Enzimas de restrição

Transcrição

1 A tecnologia do DNA recombinante e suas aplicações

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3 Enzimas de restrição As enzimas de restrição são proteínas produzidas por bactérias para prevenir ou restringir a invasão de um DNA estranho. Elas atuam como tesouras de DNA, cortando o DNA invasor em diversos fragmentos sem função. As enzimas de restrição reconhecem e cortam posições específicas ao longo da molécula de DNA, nos chamados sítios de restrição.

4 Enzimas de restrição Um sítio de restrição é formado por uma sequência de 4 a 6 pares de bases, chamados de palíndrome (ou sequência palindrômica). O nome da enzimaecori vem da bactéria na qual esta enzima foi descoberta:escherichiacoli cepa RY 12 (EcoR), e o I, porque esta foi a primeira enzima de restrição encontrada neste organismo. Esta enzima cliva cada fita de DNA, no sítio de restrição, entre as bases G e A. Depois que as clivagens são feitas, o DNA permanece unido apenas por pontes de hidrogênio entre as quatro bases do meio. Como as pontes de hidrogênio são ligações fracas, o DNA se separa. 5 GAATTC 3 Sítios de clivagem 3 CTTAAG 5 5 G AATTC 3 DNA clivado 3 CTTAA G 5

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6 Métodos para introdução de DNA exógeno em células - fusão de protoplastos --microinjeção --transformação A fusão de protoplastos é um A fusão de protoplastos é um método especialmente importante para a manipulação genética de células vegetais.

7 Métodos para introdução de DNA exógeno em células

8 Métodos para introdução de DNA exógeno em células Durante o processo de transformação, os genes são transferidos de uma bactéria para outra como DNA `nu` em solução. Uma célula receptora com uma nova combinação de genes é um híbrido ou célula recombinante.

9 Fontes de DNA -bibliotecas de genes contendo cópias naturais de genes -bibliotecas de genes contendo cópias de DNA complementar -síntese artificial de DNA Uma biblioteca de genes é uma coleção de um grande número de fragmentos de DNA oriundos de um genoma.

10 Fontes de DNA As transcriptases reversas lêem uma sequência de RNA e sintetizam uma sequência de DNA complementar. Estas enzimas são produzidas por vírus de RNA que convertem seus genomas de RNA para DNA quando infectam um hospedeiro. Esta técnica é útil para a expressão de genes eucarióticos em procariotos. O RNA mensageiro destes genes sofreu processamento na célula eucariótica, e os íntrons foram retirados, restando apenas as sequências codificantes. A transcriptase reversa pode converter esse mrna em um gene contínuo formado somente de sequências codificantes de protéina.

11 Transgênicos O que são e como podem ser obtidos? Qualquer organismo em que se tenha introduzido uma ou mais seqüências de DNA/RNA (genes), provenientes de uma outra espécie ou uma seqüência modificada de DNA da mesma espécie. Organismos que têm seus genomas normais adicionados de um ou mais genes. Alimentos Geneticamente Modificados São alimentos compostos contendo OGMs ou derivados destes.

12 Transgênicos O que são e como podem ser obtidos? Transgênese ou Transgenia Manipulação genética que consiste na adição de um ou mais genes estrangeiros (animais, vegetais ou microorganismos) ao genoma (conjunto dos genes de uma espécie) de um ser vivo qualquer, animal, vegetal ou microorganismo. Atividade de produção e manipulação de moléculas de DNA/RNA recombinante. Também denominada de Transformação Genética.

13 O gene e seus componentes

14 Melhoramento Tradicional Melhoramento por Transgenia

15 Transgênicos Como podem ser obtidos? O que é preciso para a Transgenia: Gene de interesse econômico localizado e isolado, clonado e seqüenciado Técnica apropriada de transgenia Genes marcadores/seleção: resistência a antibióticos e a herbicidas Técnica de regeneração de uma nova planta a partir da célula e/ou tecido transformado Expressão fenotípica do gene(s) introduzido(s)

16 Formas de Transgenia Transferência Indireta de Genes Intermediada pelas bactérias Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes Transferência Direta de Genes Baseada em métodos físicos/químicos (Eletroporação e Biobalística)

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18 Vetores Plasmídeos Cosmídeos Bacteriófagos Hospedeiros Bactérias / leveduras Utilização clonagem Virus Células eucarióticas Terapia gênica

19 A tecnologia do DNA recombinante

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21 Fragmento 1 Fragmento 2 Fragmento 3 Fragmento 4 Cortar o DNA com enzimas de restrição Inserir fragmentos em vetores Introduzir vetores em bactérias por: eletroporação ou choque térmico

22 Eletroporação Transformação bacteriana

23 Plaqueamento

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