Prof. Dr. Júlio César Borges. Eduardo Nazaré Felipe Gonçalves Renato Capelo

Transcrição

1 Prof. Dr. Júlio César Borges Eduardo Nazaré Felipe Gonçalves Renato Capelo

2 Introdução Método de Sanger Pirosequenciamento Ion Torrent Aplicações

3 Desde a descoberta da dupla fita de DNA surgiram diversas ciências, entre elas a genética e a biologia molecular. Os estudos surgiram com o objetivo de conhecer o funcionamento de uma célula ou organismo, além de conhecer possíveis doenças e tentar encontrar a cura. Para que isso fosse possível foram descobertos várias técnicas, entre elas o sequenciamento do genético, afim de descobrir a sequência das bases nitrogenadas do DNA.

4 O primeiro método de sequenciamento de DNA surgiu em meados dos anos 70 e ficou conhecido como método químico ou Maxam Gilbert, método no qual foi amplamente aplicável na época. Alguns anos depois, em 1977, Frederick Sanger propõe um método diferente e mais eficiente chamado de método enzimático ou de Sanger. Esse método logo se tornou altamente replicável e é utilizado até os dias de hoje.

5 Frederick Sanger nasceu em 1918 e faleceu em 2013 aos 95 anos em Cambridge, onde era pesquisador no laboratório de biologia molecular da Universidade de Cambridge. Ganhador de 2 prêmios Nobel. 1977: Sanger desenvolve seu método de sequenciamento de DNA. A partir daí sequencias com até 96% de similaridade puderam ser diferenciadas.

6 O DNA é formado por duas fitas antiparalelas de nucleotídeos complementares formando uma dupla hélice.

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9 Sanger descobriu que se conseguisse interromper a replicação de um mesmo DNA em pontos diferentes ele poderia juntar essas fitas menores e formar a sequência completa do DNA. O método consiste em adicionar didesoxiribonucleotídeos (ddntp s), que são nucleotídeos modificados que não possuem o grupo OH livre no carbono 3 da pentose. Existem quatro tipos de ddntp s, um para cada base nitrogenada (A,T,G,C).

10 Quando os ddntp s tentam se ligar com a fita de DNA, com a ausência do OH, o próximo nucleotídeo não têm onde se ligar e a replicação para. Assim é possível obter fitas do mesmo DNA com número de resíduos diferentes.

11 A reação é realizada em 4 tubos de ensaio. Cada tudo contêm: DNA; DNA polimerase; Primer; Nucleotídeos; E um tipo de ddntp diferente. Após isso ocorre a replicação em todos os tubos.

12 Dentro de cada tubo a replicação acontece e termina em lugares diferentes. No final do processo temos fragmentos da fita de DNA de diferentes tamanhos. O conteúdo desses tubos é aplicado em gel de poliacrilamida e separado por tamanho (eletroforese). Os fragmentos menores ficaram mais em baixo e os maiores mais em cima. Para obter a sequência do DNA, a leitura é feita de baixo para cima, resultando em fragmentos que se sobrepõem, e formam a fita completa de DNA.

13 Proposto por Mostafa Ronaghi (1996); Instituto Real Tecnológico da Suécia; Pesquisador na Universidade de Stanford; Vice-presidente da Illumina Company; Primeira alternativa ao método de Sanger para sequenciamento do DNA.

14 Detecção através da Luz; Liberação de Pirofosfato na adição de um nucleotídeo; Ação de 4 diferentes enzimas: DNA polimerase; ATP sulfurilase; Luciferase; Apirase; Substratos utilizados: Adenosina 5 fosfossulfato (APS); Luciferina; Resultados obtidos rapidamente.

15 Passo 1 Extração do DNA. Passo 2 Adição do Desoxirribonucleotídeo Trifosfato (dntp); DNA polimerase catalisa a incorporação do dntp na fita; Complementar à fita molde; Liberação de pirofosfato (PPi); Quantidade equivalente à de nucleotídeos incorporados.

16 Passo 3 ATP sulfurilase converte PPi para ATP; Presença de adenosina 5 fosfossulfato (APS); Conversão de luciferina em oxiluciferina (pela luciferase); Luz visível; Proporcional à quantidade de ATP; Detcção é feita por um chip ; Gera um pico na saída de dados do software; Cada pico (sinal de luz) é proporcional ao número de nucleotídeos.

17 Passo 4 Apirase degrada nucleotídeos não incorporados e ATP; Após degradar, mais nucleotídeos são adicionados. Passo 5 Adição de dntp é realizada sequencialmente; Cadeia complementar de DNA é construída; Sequência nucleotídica é determinada a partir dos picos.

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19 Identificação de bactérias; Tipagem fúngica e viral; Detectar mutações; Análises de metilação do DNA; Sequências múltiplas; Verificações de clones; Sequenciamento do genoma humano.

20 Vantagens: Processo automatizado Tempo de análise curta; Resposta instantânea do sequenciamento; Alto rendimento; Preparo rápido da amostra; Desvantagens: Custo elevado; Grande conhecimento de bioinformática; Taxa de erro considerada alta (0,0098)

21 Sequenciamento de DNA da nova geração; Pesquisadores de Connecticut, USA; Pretendem democratizar o sequenciamento Desejam chegar em US$ 1000;

22 Necessidade de remoção do sinalisador

23 Parecido com o pirosequenciamento; Utiliza microchip para deterctar a incorporação do dntp; Chip mede a diferença de ph; Evolução acompanha informática;

24 DNA é fragmentado; Adição de marcadores; Cada fragmento liga-se a um bead ; Beads são posicionados em poços; Ocorre replicação do fragmento; Cobre o bead ;

25 Poços individuais; Banho de dntp; Caso dntp ligue-se, libera H + ; Variação do ph detectada pelo chip;

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27 Análises rápidas ~2h; Elevada sensibilidade; Ideal para DNA pequeno a médio; Baixo custo; Localiza prontamente sítios específicos no DNA; Altamente recomendado para avaliação de fragmentos específicos;

28 Biologia molecular Sequenciamento é utilizado no estudo de genes e quais proteínas codificam; Assim, o que levam trocas nos genes? Biologia evolutiva O sequenciamento do DNA é útil para entender como diferentes organismos estão relacionados; Medicina Pacientes podem saber se apresentam doenças genéticas; Ciência forense Identificação; Teste de paternidade;

29 Obrigado.