Replicação do DNA & Transposons

Transcrição

1 Replicação do DNA & Transposons Enzimas e Mecanismos Envolvidos na Replicação e Transposição do DNA Prof. Henrique S. Costa, M.Sc.

2 Replicação do DNA e ciclo celular Replicação e Ciclo Celular estão intimamente conectados. A freqüência do ciclo de replicação deve ajustar-se a velocidade de crescimento da célula. O término da replicação necessita ajustar-se à divisão celular. Sinais celulares para o crescimento e divisão celular síntese de proteínas, falta de aminoácidos, ligação entre DNA e membrana celular (mesossomo) etc. # No processo de divisão celular, os cromossomos precisam estar completos. # A célula têm de possuir um tamanho celular mínimo necessário.

3 Replicação do DNA e ciclo celular PROCARIOTOS # E. coli 20 minutos (formação de novas gerações) # Ponto-chave na relação entre replicação e ciclo celular momento em que o processo de duplicação do cromossomo deve ser iniciado. # O ciclo de replicação deve ocorrer bem antes do processo de divisão celular. # Presença de cromossomos com várias forquilhas de replicação em diferentes estágios de desenvolvimento.

4 Replicação do DNA e ciclo celular PROCARIOTOS EUCARIOTOS

5 Replicação do DNA e ciclo celular PROCARIOTOS # Pontos-chave na relação entre replicação e ciclo celular momento em que o processo de duplicação do cromossomo deve ser iniciado. ligação física entre DNA e membrana celular. # Origem de replicação seqüências GATC (sítios de metilação da Adenina). Metilação adição do radical metil ( CH3) na base nitrogenada tornando o DNA susceptível ao início da replicação. metilases (EcoR1 e BamH1)

6 Procarioto E. coli

7 Replicação do DNA e ciclo celular PROCARIOTOS # Origem de replicação formação de DNA hemi-metilado (nova fita sintetizada) que se liga a membrana celular (mesossomo) segregação de cada cromossomo para cada uma das células após a o processo de divisão celular.

8 Anel Perisseptal Replicação em Procarioto

9 Replicação do DNA e ciclo celular EUCARIOTOS G1 período variável entre diferentes organismos (iniciam seu ciclo como diplóides). S iniciação das origens de replicação (ao final, a célula é tetraplóide). G2 preparação do núcleo para divisão. Mitose divisão celular (manutenção do número de cromossomos)

10 Replicação do DNA e ciclo celular EUCARIOTOS Duplicação do material genético ativação das origens de replicação em diferentes tempos. # Sinais celulares para o início da fase S ativação da primeira origem de replicação.

11 Replicação do DNA e ciclo celular

12 Origem de replicação Características das regiões de início de replicação presença de grande quantidade de sítios AT. Vírus, plasmídeos e células procarióticas possuem apenas uma origem de replicação. # Eucariotos várias origens de replicação.

13 Origem de Replicação

14 Origem de Replicação

15 Replicação em Procarioto

16 Replicação em Procarioto Complexo inicial ligação de DNaA (proteína) em seu sítio de ligação (4 seqüências repetidas de 9 pb (5 TTAT(C/A)CA(C/A)A 3 )). Complexo aberto dependente das alterações estruturais no DNA em função do complexo DNaA:oriC (separação das 2 fitas na seqüência de 13 pb). HU, IHF (proteínas) estimulam a reação a partir da estabilização da curvatura do DNA. Complexo pré-priming ligação de DNaB (proteína) na região de 13 pb. Formação do complexo DNaB:DNaC. # DNaB mantém as 2 fitas de DNA dissociadas, permitindo que a replicação continue (helicase).

17 Replicação em Procarioto Complexo Inicial Complexo Aberto Complexo Pré-priming

18 Replicação em Procarioto

19 Replicação em Procarioto Características Proteína Iniciadora Monômero de 52 kda Liga-se as 4 seqüências de 9pb Ligação Cooperativa 20 a 40 monômeros Função Liga-se a origem Induz abertura da fita de DNA Posiciona DnaB em oric

20 Replicação em Procarioto DnaB Características Helicase Hexâmero (54 kda) Liga-se as 3 seqüências de 13pb Ligação Dimerizada DnaB-DnaC Função Liga-se a origem após DnaA Utiliza ATP Preparo para entrada do P

21 Replicação em Procarioto Proteínas e genes envolvidos no início da replicação de E. coli Proteína Gene Função DnaA dnaa Reconhecimento de oric DnaB dnab Helicase Ligação na região aberta de 13pb DnaC dnac Formação do complexo pré-priming DnaG dnag Primase Sintetiza e posiciona o primer Girase gyr Remoção de supertorções positivas SSB ssb Estabiliza DNA de fita simples HU hup Estabilização da curvatura do DNA

22 Mecanismos de Replicação Replicação Semiconservativa Replicação Conservativa Replicação Dispersiva

23 Mecanismos de Replicação SEMICONSERVATIVO as 2 fitas do DNA parental são copiadas, originando moléculas filhas com apenas uma das fitas novas sintetizadas.

24 Mecanismos de Replicação 1958: Matthew Meselson e Franklin W. Stahl Marcação do DNA de E. coli 15 N Centrifugação de equilíbrio em gradiente de densidade (Cloreto de Césio)

25

26 Mecanismos Básicos

27 Mecanismos de Replicação Início da replicação pode ser ativada mais de uma vez em procariotos, mas somente uma vez em células eucarióticas (OriC). Movimento da forquilha de replicação unidirecional (parte da origem e segue replicando o DNA em uma só direção) ou bidirecional (2 forquilhas deixam a origem em direções opostas). Direção da replicação sempre no sentido 5 3. Semi-descontinuidade da replicação a replicação ocorre de forma contínua numa das fitas do DNA e descontínua na outra.

28 Procarioto Eucarioto Mecanismos da Replicação Início da Replicação

29 Mecanismos da Replicação Movimento da Forquilha

30 Mecanismos da Replicação Direção da Replicação

31 Mecanismos da Replicação Semidescontinuidade da Replicação

32 DNA Polimerases enzimas que fazem a síntese de uma nova fita de DNA. possuem a capacidade de adicionar nucleotídeos na extremidade 3 OH de uma região pareada do DNA (crescimento da cadeia no sentido 5 3 ). DNA-polimerase I (pol I) primeira polimerase caracterizada (1956) por Arthur Kornberg. Funções 928 aminoácidos 3 Domínios Replicação Reparo de erro Remoção de P

33 DNA Polimerase I (PROCARIOTO) NH 2 COOH Atividade de Polimerase AA : Polimerizar Atividade de Exonuclease 3 5 AA : Remove 1 nt 1956: Arthur Kornberg Atividade de Exonuclease 5 3 AA 1 324: Remove ~ 10 nt

34 DNA Polimerase I (PROCARIOTO) a atividade de exonuclease 3 5 apresenta-se extremamente importante para que o processo de replicação ocorra livre de erro. reconhecimento e clivagem de pareamentos errôneos na extremidade 3 OH da fita nascente (correção de erro), eliminando apenas o último nucleotídeo adicionado pela polimerase. a atividade de exonuclease 5 3 remove blocos de nucleotídeos (10 nt) na ocorrência de quebras da ligação fosfodiéster (nick) ou falta de alguns nucleotídeos (gap).

35 DNA Polimerase III (PROCARIOTO) Holoenzima enzima composta por vários grupos polipeptídicos (20 ou +), fundamental no processo replicativo do cromossomo de E. coli. Exonuclease 3 5 Polimerização Processividade Formação do dímero Estabilização Síntese dos Fragmentos de Okazaki

36 DNA-Polimerase de EUCARIOTO Polimerases Localização N N N N M Função: Primase X Exo 3 5 X X X Replicação X X? X Reparo? X X Processividade Baixa Alta Alta Baixa Alta Fidelidade Alta Alta Alta Baixa Alta

37 Forquilha de Replicação Durante o processo de replicação do DNA, 2 fatores devem ser considerados: as fitas do DNA têm polaridades opostas a DNA-polimerase sintetiza somente no sentido 5 3. # Dessa forma, uma das fitas pode ser sintetizada de forma contínua, enquanto a outra só pode ser sintetizada de forma descontínua. Fita contínua 1 primer Fita descontínua vários primers (fragmentos de Okazaki)

38 Enzimas Envolvidas Na Replicação Topoisomerases promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ou removendo super-enrolamentos. A enzima permanece ligada covalentemente ao DNA e permite que as fitas passem umas sobre as outras. Estas enzimas mostram-se presentes tanto em células procarióticas como eucarióticas. Helicases promovem a quebra das pontes de hidrogênio entre as bases, separando as 2 fitas de DNA. Essencial para que a forquilha de replicação possa se movimentar.

39 Enzimas Envolvidas da Replicação SSBs proteínas que se ligam à fita simples do DNA. Evitam a formação de super-torções induzindo uma conformação do DNA ideal para a replicação e pareamento de bases (além de proteger a fita simples da degradação por nucleases). Primases promovem a síntese de pequenas seqüências de RNA (primers). Para cada início de síntese de uma das fitas de DNA faz-se necessária a presença de um primer. Encontra-se, normalmente, associada à DNaB e outras proteínas (primossomo). Ligases catalisam a formação das ligações fosfodiéster dos fragmentos de Okazaki.

40 Enzimas da Replicação 1. Topoisomerases 2. Helicases 3. SSBs 4. Primase 5. DNA-Polimerase 6. DNA-Ligase

41 Topoisomerase

42 Helicase

43 DNA-Polimerase

44 Replicação: Visão Geral

45 Término da Replicação PROCARIOTO Em E. coli, podem existir 2 forquilhas de replicação que, durante o movimento bidirecional, encontram-se na região terminal Ter (180 a partir de oric) T1 e T2 regiões de terminação (específicas para a direção do movimento da forquilha). # Bidirecional cada forquilha deve passar pela outra para finalizar a replicação. # Unidirecional a forquilha deve retornar à origem de replicação. genomas circulares não oferecem problemas de replicação.

46 Término da Replicação PROCARIOTO T2 180 o 100pb T1

47 Término da Replicação EUCARIOTO Telômeros regiões terminais dos cromossomos de eucariotos formadas por seqüências bastante conservadas e repetidas. # Telomerase enzima responsável pela adição destas seqüências repetidas (RNApolimerase) nos locais onde ocorreu a retirada dos primers. reconhecimento e ligação ao telômero adição de nucleotídeos conforme o molde de RNA da enzima A perda de sua função leva à morte celular.

48 Término da Replicação Genomas Lineares Telômeros

49 Término da Replicação Genomas Lineares: Telomerase

50 Término da Replicação Genomas Lineares: Telomerase

51 Transposons Década de 40: Barbara McClintock Descoberta dos Elementos Genéticos Móveis em Milho Elementos Controladores 1983: Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina

52 Transposons Elementos de Transposição Procariotos e Eucariotos Fonte de variabilidade genética Ocorrem via DNA ou RNA Mutações: Gênicas ou Estruturais 2 a 20% do genoma dos seres vivos 700 a pb

53 Transposons Alteração da Expressão Gênica Inserção Tn Excisão Tn

54 Transposons via DNA 1. IS: Seqüências de Inseção 2. Tn: Transposons

55 Transposons via DNA Transposon Simples IS1 Transposase Repetição Terminal Invertida Repetição Terminal Invertida Transposon Composto Tn1681 IS1 Enterotoxina IS1 Transposon Complexo Tn3 Repetição Terminal Invertida Transposase Resolvase amp Repetição Terminal Invertida

56 Transposons via RNA Retrotransposons (similares a retrovírus)

57 Mecanismos de Transposição Clivagem não-alinhadas são efetuadas no sítio alvo O transposon é unido às extremidades de fitas simples As lacunas no sítio-alvo são preenchidas e seladas

58 Mecanismos de Transposição Replicativa Não-Replicativa Conservativa

59 Considerações Finais A Replicação é a duplicação total do genoma. Antecede as divisões celulares Mitose e Meiose. Mitose manutenção de células somáticas. Meiose gera gametas (células germinativas). Máxima fidelidade evitar alterações (Mutações).

60 Considerações Finais Enzimas envolvidas topoisomerase, helicase, SSB, primase, DNA-polimerase e DNA-ligase. Término da replicação perda dos telômeros. Telômeros senescência e câncer. Transposon mecanismo de variabilidade.