-Masker)

14 Checar qualidade das seqüências: Análises de seqüências Seqüências em formato fasta validadas foram submetidas ao BLASTN no GenBank para seqüências de mtrna e rrna, assim como RNA de bactérias e fungos para detectar e eliminar seqüências contaminantes. ORESTES de A. mellifera foram comparadas com as seqüências de ESTs já depositadas no dbest do GenBank (valor E ). BLASTX (valor E ). CAP3: agrupar as seqüências ORESTES.

15 ORESTES de abelha (AmORESTES) Classificação pela Ontologia Gênica (GO) Clustering dos ESTs de abelha Comparação entre genomas

16 ORESTES de abelha 87 mini-bibliotecas de quatro estágios do ciclo de vida de operárias seqüências (seqüência > 100 bases; Phred 15; tamanho médio 373,9 pb) CK a CK633558

17 ORESTES de abelha

18 AmORESTES seqüências ORESTES 488 contigs; 519 pb; 893 singlets

19 Comparações do BLASTX com banco de dados nrncbi: - 28,5% dos contigs e 9,2% dos singlets: ortólogos. As melhores comparações foram classificadas de acordo com as espécies ou as ordens superiores: 89,6% artrópodes. 16,2% 43,9% AmORESTES 29,5% A maior fração dos ortólogos mostrou melhor alinhamento com genes de Anopheles. As seqüências ORESTES foram classificados como ortólogos a Drosophila.

20 Classificação pela Ontologia Gênica (GO) 326 contigs foram atribuídos a 3 níveis de classificação GO: - Componentes celulares - Processos biológicos - Funções moleculares

21 Clustering dos ESTs Agrupamento dos contigs gerados (contigs AmORESTES) com ESTs de A. mellifera já existentes no dbest do NCBI. Agrupamento realizado no CAP3 resultou em um total de contigs e tende a um aumento geral na intensidade dos reads. Distribuição dos reads de AmNCBI e AmORESTES e contigs misturados

22 Clustering dos ESTs Para a mistura dos contigs: aumento crescente de 150 pb no comprimento dos contigs. As seqüências ORESTES adicionam informações consideráveis para a caracterização do transcriptoma de abelha e para estudos subseqüentes de genes específicos. AmNCBI AmORESTES Distribuição dos tamanhos de ESTs.

23 Comparação de genoma Análise cruzada do genoma com os contigs. Pesquisas no BLASTX, usando as seqüências de abelha em bancos de dados de proteína: - Drosophila melanogaster - Anopheles gambiae - Caenorhabditis elegans - Humanos - Protozoários - Fungos

24 Comparação de genoma Padrão de similaridade e representação dos agrupamentos de ESTs de Apis (ORESTES + dbests NCBI) com proteínas de outros organismos. Estas comparações pelo BLASTX foram realizadas com valor E 10-6.

25 A metodologia ORESTES contribui para a anotação genômica e também permite a comparação cruzada entre transcriptomas para revelar as tendências evolucionárias em genomas de insetos. As comparações realizadas entre os genomas destacam que o número elevado de genes específicos de Apis ainda necessitará de um seqüenciamento extensivo do transcriptoma para anotação genômica de alta qualidade. Importante função na organização do genoma de insetos e sistemas modelo em estudos comparativos.