Introdução à Biologia Molecular. Prof. Leonardo Crema

Transcrição

1 Introdução à Biologia Molecular Prof. Leonardo Crema

2 HISTÓRICO GREGOR MENDEL Estudou cruzamento entre diferentes tipos de ervilhas demonstrando que certas características físicas dessas plantas eram transmitidas de geração para geração através de fatores.

3 HISTÓRICO 1902 SUTTON e BOVERI Padrão de herança dos fatores acompanhava a segregação dos cromossomos de células em divisão 1909 JOHANNSEN Nomeou as unidades mendelianas da hereditariedade fatores de GENES

4 HISTÓRICO 1915 THOMAS MORGAN Concluiu que os genes estavam organizados de maneira linear nos cromossomos Propôs, pela 1ª vez, uma correlação entre um gene = genótipo e uma característica física = fenótipo

5 HISTÓRICO 1941 BEADLE e TATUM Demonstraram que os genes agiam através da regulação de diferentes eventos químicos HIPÓTESE: UM GENE UMA ENZIMA

6 HISTÓRICO 1952 Hershey Chase Demonstraram que é o ADN a base do material genético (e não as proteínas) Hershey, A. D., i Chase, M. (1952) Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. J Gen Physiol. 36:39-56

7 HISTÓRICO 1953 JAMES WATSON e FRANCIS CRICK Descrição da estrutura física do DNA baseando-se nos estudos de difração de raio X de Rosalind Franklin e Maurice Wilkins e em estudos químicos da molécula Modelo da dupla fita proposto foi fundamental para a compreensão do mecanismo de transmissão e execução da informação genética

8 1953: Watson and Crick Estrutura do DNA

9 HISTÓRICO 1955 JOE HIN TJIO Definiu como 46 o número exato de cromossomos humanos ARTHUR KORNBERG Isolou a enzima DNA polimerase da bactéria E. coli

10 HISTÓRICO 1957 CRICK e GAMOV Dogma Central da Biologia Molecular DNA RNA PROTEÍNA

11 1961 BRENNER, JACOB e MESELSON mrna é a molécula que leva informação do DNA no núcleo para a maquinaria de produção de proteínas no citoplasma

12 Dogma Central da Biologia Molecular

13 NOS SERES HUMANOS NÚCLEO DNA CÉLULA CROMOSSOMOS (DNA+PROTEÍNAS) - Informação das proteínas e RNAs que serão sintetizadas pelas células do organismo ao longo da sua vida. -Capacidade de se autoduplicar para originar outras células. ORGANISMO

14 O CÓDIGO GENÉTICO É DESVENDADO!!! 1966 NIRENBERG, KHORANA e OCHOA Sequências sucessivas de três nucleotídeos do DNA (códon) determinam a sequência de aminoácidos de uma proteína

15 A CÉLULA NÚCLEO DNA mrna 3. Regulação no transporte do mrna para o citoplasma 1. Regulação transcricional 2. Regulação no processamento do RNA primário RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO RUGOSO - DIFERENCIAÇÃO - CRESCIMENTO - FUNÇÃO CELULAR - RESPOSTA AO AMBIENTE 4. Regulação da síntese proteíca 5. Regulação pós-síntese Proteína sintetizada

16 Cromossoma Núcleo DNA Gene Promotor Exon Intron

17 DNA

18 ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA) Contém toda a informação genética de um organismo Esta informação está arranjada em unidades hoje conhecidas como genes

19 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS As moléculas de DNA e RNA são compostas por quatro diferentes nucleotídeos: Adenina, Guanina e Citosina comum para DNA e RNA Timina encontrada somente no DNA Uracila encontrada somente no RNA

20 Todos os nucleotídeos apresentam uma estrutura em comum: ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

21 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS 2 tipos de bases nitrogenadas.

22 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS O grupo hidroxil ligado ao carbono 3 da pentose de um nucleotídeo forma uma ligação fosfodiéster com o fosfato do outro nucleotídeo

23 DNA Duas fitas de polinucleotídeos associadas formando uma estrutura de dupla hélice onde as pentoses e os radicais fosfato compõe a fita e as bases projetam-se para o interior da mesma As fitas mantêm-se unidas através da formação de pontes de hidrogênio entre as bases, o que contribui para a estabilidade da dupla hélice. Adenina (A) pareia com Timina (T) através de 2 pontes de hidrogênio. Guanina (G) pareia com Citosina (C) através de 3 pontes de hidrogênio

24 DNA

25 Antiparalelismo As fitas do DNA estão dispostas em direções opostas

26 Complementariedade Cada base de uma fita é pareada com a base complementar da outra fita

27 Complementariedade Fita velha Durante a replicação do DNA as duas fitas velhas ou mães servem de molde para cada fita nova ou filha complementar, que está sendo sintetizada. Fita nova

28 A Dupla Hélice Fatores que estabilizam a dupla hélice: interações hidrofóbicas forças de van der Walls pontes de hidrogênio interações iônicas Entre as bases nitrogenadas Entre os grupos fosfato do DNA e os cátions (Mg 2+ ) presentes na solução fisiológica

29 A Dupla Hélice A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos quais se ligam as proteínas da cromatina Sulco menor Sulco maior

30 Proteínas:níveis de complexidade estrutural

31 O Empacotamento do DNA: a estrutura terciária do DNA DNA em procariontes: DNA circular nas formas não-superhelicoidal (esquerda) e super-helicoidal (direita)

32 A Dupla Hélice A forma predominante de torção da espiral do DNA é para a direita ou sentido horário

33 Propriedades Químicas e Físicas do DNA

34 REPLICAÇÃO DO DNA Conservativa ou Semiconservativa? Unidirecional ou Bidirecional?

35 REPLICAÇÃO SEMICONSERVATIVA Evidência baseada em um experimento clássico de Meselson-Stahl em 1958 Células de E. coli foram inicialmente colocadas em um meio para crescimento contendo sais de amônia preparados com 15 N (nitrogênio pesado heavy ) até todo o DNA celular conter o isótopo. As células foram, então, transferidas para um meio contendo 14 N (nitrogênio leve light ). As amostras foram analisadas com gradiente de densidade que separa as duplas H-H, L-L e H-L em bandas distintas.

36 A replicação é semi-conservativa The Meselson-Stahl experiment

37 ORIGEM DA REPLICAÇÃO Experimento com SV40 (Simian Virus) DNA viral de células infectadas com SV40 foi cortado com a enzima de restrição EcoRI, que reconhece um sítio único. A partir de um ponto vai se formando uma bolha chamada bolha de replicação comprovando a existência de um ponto de origem da replicação Características da origem de replicação:. estrutura repetitiva. seqüências ricas em AT

38 ORIGEM DA REPLICAÇÃO ORIGEM Sítio de restrição EcoRI Cromossomo viral circular EcoRI Bolha de replicação

39 ORIGEM DA REPLICAÇÃO

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41 Biologia Campbell & Cols. Procariontes vs Eucariontes

42 Síntese de DNA em Eucariontes: As Bolhas de Replicação Nos eucariontes, a replicação requer múltiplas origens, devido ao tamanho de seu genoma. A replicação é bidirecional e, em ambas as fitas, simultânea. Este processo gera bolhas de replicação.

43 Regiões Codificadoras e Não-Codificadoras do DNA O DNA é formado por 2 regiões: Intergênicas Gênicas Intergênicas Gênicas Região Gênica É a porção que codifica para um produto final, que pode ser uma cadeia polipeptídica ou um RNA Região Intergênica É a porção regulatória, que sinaliza o início ou o final de um gene, que influencia a transcrição gênica, ou que é o ponto de início para a replicação do DNA

44 PROCESSO DE REPLICAÇÃO Os mecanismos celulares responsáveis pela replicação do DNA foram descobertos primeiramente em bactérias. A replicação em eucariotos ocorre através de proteínas análogas e com processos semelhantes à replicação do DNA de E. coli

45 PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS (SISTEMA DE REPLICAÇÃO DO DNA) 1. DNA Polimerases 2. Endonucleases 3. Helicases 4. Topoisomerases 5. Primases 6. Telomerases

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47 DNA POLIMERASE São incapazes de quebrar as pontes de hidrogênio que ligam as duas fitas do DNA Só alongam uma fita de DNA/RNA pré-existente Catalisam a adição de um nucleotídeo no radical hidroxil da extremidade 3 da cadeia que está se formando. Desta forma, as fitas só podem crescer no sentido 5 3

48 Biologia Campbell & Cols.

49 DNA Polimerases principais enzimas envolvidas no processo; responsáveis pela adição de nucleotídeos e reparo requerem um modelo e um primer (segmento de RNA sintetizado pela primase) complementares para início alongamento 3 tipos principais : I, II e III; existem pelo menos 11 I : importante no sistema de reparo III: principal e mais complexa (mais de 10 subunidades)

50 Adição de nucleotídeos 1 2 3

51 FORQUILHA DE REPLICAÇÃO Fita contínua leading

52 FORQUILHA DE REPLICAÇÃO Fita descontínua I Lagging

53 FORQUILHA DE REPLICAÇÃO Fita descontínua II Lagging

54 OUTRAS ENZIMAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE REPLICAÇÃO HELICASES constituem uma classe de enzimas que podem se mover ao longo da fita dupla de DNA utilizando a energia da hidrólise de ATP para separar as duas fitas da molécula. SSB ( single-strand-binding - proteínas de ligação à fita simples) ligam-se a cada uma das fitas impedindo o reanelamento das mesmas. PRIMASE RNA polimerase que sintetiza pequenas moléculas de RNA utilizadas como iniciadores durante o processo de replicação do DNA. TOPOISOMERASES Responsáveis por aliviar a torção na parte da fita que não está sendo replicada.

55 PROCESSO DE REPLICAÇÃO O movimento da forquilha de replicação revela uma fita molde no sentido 3 5 e outra no sentido oposto 5 3 Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidos opostos FITA LEADING crescimento segue a direção do movimento da forquilha de replicação FITA LAGGING crescimento no sentido oposto ao movimento da forquilha de replicação

56 PROCESSO DE REPLICAÇÃO FITA LEADING sintetizada continuadamente a partir de um iniciador na fita molde 3 5 FITA LAGGING sintetizada descontinuadamente a partir de múltiplos iniciadores Sítios descobertos no molde da fita lagging são copiados em pequenos iniciadores de RNA pela primase. Cada iniciador é alongado pela DNA polimerase resultando na formação dos FRAGMENTOS DE OKAZAKI. DNA polimerasei remove o primer do RNA do fragmento adjacente e preenche os gaps entre os fragmentos que, então, são unidos pela DNA ligase.

57 PROCESSO DE REPLICAÇÃO

58 PROCESSO DE REPLICAÇÃO A síntese de DNA é feita na direção 5 3 e é semidescontínua

59 ENCURTAMENTO DAS EXTREMIDADES DE MOLÉCULAS LINEARES DE DNA

60 ENCURTAMENTO DAS EXTREMIDADES DE MOLÉCULAS LINEARES DE DNA

61 TELOMERASE Os cromossomos de eucariotos são lineares e apresentam seqüências repetitivas em suas extremidades denominadas telômeros A síntese da fita leading continua até o término da fita molde de DNA, no entanto, no telômero a extremidade feita pela primase na fita lagging não é digerida. Como o iniciador é instável, ele se degrada com o tempo diminuindo, assim, o tamanho do cromossomo. Telomerase age evitando a perda do fim do cromossomo.

62 TELOMERASE

63 REGULAÇÃO -única fase regulada da replicação, de forma que só ocorra uma vez por ciclo celular ; -afetada pela metilação de DNA -DAM metilase na (5 ) GATC sobre a fita parental

64 RNA polimerase Núcleo Gene Citoplasma Transcrição Processamento Tradução hnrna mrna proteína

65 O RNA ou ARN O Ácido Ribonucléico é um polinucleotídeo que difere do DNA em três aspectos básicos: DN A A-T T-A G-C C-G RN A A-U U-A G-C C-G O açúcar é uma Ribose; É formado, geralmente, por uma fita simples que pode enrolar-se; Não existe a base pirimídica Timina e no seu lugar se encontra a base Uracila. Os pareamentos seguem a ordem A-U e G-C).

66 RNA - É o ácido ribonucléico; possui a função de síntese protéica. O RNA é encontrado no núcleo principalmente no nucléolo, e no citoplasma (ribossomos). Composição química - é formada por ácido fosfórico, pentose (ribose) e pelas bases nitrogenadas ( A, G, C e uracila (U )). A molécula de DNA é responsável pela formação do RNA. O RNA apresenta-se constituído por um único filamento de nucleotídeo, cuja seqüência de bases é determinada a partir de um molde de DNA.

67 Tipos de RNA 1-RNA mensageiro (RNAm) - É formando no núcleo tendo como molde uma das fitas de uma molécula de DNA. A produção de um RNAm, cujas bases são complementares as bases de uma das hélices de uma molécula de DNA, recebe o nome de transcrição. Este fenômeno pode ser definido de forma mais simples como sendo a passagem das bases de uma linguagem do DNA para a linguagem de RNAm. EX: T - A - C - T - G - A - DNA 3 bases correspondem a um aa, e um!!!!!! conjunto de bases uma proteína. A - U - G - A - C - U RNAm Códon início códon proteína aa A aa B

68 Síntese Protéica A Transcrição A enzima RNA-polimerase abre a dupla hélice do DNA e inicia a produção de uma molécula de RNAm, no sentido 5 3. Os nucleotídeos são ligados respeitando a ordem A-U, G-C. Ao final da transcrição a RNApolimerase se desliga do DNA, a molécula de RNAm está formada e segue para o citoplasma onde será traduzida.

69 Observe a complementação de uma fita de DNA para RNA DNA A T A C A T G G G C T A G A A RNA U A U G UA C C C G A U C U U RNAm Sempre com a adenina se ligando a uracila e a guanina se ligando a citosina.

70 2-RNA transportador (RNAt) - é produzido nos cromossomos a partir de DNA especiais. É uma molécula cadeia curta, (é o menor RNA) que transporta os aa que estão dispersos no citoplasma até os ribossomos. O RNAt tem formato de folhas de trevo e contém outros tipos de bases, além das comumente encontradas nos outros RNAs. Cada RNAt é capaz de reconhecer um determinado aa determinado códon, no RNAm. Todo RNAt tem um filamento livre de sua molécula composta pela seguinte seqüência de bases: ACC. É nesse local que ocorre a associação com o aa. Em cada região da molécula existe uma seqüência de 3 bases denominadas anticódon, que reconhece a posição do aa no RNAm.

71 Tipos RNAs (2/2)

72 RNA TRANSPORTADOR

73 3-RNA ribossômico (RNAr) é o RNA que ocorre em maior quantidade nas células. Esse RNA é encontrado no nucléolo, onde é produzido, e no citoplasma, associado às proteínas, formando os ribossomos.

74 Tipos de RNA RNAm O RNA mensageiro é formado no núcleo e contém a mensagem - o código transcrito a partir do DNA - para a síntese das proteínas. Cada conjunto de três nucleotídeos no RNAm é chamado de CÓDON. RNAt O RNA transportador está presente no citoplasma e é responsável pelo transporte dos aminoácidos até os ribossomos para a síntese protéica. No RNAt existe uma seqüência de nucleotídeos correspondente ao códon chamada de ANTI-CÓDON. RNAr O RNA ribossômico ou ribossomal faz parte da estrutura dos ribossomos e participa do processo de tradução dos códons para construção das proteínas.

75 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: A síntese começa quando ocorre a transcrição das bases de DNA para RNA. Essa transcrição é o código genético. O RNAm formado no núcleo passa para o citoplasma, deslocando-se para os ribossomos. Os RNAt que estão no citoplasma, através de suas moléculas, unem-se ao aa livre levando até o ribossomo. Lá o anticódon do RNAt reconhece no códon do RNAm o aa, que será codificado. Assim, ocorrendo sucessivamente, até dar origem a uma proteína. Núcleo DNA Núcleo RNAm RNAm Transcrição Proteínas Tradução DNA-RNAm A síntese completa de uma proteína leva de 20 a 60 seg, e o mesmo RNAm pode ser traduzido por vários ribossomos, que mantêm uma Distância entre si de aproximadamente 80 nucleotídeos.

76 Os Íntrons e os Éxons Nos eucariontes, o RNA transcrito pelo gene é normalmente chamado de pré- RNA, no sentido de que ele ainda não está pronto para ser traduzido, produzindo proteínas. O pré-rna seria, assim uma versão ainda não acabada do RNAm, que precisa ser primeiro processado no núcleo para, em seguida, migrar ao citoplasma. A Éxon Íntron Éxon Íntron Íntron Éxon Os Íntrons são retirados e os éxons são soldados um ao outro

77 Síntese Protéica A Tradução O RNAm transcrito no núcleo chega ao citoplasma e se liga a um ou mais ribossomos. O ribossomo lê o primeiro códon e um RNAt com o anticódon correspondente transporta um aminoácido e se liga ao códon. O ribossomo se desloca, no sentido 5 3 e lê o próximo códon. Os aminoácidos são unidos por ligações peptídicas. Ao final da tradução o polipeptídeo se desliga e se constituí na proteína.

78 O ribossomo acomoda dois trnas carregados

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80 4. Terminação

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82 Dogma Central da Biologia Molecular Foi estabelecido em 1956 por Francis Crick. Postulava que o sentido da construção das moléculas é sempre de DNA à Proteína fluxo unidirecional da informação. O DNA é o molde para formar DNA (replicação) e RNA (transcrição). Este por sua vez é o molde para formação das proteínas (tradução). Hoje se sabe que, em alguns vírus, o RNA pode replicar-se e, em outros, o RNA pode produzir DNA (transcrição reversa) utilizando o maquinário genético da célula-hospedeira. Porém, não é possível se sintetizar ácidos nucléicos a partir de proteínas. Os novos conhecimentos permitiram que se ampliasse o dogma central sem contudo perder a unidirecionalidade, ou seja, de ácido nucléico à proteína. Projeto Proteômico.

83 Diferenças entre RNA e DNA O RNA é uma molécula intermediária na síntese de proteínas, ela faz a intermediação entre o DNA e as proteínas. DNA RNA Ele é formado por uma cadeia de ribonucleotídeos, que, por sua vez, são formados por um grupo fosfato, um açucar (ribose), e uma base nitrogenada (veja abaixo). As principais diferenças entre o RNA e o DNA são sutis, mas fazem com que o último seja mais estável do que o primeiro. O RNA é formado por uma fita simples, o açúcar de seu esqueleto é a ribose e uma de suas bases pirimídicas (de anel simples) é diferente da do DNA (uracila ao invés de timina), além disso o açucar do RNA é a ribose invés da desoxirribose do DNA.

84 DNA e RNA Os processos de síntese de proteínas na célula são controlados pelo metabolismo de controle.as duas principais personagens do metabolismo de controle são as moléculas de DNA e RNA. O DNA (ácido desoxirribonucléico) é o patrimônio genético, que contém as instruções para a síntese de todas as proteínas que a célula é capaz de realizar. O RNA atua como mensageiro (RNA mensageiro) entre o DNA e o ribossomo, local de síntese de proteínas. DNA (ácido desoxirribonucléico) RNA (ácido ribonucléico) Se localiza somente no núcleo Se localiza no núcleo e no citoplasma Apresenta forma de dupla hélice com duas fitas Apresenta apenas uma fita É formado com a pentose (açúcar) desoxirribose É formado com a pentose ribose Bases nitrogenadas participantes: A, T, C, G Bases nitrogenadas participantes: A, U, C, G

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86 Código Genético Codon que dá origem à síntese de qualquer proteína Genoma Conjunto de moléculas de DNA Código Genético correspondência entre cada tripleto (codon) de RNA e cada um dos 20 aminoácidos habituais das proteínas (desde 1964) No código genético há 64 trincas possíveis, apenas 61 delas correspondem a aminoácidos. As tres trincas restantes são usadas como pontuação; elas dizem à célula o ponto em que termina a codificação de cada proteína.

87 Disciplina de Biologia Molecular (60 h) Prof. Leonardo Crema

88 Ementa EMENTA: 1) Mecanismos moleculares da replicação do DNA, transcrição e tradução gênica. Características do código genético. Tipos de mutações. Polimorfismos. Organização do genoma. Técnicas de biologia molecular. Bioinformática. Genética forense. Clonagem. Transgenia. Tipos de células tronco. Prática Profissional Integrada.

89 Bibliografia Básica ALBERTS, B.; et al. Biologia molecular da célula. 5 ed. Porto Alegre: Artmed GRIFFITHS, A. J. F.; et al. Introdução à genética. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan SNUSTAD, P. & SIMMONS, M. J. Fundamentos de Genética. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.

90 Bibliografia Básica ALBERTS, B.; ANDRADE, A. E. Fundamentos da biologia celular. 3 ed. Porto Alegre: Artmed, COOPER, G. M.; HAUSMAN, R. E. A célula: uma abordagem molecular. 3 ed. Porto Alegre: Artmed JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 8 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 332 p RAVEN, P. H.; EVERT, R. F. Biologia Vegetal. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, SADAVA, D.; HELLER, C.; ORIANS, G.H.; PURVES, W.K.; HILLIS, D.M. Vida: A Ciência da Biologia - Célula e Hereditariedade. V. 1, 8 ed. Porto Alegre: Artmed