Princípios Básicos de Genética Molecular

Transcrição

1 Princípios Básicos de Genética Molecular Profª Ana Claudia 17/11/2017 Fluxo da informação genética 1

2 Estrutura do Material Genético Replicação do DNA Transcrição Tradução Regulação da Expressão Gênica Nucleotídeos Base purina ou pirimidina Fosfato Ribose Ribonucleotídeo RNA Base purina ou pirimidina Fosfato Desoxirribose Desoxirribonucleotídeo DNA 2

3 Nucleotídeos Bases Nitrogenadas RNA DNA Purinas Pirimidinas Nucleotídeos Desoxirribonucleotídeos Ribonucleotídeos 3

4 Cadeia de Nucleotídeos Ligação fosfodiéster Polaridade oposta da dupla fita Pontes de Hidrogênio A=T C G 4

5 Estrutura de dupla hélice do DNA Watson e Crick modelo da dupla hélice Pares de bases empilhadas Esqueleto açúcar-fosfato Hidrogênio Oxigênio Carbono e nitrogênio em pares de bases Sulco menor Carbono Fósforo Pares de bases empilhadas Sulco maior 5

6 Estrutura de Genomas O Genoma compreende todo o material genético que um organismo possui Procariotos: tipicamente um único cromossomo circular Eucariotos: conjunto de cromossomos nucleares genoma mitocondrial genoma do cloroplato (em plantas) Genomas Virais Características de alguns genomas virais Tamanho: mil pares de bases DNA (dupla fita ou simples fita) ou RNA Número de genes: 3 a >190 6

7 Genomas Procarióticos O cromossomo bacteriano tem alguns milhões de pares de bases Algumas bactérias apresentam pequenas moléculas independentes de DNA Plasmídeos Sequências codificadoras correspondem a maior parte do genoma Genomas Bacterianos Genoma de Escherichia coli kilobases Genoma de Mycobacterium genitalium 580 kilobases Genoma de Bradyrhizobium japonicum kilobases 7

8 Genomas Bacterianos Genoma de Escherichia coli estirpe K12 MG pb genes cerca de 80% do genoma Genes/kbp = 0,894 Sequências codificadoras correspondem a maior parte do genoma Genomas Bacterianos PLASMÍDEOS: Estrutura não essencial pode conferir vantagens seletivas. Ex.: resistência a agentes antimicrobianos Tamanho variável (~1 a 200 kb) No variável em uma mesma bactéria Importantes ferramentas em Engenharia Genética 8

9 Genomas Eucarióticos Predicted number of genes Common name Genome size (base pairs) Plasmodium falciparum malaria protozoan 22,820,308 5,317 Saccharomyces cerevisae baker s yeast 12,057,909 6,268 Caenorhabditis elegans roundworm 100,291,841 20,516 Apis mellifera honeybee 197,657,892 29,832 Drosophila melanogaster fruit fly 131,000,899 13,792 Arabidopsis thaliana mouse ear cress 116,566,763 25,706 Canis familiaris dog 2,359,826,366 18,201 Homo sapiens human 2,851,330,913 22,287 Mus musculus mouse 2,932,368,526 25,396 Pan troglodytes chimpanzee 2,733,948,177 22,524 Species ~ genes ~1-2% 18 9

10 Genomas Eucarióticos - A maioria é diplóide (alguns poliplóides) - Cromatina: DNA, proteínas e RNA -Proteínas: Histonas (básicas) muito conservadas H1, H2a, H2b, H3, H4 não-histonas (ácidas) composição variada Eucromatina Cromatina ativa, pouco condensada: regiões do genoma suscetíveis à transcrição Heterocromatina Cromatina altamente condensada ao longo de todo o ciclo celular Nucleossomo (1º nível de compactação) Octâmero de histonas Núcleo de histonas DNA ligador: 8 a 114 pb 10

11 Fibra de cromatina (2º nível de compactação) Fibra de cromatina (aproximadamente 30 nm de diâmetro) Fibra de nucleossomo (aproximadamente 10 nm de diâmetro) DNA ligador Octâmero de histonas Cromossomo metafásico (3º nível de compactação) Representação esquemática do DNA cromossômico preso a um arcabouço (scaffold) nuclear. Cada dobra representa mais uma compactação. 11

12 Condensação das fibras de cromatina no cromossomo metafásico Arcabouço formado por proteínas cromossômicas Não-histonas Duas cromátides (10 espiras cada) Uma espira (30 rosetas) Uma roseta (6 alças) Uma alça ( pb) Fibra de 30 nm Fibra de 10 nm DNA Centrômeros e Telômeros telômeros Centrômero 12

13 Centrômeros Separação de cromossomos homólogos (anáfase I da meiose) Separação de cromátides (anáfase II da meiose e anáfase da mitose) Regiões ligadas pelas fibras do fuso Centrômeros Cromátides Cinetocoros irmãos Microtúbulos do fuso externa média interna Camadas do Cinetocoro Centrômero 13

14 Telômeros Impedem a degradação das pontas dos cromossomos por DNAses Evitam a fusão das pontas de um cromossomo com outro Facilitam a replicação das pontas do DNA Composição: - Sequências curtas de nucleotídeos repetidas: (TTAGGG altamente conservada em vertebrados) - Região unifilamentar rica em G Estrutura do Material Genético Replicação do DNA Transcrição Tradução Regulação da Expressão Gênica 14

15 Replicação Semiconservativa Pontes de hidrogênio Ligações covalentes Início da deselicoidização Novos filamentos duplos Replicação Semi-descontínua 15

16 Síntese do DNA pelas DNA polimerases Primer ou iniciador Molde Fidelidade da replicação Em E. coli: 1 erro a cada 109 ou 1010 nucleotídeos adicionados cromossomo ~ 4,6 x 106 pb 1 erro a cada a replicações atividade exonuclease 3 5 das DNA polimerases 16

17 Fidelidade da replicação Atividade revisora exonuclease REPLICAÇÃO EM PROCARIOTOS 17

18 DNA polimerases em E. coli DNA polimerase I = Replicação e reparo DNA polimerase II = Reparo DNA polimerase III = REPLICAÇÃO DNA polimerase IV = Reparo DNA polimerase V = Reparo Replicação de DNA em E. coli Replissomo: DNA Polimerase III DNA Polimerase I DNA ligase Primase ou Iniciase DNA girase (topoisomerase II) Proteína DnaB (helicase) SSB (Proteína de ligação ao DNA simples fita) Iniciação Alongamento Terminação 18

19 Iniciação DnaA DnaB DnaC Alongamento 19

20 Alongamento DNA Polimerase Fita Contínua 5 3 Fita Descontínua Primer de RNA no ínicio de um fragmento de Okazaki Terminação Forquilha sentido anti-horário Forquilha sentido horário Cromossomos catenados Cromossomos separados 20

21 REPLICAÇÃO EM EUCARIOTOS Aspectos característicos de eucariotos Várias forquilhas de replicação em um único segmento de DNA Em Saccharomyces cerevisiae: 400 distribuídas pelo genoma Humanos e outros mamíferos: origens de replicação a intervalos de a pb 21

22 DNA polimerases alfa delta épsilon gama beta zeta eta iota kapa θ (teta), λ (lambda), φ (phi), σ (sigma), and μ (mi). DNA polimerases nucleares Pol - atividade de DNA primase Pol - atividade de replicação fita contínua - atividade de reparo Pol - atividade de replicação fita descontínua 22

23 Modelo de replissomo eucariótico DNA polymerase Estrutura do Material Genético Replicação do DNA Transcrição Tradução Regulação da Expressão Gênica 23

24 Dogma Central Procariotos Eucariotos O processo de transcrição Direção da transcrição 24

25 O processo de transcrição Topoisomerases O processo de transcrição 25

26 Transcrição em Procariotos RNA Polimerase 1 erro a cada a nc Core ou núcleo da RNA polimerase Subunidade sigma + Core + sigma = HOLOENZIMA 26

27 A transcrição inicia nos PROMOTORES Iniciação Ligação ao DNA Formação do Complexo Fechado Formação do Complexo Aberto 27

28 Iniciação Início da síntese de RNA Liberação do fator sigma Alongamento Sítio de chegada de ribonucleosídeos trifosfato Cadeia crescente de RNA Sítio de reenovelamento Região da hélice DNA/RNA Sítio de desenovelamento 28

29 Terminação Terminadores do tipo Rho ( ) Dependente Proteína Rho ( ) Terminação Terminadores intrínsecos Cadeia de RNA dobrada 29

30 Terminação Terminadores intrínsecos Transcrição em Eucariotos 30

31 RNA Polimerases RNA Polimerase I RNA Polimerase II RNA Polimerase III Enzima Produtos RNA polimerase I rrnas 18S, 5,8S e 28S RNA polimerase II mrnas e snrnas RNA polimerase III trnas, 5S rrna e snrnas Promotores Promotores da RNA Pol II: elementos conservados curtos Exemplo: gene da timidina quinase de camundongo 31

32 Iniciação Complexo fechado Complexo aberto Iniciação e alongamento Início da síntese de RNA Alongamento F E H 32

33 Terminação Processamento de RNA 33

34 Processamento do mrna eucariótico Adição do capacete 5 A extremidade 5 permanece ligada a RNA pol II Protege o mrna da degradação por ribonucleases Participa da ligação do mrna ao ribossomo para iniciar a tradução 7-metilguanosina Complexo de ligação de CAP 34

35 Adição da cauda Poli (A) no terminal 3 Filamento de 80 a 250 resíduos A Após a clivagem do mrna, a poliadenilato polimerase adiciona adeninas na extremidade 3 Serve como sítio de ligação para proteínas específicas A cauda e as proteínas associadas protegem o mrna da degradação enzimática Processamento de íntrons Ribonucleossomos ou Spliceossomos: formados por ribonucleoproteínas complexos RNA-proteínas 35

36 Mecanismo de processamento acoplado à transcrição Processamento de mrna eucariótico Gene da ovoalbumina 36

37 Processamento alternativo Hormônio Calcitonina CGRP (peptídeo relacionado ao gene da calcitonina) 37