DNA recombinante. Nilce M. Martinez Rossi Depto de Genética

Transcrição

1 DNA recombinante Nilce M. Martinez Rossi Depto de Genética

2 Descobertas marcantes 1962 Arber, Nathans e Smith Enzimas de restrição 1966 Niremberg, Ochoa e Khorana Elucidaram o código genético 1961 Marmur e Doty Renaturação do DNA 1967 Martin Gellert DNA ligase 1972 Boyer, Cohen e Berg Clonagem Molecular

3 Descobertas marcantes Sanger e Gilbert Sequenciamento de DNA 1987 Kary Mullis Reação em cadeia da polimerase (PCR) 1990 Lançamento do Projeto Genoma Humano Conclusão do projeto genoma humano

4 DNA recombinante: é um conjunto de técnicas moleculares Possibilita a combinação de DNA de espécies diferentes (produção de produtos, sequenciamento de DNA) Facilita diagnósticos, investigação de paternidade e a medicina forense. Biotecnologia

5 Como estudar DNA de um organismos complexo como o humano? O DNA é clivado em fragmentos menores através de enzimas de restrição

6 Enzimas de restrição e seus sítios de clivagem

7 Enzima de restrição EcoRI atuando num plasmídio (vetor)

8 Enzima EcoRI atuando no DNA genômico de qualquer espécie Plasmídio quimera ou recombinante

9 ((Human) Biblioteca genômica

10 Eletroforese dos plasmideos contendo os insertos de DNA

11 Biblioteca genômica ou de DNA É o conjunto de bactérias, cada uma com um plasmídeo contendo parte do genoma de um organismo Exemplo: Biblioteca genômica humana

12 Vetores para Clonagem Plasmídios Molecular Bacteriófagos Cosmídios (plasmídio + bacteriófago) Cromossomo artificial de levedura (YAC)

13 Como identificar o clone de interesse numa biblioteca genômica? É necessário fazer uma triagem dos clones usando uma molécula sonda (se pareia com uma sequência alvo).

14 Como obter estas sondas moleculares? Sequência do mesmo gene clonado em outra espécie Síntese de oligonucleotídeo a partir da sequência proteica

15 Obtenção de uma sonda de DNA a partir da sequência proteica

16 Hibridação com sonda molecular Sonda radioativa

17 Qual o destino do DNA clonado? Expressão para fins comerciais: vacinas, hormônios, insulina, etc. Estudo de expressão gênica: em que condições ou tecidos o gene se expressa. Sequenciamento, Projetos genoma. Diagnóstico: comparação com o alelo responsável por uma doença genética.

18 Exemplo de aplicação de DNA recombinante: Insulina: É um hormônio que promove a entrada de glicose nas células. A insulina pode ser extraída do pâncreas do boi ou do porco. Ou uma molécula idêntica a insulina humana pode ser obtida por biotecnologia (DNA recombinante).

19 Síntese de insulina humana por tecnologia do DNA recombinante. Primeira proteina humana sintetizada em bactéria que foi aprovada para uso humano

20 Sequenciamento de DNA

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22 Ligação fosfodiester

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24 SEQUENCIAMENTO DE DNA (Sanger 1977) GAATGCTAATCCG DNA A SER SEQUENCIADO CTTAC PRIMER (Iniciador) DNA pol I datp dttp dctp dgtp ddatp GAATGCTAATCCGT CTTACGATTA GAATGCTAATCCGT CTTACGA

25 DNA pol + A+T+C+G + dda DNA pol + A+T+C+G + ddt DNA pol + A+T+C+G + ddc DNA pol + A+T+C+G + ddg A T C G CACAGTC...

26 Gel de sequenciamento

27 Sequenciamento automático

28 Sequenciamento automático de DNA

29 Reação em cadeia da polimerase PCR

30 PCR: obter várias cópias de um fragmento de DNA de interesse

31 Termociclador: para as reações de PCR

32 Aplicação do PCR para investigação de paternidade

33 Identificação de mutações pontuais através da eliminação/criação de sítios de restrição

34 Genética Médica Thompson & Thompson Capítulo: Ferramentas da Genética Molecular Humana

35 Questões Quais os 2 métodos mais comuns para se obter um fragmento de DNA de interesse em grande quantidade?

36 Faça um esquema de uma eletroforese separando os fragmentos obtidos após digestão do DNA acima com as enzimas PstI e BglII, separadamente e em conjunto. Os fragmentos acima tem a mesma sequência de DNA.

37 A figura ao lado mostra a mutação que ocasiona a anemia falciforme e a consequente perda do sítio de restrição da enzima MstI. Baseado nestas informações como seria interpretado o resultado do gel para cada um dos membros da família? 1,3 1,1