PROCESSAMENTO DE RNA. Prof. Marcelo A. Soares. Universidade Federal do Rio de Janeiro

Transcrição

1 PROCESSAMENTO DE RNA Prof. Marcelo A. Soares Laboratório rio de Virologia Molecular Universidade Federal do Rio de Janeiro Curso de Genética Molecular I - Ciências Biológicas

2 Transcrição/Tradução Em procariotos são eventos quase concomitantes: o mrna já está sendo traduzido à medida em que é transcrito Em eucariotos os dois eventos são conduzidos em compartimentos celulares diferentes: a transcrição no núcleo e a tradução no citoplasma Especializações requeridas em eucariotos

3 Transcrição/Tradução mrna procariótico é extremamente lábil e começa a ser degradado pela extremidade 5 antes da transcrição terminar transcrição, tradução e degradação correm juntas

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5 mrna Sequência codificadora que começa no AUG e termina no codon de terminação (TAG, TGA ou TAA) Região 5 não traduzida (líder) Região 3 não traduzida (trailer) Maioria em procariotos é policistrônica Maioria em eucariotos é monocistrônica

6 mrna de Eucariotos Sofre 3 modificações básicas: Inserção de cap na extremidade 5 Inserção de uma cauda poli(a) na extremidade 3 Retirada de íntrons (splicing) Da transcrição à tradução, podem se passar minutos Meia-vida média de 4 a 24h, comparada à de 2 min de um mrna procariótico

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8 Cap em 5 Consiste na adição de uma guanina no grupamento fosfato da extremidade 5 do 1 o nt do mrna, em uma ligação 5-5 Esta guanina é invariavelmente metilada na sua posição 7 pela guanina-7-metiltransferase (cap 0) Outros grupamentos metila podem ser adicionados à segunda base (cap 1) e à terceira (cap 2), dependendo do organismo e da base naquela posição

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10 Poliadeniação de mrnas A cauda poli(a) NÃO é codificada no DNA; ela é adicionada ao mrna após a transcrição, no núcleo, pela enzima poli(a)-polimerase ~ 200 resíduos de A são adicionados e depois se associam à PABP (poli(a) binding protein) numa razão de um monômero para cada bases A

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12 Funções do Cap e do Poli(A) Estabilidade do mrna eucariótico Transporte nucleocitoplasmático Degradação da poli(a) parece preceder a degradação do mrna Poli(A) parece ser essencial na iniciação da tradução controle da tradução Poli(A) pode ser usada para purificação de mrna e também para construção de bibliotecas de cdna

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14 mrnas e Splicing Genes típicos de eucariotos possuem 7-8 éxons, estendem-se por ~16kb; éxons são pequenos (~100 a 200 pb) e íntrons são maiores (~1kb) RNA não processado no núcleo é chamado de pré-mrna ou hnrna devido à sua variabilidade de tamanho hnrna está associado à ptns no núcleo (hnrnps)

15 Tipos de Splicing Splicing com o envolvimento de ribonucleoptns que reconhecem as extremidades e uma porção central dos íntrons e catalizam a reação Splicessoma Splicing por atividade autocatalítica dos próprios RNAs dependente de suas estruturas secundárias/terciárias Splicing em precursores de trna envolvendo atividades enzimáticas

16 Junções éxons - íntrons Não possuem extensa conservação ou complementaridade, mas têm pequenas seqs consensuais conservadas Sítio esquerdo ou doador GU (GT no DNA) Sítio direito ou receptor AG Os sítios de reconhecimento são genéricos, ou seja, qq sítio doador de qq espécie pode se combinar com um receptor de qq outra Como acontece a especificidade? Parecem existir ordens preferenciais de splicing, que garantem o processamento apropriado de um mrna (conformação do RNA?)

17 mrna de ovomucóide

18 Mecanismo Molecular do Splicing

19 Sítio de Ramificação Sequência consensual UACUAAC Normalmente próximo ao sítio receptor (~18 a 20 nts); esta distância parece importante

20 O Aparato do Splicing Os três sítios (doador, receptor e de ramificação) são reconhecidos por ribonucleoptns Os RNAs são pequenos (100 a 300 bases) e são chamados snrnas; suas associações com ptns os tornam snrnps ( snurps ) (U1, U2, U5, U4, U6) splicessomos Splicessomos 50-60S Formados em estágios por cooperatividade sobre o mrna

21 snrnps individuais são formadas por um snrna e ~20ptns Algumas snrnps estão envolvidas no reconhecimento do pré-mrna (através de pareamento com este último), outras em interações ptn-ptn; outras ainda fazem os dois tipos de reconhecimentos

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23 snrna e reconhecimento do pré-mrna

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26 snrnps também estão envolvidas em outros processos, como na poliadenilação e na formação de rrna

27 Splicing Alternativo Uso diferencial das junções de excisão, criando combinações alternativas de éxons Podem ocorrer em uma mesma célula, ou em células, tecidos ou fases de vida diferentes Controlado por relações estequiométricas de fatores de splicing (SFs), que conduzem ou não a utilização do sítio 5 mais próximo ao 3 Exemplos: Antígenos T e t de SV40 Tropomiosina de camundongos Produção de calcitonina em mamíferos Determinação de sexo em Drosophila

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32 Cis- X Trans-Splicing

33 Trans-Splicing - Exemplos Sequências líder em Trypanossoma Genes de actina em C.elegans Genes de cloroplastos

34 Splicing de trna em Leveduras Não ocorre por transesterificações (transferências coordenadas), mas sim por clivagem e religação separadas Possuem um único intron ao lado do anticodon, e que pareia com este último O pareamento é importante para o splicing A reação é dependente de energia (gasta ATP)

35 Clivagens conduzidas por uma endonuclease atípica (sub-unidades Sen34 e Sem2) Ligação é feita por uma RNA ligase