Prof. João Carlos Setubal

Transcrição

1 Prof. João Carlos Setubal QBQ 102 Aula 4 (biomol) Replicação e expressão

2 Replicação Dogma Central da Biologia Molecular Transcrição RNA mensageiro Usa Uracila ao invés de Timina Tradução de mrnas Ocorre no ribosomo Proteína

3 Divisão celular Uma célula mãe gera duas células filhas Cada célula filha tem o mesmo conjunto de cromossomos que a mãe Mitose Tem que haver duplicação do DNA Isso ocorre graças ao processo de replicação

4 Duplicação dos cromossomos Separação dos cromossomos e divisão celular

5 Como a hélice dupla consegue se reproduzir? O truque é a duplicidade da hélice e a complementaridade das bases Dada uma fita, consigo saber a outra

6 Replicação do DNA O mecanismo de replicação está baseado no pareamento das bases da dupla hélice do DNA. A estrutura do DNA contém a informação necessária para perpetuar sua sequência de bases Cadeia parental Cadeia parental Cadeias filhas

7 A replicação é uni ou bi-direcional? Replicação unidirecional Origem 5 3 Replicação bi-direcional 3 5 Origem

8 A replicação é bidirecional Forquilha de replicação Origem (ori)

9 Forquilha de replicação: Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas

10 Polimerases de DNA: As enzimas que sintetizam DNA A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos a extremidade 3 OH da cadeia em crescimento. A DNA polimerase requer um primer (iniciador) e um molde O precursor da síntese é desoxirribonucleosídeo 5 trifosfato Sentido da síntese sempre é 5 3 A replicação é um processo extremamente fiel. As DNA-polimerases tem atividade revisora

11 Desoxiribonucleosídeo 5 trifosfato (precursor) Fita sendo polimerizada Fita molde Desoxirribose

12 As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador ou primer (segmento de DNA ou RNA) previamente pareado ao molde que será copiado

13 correto Pareamento de bases incorreto

14 Atividade revisora do sítio de exonuclease 3 5 presente nas DNA polimerases garante a fidelidade da replicação A enzima avança 1 nucleotídeo Pareamento incorreto causa remoção do nucleotídeo

15 Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas Pol I PolII PolIII Polimerização Exonuclease Exonuclease Número de subunidades Tamanho em kda ~900 Velocidade de Polimerização(nt/seg) Processividade (nt adicionados antes da dissociação do molde)

16 A replicação numa das fitas apresenta um problema 3' 5'

17 Fita contínua (líder) Movimento da forquilha Fita descontínua

18 Fita contínua (líder) Fita descontínua Fitas parentais Fragmentos de Okazaki Movimento da Forquilha de Replicação

19 A síntese do DNA é semi-descontínua e requer vários iniciadores (primers) de RNA para síntese da fita descontínua Síntese da Fita descontínua Fita descontínua Fita contínua Síntese da Fita Contínua

20 Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas A DNA ligase sela as quebras

21 Primer de RNA Síntese da Fita descontínua Remoção do Primer de RNA Preenchimento da lacuna Une os dois fragmentos de DNA

22 A DNA ligase sela as quebras

23 Mecanismo de ação da DNA ligase

24 Fita contínua (líder) Movimento da forquilha Fita descontínua

25 Síntese das fitas contínua e descontínua é independente Fita descontínua Fita contínua (líder) A enzima tem que se translocar para recomeçar a síntese de um novo fragmento de Okasaki

26 O complexo de replicação A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha Cada cerne catalítico da DNA Pol III sintetiza uma das fitas-filhas Uma das fitas molde é afastada do primossomo Proteínas SSB mantém as fitas parentais separadas

27 Síntese da Fita contínua (DNA pol III) Fita descontínua RNA primer do fragmento de Okazaki anterior Síntese da Fita descontínua (DNA pol III)

28 Proteínas presentes na forquilha de Replicação de E.coli SSB DnaB (helicase) Primase (DnaG) DNA Polimerase III DNA Polimerase I DNA Ligase DNA girase Liga a fita simples de DNA Desenrola o DNA Sintetiza os primers de RNA Síntese da fita nova Preenche as lacunas e excisa os primers Liga os fragmentos Superenrolamento

29 A replicação é vista como um olho flanqueado por DNA não replicado

30 O genoma bacteriano circular constitui um único replicon A velocidade da forquillha de replicação bacteriana é 50000pb/min Uma única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)

31 A replicação do cromossomo circular

32 Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação Replicon: 1. Origem + Término 2. Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular 3. O genoma de uma célula procariótica em geral constitui um único replicon 4. Cada cromossomo eucariótico constitui vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente

33 O genoma eucariótico constitui-se de vários replicons A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000pb/min Os replicons eucarióticos tem kb e são iniciados em tempos diferentes Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática

34 Telômero Cromossomo mitótico Centrômero Cromátides irmãs Telômero

35 telômero Sequências adicionadas nas extremidades dos cromossomos eucarióticos que ajudam a estabilizar o cromossomo -Levedura: repetições (T x G x ) n -Célula humana: 1500 repetições centrômero telômero

36 Replicação de cromossomos lineares telômero centrômero telômero = primer de RNA remoção resulta no encurtamento da fita de DNA ao longo de sucessivas replicações

37 Telômeros: ajudam a estabilizar as extremidades do cromossomo telomerase RNA molde associado à telomerase Polimerização e anelamento Translocação e novo anelamento Polimerização adicional Telômeros humanos = 5 a 15kb

38 A extensão da extremidade 3 pela telomerase soluciona o problema da replicação das extremidades de cromossomos lineares Telomerase estende a extremidade 3 do telômero A extremidade 3 adicional serve de molde para síntese de novo fragmento de Okasaki

39 Reparo para correção de erro após a replicação

40 Replicação DNA semi-metilado Após alguns minutos da replicação, a nova fita de DNA sintetizada é metilada e as duas fitas não podem ser mais diferenciadas Metilação da adenina no sítio GATC identifica qual a fita é a parental

41 Reparo para correção de erro Correção de erros que escapam da atividade revisora da DNA polimerase durante a replicação Metilação garante que a fita a ser reparada seja a fita filha

42 Reparo para correção de erro Pareamento incorreto Complexo de enzimas para correção de erros: MutS reconhece o pareamento incorreto MutH cliva a fita não metilada e exonucleases degradam um trecho desta fita Reparo por excisão de nucleotídeos

43 Expressão gênica Expressão de um gene = criação de um mrna maduro Expressão da proteína = criação de uma proteína funcional O que causa a expressão de um gene? Qual condição? Diferentes tecidos do corpo expressam diferentes genes Quanto de um gene é expresso num dada condição? Tão importante quanto o conteúdo gênico

44 Expressão gênica constitutiva X Expressão gênica regulada Indução Repressão

45 Níveis de Controle da Expressão Gênica Remodelamento da cromatina (E) Início da Transcrição (E e P) Processamento do Transcrito (E) Transporte do mrna para o citoplasma (E) Estabilidade do transcrito (E e P) Tradução do mrna (E e P) E= Eucariotos P= Procariotos

46 Núcleo Remodelamento da cromatina Transcrição Processamento Etapas em que a expressão gênica em eucariotos pode ser regulada Transporte Estabilidade do transcrito Tradução Citoplasma

47 Sinais que Regulam a Expressão Gênica: eucariotos Hormônios Neurotransmissores Fatores de Crescimento Fatores de Diferenciação Celular Contato célula-célula Odores Alterações nutricionais Alterações ambientais (ex: osmolaridade, temperatura) Luz Temperatura Toque mecânico Etc, Etc, Etc...

48 As bactérias tem um mecanismo simples de coordenar a expressão de genes que estão relacionados: estes genes estão organizados em uma unidade transcricional chamada operon Sítio de ligação do Ativador Sítio de ligação do repressor Operador Promotor Gene regulador Sequências regulatórias Genes estruturais OU Ativador Repressor A B C mrna policistrônico

49 Transcritoma Conjunto de todas moléculas de RNA (transcritos) em uma célula, tecido ou organismo em uma dada condição fisiológica ou patológica

50 Expressão diferencial

51 Redes de regulação gênica

52 A regulatory network in mouse ESC anchored on the master regulators Oct4, Sox2, and Nanog. Zhou Q et al. PNAS 2007;104: by National Academy of Sciences

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